CC BY
44
УДК 579.61:579.22
ЖСТРАЖТ«
IB ШО#1
З.Ю. Самойлова, Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН К.В. Безматерных, Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН
A.В. Тюленев, Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН
Е.В. Лепехина, Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермский
национальный исследовательский политехнический университет
М.А. Петерс, Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН
B.Ю. Ушаков, Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермский государственный национальный исследовательский университет
М.Н. Брысова, Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН
Приводятся результаты исследования влияния экстрактов лекарственных растений на образование биофильмов бактериями Escherichia coli BW25113 в присутствии антибиотиков ципрофлоксацина, цефотаксима и стрептомицина, а также на устойчивость бактериальных клеток к указанным антибиотикам в зрелых биофильмах.
Ключевые слова: бактериальные биопленки, антибиотики, полифенолы, экстракты растений, окислительный стресс.
Одним из способов защиты бактериальных клеток от токсического действия антибиотиков является образование биофильмов, представляющих собой прочный механический барьер из полимерного матрикса [1]. С одной стороны, он препятствует прямому контакту клеток с токсичными веществами, в том числе с антибиотиками, с другой - за счет ограничения доступа кислорода и питательных веществ поддерживает клетки в фазе медленного роста или стационарной фазе, когда чувствительность к действию антибиотиков минимальна [2]. В последние годы широко обсуждается гипотеза неспецифического действия бактерицидных антибиотиков на метаболизм, приводящего к избыточному образованию активных форм кислорода и возникновению окис-
лительного стресса в бактериальных клетках [3, 4]. В связи с этим актуальным становится изучение чувствительности бактерий к антибиотикам в присутствии веществ, способных к генерации или связыванию активных форм кислорода.
Среди биологически активных веществ, обладающих редокс-активностью, особый интерес вызывают полифенолы, являющиеся вторичными метаболитами растений. Ранее нами и другими исследователями было показано, что антиокси-дантное действие полифенолов и содержащих их экстрактов растений может быть обусловлено мягким прооксидантным действием, стимулирующим антиокси-дантные системы эукариотических клеток и бактерий и повышающим устойчивость к действию высоких доз оксидантов [5-8].
* Работа выполнена при финансовой поддержке грантом РФФИ № 14-04-96031.
На первом этапе работы основной задачей проекта явилось изучение влияния водных экстрактов 18 лекарственных растений на образование биофильмов бактериями E. coli BW25113 в присутствии антибиотиков ципрофлоксацина, цефотак-сима и стрептомицина.
Бактерии выращивали в лунках полистироловых планшетов, как описано ранее [9], на среде М9 с добавлением глюкозы, казаминовых кислот и тиамина [10], а также экстрактов растений (конечная доза составила 0,83 мг сухого вещества/мл) и антибиотиков (3 мкг/мл ципроф-локсацина, 10 мкг/мл цефотаксима или 30 мкг/мл стрептомицина). Через 22 ч оценивали валовое биопленкообразова-ние (ВБП), используя модифицированный метод окрашивания генцианвиоле-том [11, 12].
В отсутствии антибиотиков экстракты черного чая, Arctostaphylos uva-ursi, Vaccinium vitis-idaea, Tilia cordata, Betula pendula и Zeya mays стимулировали валовое образование биофильмов. Максимальный эффект был отмечен у экстракта
A. uva-ursi, повышавшего ВБП в 3 раза по сравнению с необработанными экстрактами культурами. Из всех испытуемых экстрактов только Urtica dioica оказывал ин-гибирующее влияние на образование биофильмов, снижая ВБП в 1,6 раза по сравнению с необработанными экстрактами культурами.
В отсутствии экстрактов растений антибиотики подавляли ВБП в 6-8 раз по сравнению с необработанными антибиотиком культурами.
В случае ципрофлоксацина повышение ВБП обнаружено в присутствии экстракта Inonotus obliquus в 1,6 раза,
B. pendula - в 1,7 раза, зеленого чая - в 2,9 раза, V. vitis-idaea - в 6,7 раза, в присутствии черного чая по сравнению с культурами, обработанными только антибиотиком, - в 8,5 раза.
При обработке бактериальных культур стрептомицином экстракты зеленого и черного чая, A. uva-ursi, V. vitis-idaea, T. cordata и I. obliquus стимулировали
ВБП в 2 и более раза по сравнению с культурами, обработанными только антибиотиком. Наибольший индуцирующий эффект был отмечен у экстрактов A. uva-ursi и V. vitis-idaea, которые повышали ВБП в 22 и 23 раза соответственно. В тех же условиях экстракты Achillea millefolium, Bidens tripartite, U. dioica, Calendula officinalis и Laminaria japonica подавляли ВБП в 2 и более раза по сравнению с культурами, обработанными только антибиотиком.
Выявлено достоверное повышение ВБП при обработке бактериальных культур цефотаксимом в присутствии экстрактов зеленого и черного чая, A. uva-ursi, V. vitis-idaea, T. cordata, B. pendula и I. obliquus. В тех же условиях экстракты A. millefolium, U. dioica, Еquisetum аrvense и L. japonica оказывали достоверный ин-гибирующий эффект на ВБП при действии цефотаксима.
Таким образом, на данном этапе были выявлены экстракты растений, оказывающие наиболее выраженные модулирующие эффекты на процессы образования биофильмов в присутствии антибиотиков: зеленого и черного чая, A. uva-ursi, V. vitis-idaea, B. pendula и L. japonica.
На следующем этапе выполнения проекта указанные экстракты были использованы для подробного изучения модуляции устойчивости бактерий в зрелых биофильмах к антибиотикам.
Зрелые биопленки получали путем выращивания в течение 22 ч на полистироловых планшетах, как указано ранее [9], затем дважды отмывали физиологическим раствором и переносили на свежую среду, содержащую экстракты растений (0,83 или 6,64 мг сухого вещества/мл), и инкубировали в течение часа. Затем добавляли антибиотики и инкубировали в течение двух часов. Через каждый час оценивали параметры колониеоб-разующей способности и интенсивности биопленкообразования.
В течение всего периода культивирования на свежей среде в отсутствии экстрактов интенсивность биопленкообразо-
вания оставалась приблизительно одинаковой. В отсутствии антибиотиков экстракты черного, зеленого чая, V. vitis-idaea и A. uva-ursi оказывали дозозависи-мый стимулирующий эффект на образование биопленок. Добавление антибиотиков в отсутствии экстрактов растений приводило к снижению интенсивности биопленкообразования. Максимальный подавляющий эффект был отмечен в случае 10 мкг/мл цефотаксима.
В наших условиях обе дозы экстрактов зеленого и черного чая, V. vitis-idaea и A. uva-ursi снижали отрицательный эффект антибиотиков (0,03 и 0,3 мкг/мл ци-профлоксацина, 1 и 10 мкг/мл цефотакси-ма, 10 и 100 мкг/мл стрептомицина) на интенсивность образования биопленок и, напротив, способствовали повышению образования биофильмов. Экстракт L. japonica в присутствии антибиотиков оказывал дополнительное ингибирующее воздействие на интенсивность биоплен-кообразования.
В отдельной серии опытов была изучена колониеобразующая способность клеток в составе зрелых биофильмов при обработке экстрактами и антибиотиками. В ряде случаев в присутствии экстрактов отмечалось модулирующее влияние на устойчивость бактерий к антибиотикам.
Характер модуляции (усиление или ослабление токсического эффекта антибиотиков) варьировался в зависимости от дозы и вида экстракта и антибиотика.
Полученные на данном этапе результаты свидетельствуют, с одной стороны, о положительном влиянии полифенолов на активность Escherichia coli как представителя нормальной микрофлоры человека, когда под действием экстрактов лекарственных растений происходит повышение интенсивности биопленкообразования. С другой стороны, выявленные в ряде случаев защитные эффекты экстрактов от бактерицидного действия антибиотиков указывают на потенциальную опасность снижения терапевтического действия антибиотиков при лечении инфекционных заболеваний, ассоциирующихся с биопленками. Исходя из приведенных выше данных, можно сделать вывод о наличии проблемы возникновения устойчивости микрофлоры к действию антибиотиков в присутствии редокс-активных биосубстратов растительного происхождения. Учитывая, что такие субстраты являются компонентами пищи, дальнейшее продолжение исследований в этой области становится еще более значимым и актуальным. В настоящее время продолжается подробное изучение механизмов наблюдаемых эффектов.
Библиографический список
1. Karatan E., Watnick P. Signals, regulatory networks, and materials that build and break bacterial biofilms // Microbiol. Mol. Biol. Rev. - 2009. - Vol. 73. - P. 310-347.
2. Anderl J.N., Zahller J., Roe F., Stewart P.S. Role of nutrient limitation and stationary-phase existence in Klebsiella pneumoniae biofilm resistance to ampicillin and ciprofloxacin // Antimicrob. Agents Chemother. - 2003. - Vol. 47. - P. 1251-1256.
3. Kohanski M.A., Dwyer D.J., Hayete B., Lawrence C.A., Collins J.J. A common mechanism of cellular death induced by bactericidal antibiotics // Cell. - 2007. - Vol. 130. - Р. 797-810.
4. Dwyer D.J., Belenky P.A., Yang J.H., MacDonaldI.C., Martell J.D., Takahashi N., et al. Antibiotics induce redox-related physiological alterations as part of their lethality // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2014. -Vol. 111. - E2100-E2109.
5. Oktyabrsky O., Vysochina G., Muzyka N., Samoilova Z., Kukushkina T., Smirnova G. Assessment of antioxidant activity of plant extracts using microbial test systems // J. Appl. Microbiol. - 2009. - Vol. 106. -P. 1175-1183.
6. Smirnova G.V., Vysochina G.I., Muzyka N.G., Samoylova Z.Y., Kukushkina T.A., Oktyabrsky O.N. Evaluation of antioxidant properties of medicinal plants using microbial test systems // World J. Microbiol. Biotechnol. - 2010. - Vol. 26. - P. 2269-2276.
7. Smirnova G.V., Samoylova Z.Y., Muzyka N.G., Oktyabrsky O.N. Influence of polyphenols on Escherichia coli resistance to oxidative stress // Free Radic. Biol. Med. - 2009. - Vol. 46. - P. 759-768.
8. Crozier A., Jaganath I.B., Clifford M.N. Dietary phenolics: chemistry, bioavailability and effects on health // Nat. Prod. Rep. - 2009. - Vol. 26. - P. 1001-1043.
9. Samoilova Z., Muzyka N., Lepekhina E., Oktyabrsky O., Smirnova G. Medicinal plant extracts can variously modify biofilm formation in Escherichia coli // Antonie van Leeuwenhoek // Int. J. Gener. Mol. Microbiol. - 2014. - Vol. 105. - P. 709-722.
10. Miller J.H. Experiments in molecular genetics - Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1972.
11. Naves P., del Prado G., Huelves L., Gracia M., Ruiz V., Blanco J., Rodriguez-Cerrato V., Ponte M.C., Soriano F. Measurement of biofilm formation by clinical isolates of Escherichia coli is method-dependent // J. Appl. Microbiol. - 2008. - Vol. 105. - P. 585-590.
12. O 'Toole G.A., Kolter R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signaling pathways: a genetic analysis // Mol. Microbiol. - 1998. - Vol. 28. -P. 449-461.
THE INFLUENCE OF PLANT EXCTRACTS ON ANTIBIOTIC TOLERANCE
IN BACTERIAL BIOFILMS
Z.Yu. Samoilova1, K.V. Bezmaternykh1, A.V. Tyulenev1, E.V. Lepekhina1,2, M.A. Peters1,
V.Yu. Ushakov1,3, M.N. Brysova1
1 Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms UB RAS 2 Perm National Research Polytechnic University 3 Perm State National Research University
The investigation results of the influence of plant extracts on biofilm formation by bacteria Escherichia coli BW25113 under treatment with antibiotics ciprofloxacin, cefotaxime and streptomycin and tolerance of bacterial cells in mature biofilms to these antibiotics are discussed.
Keywords: bacterial biofilms, antibiotics, polyphenols, plant extracts, oxidative stress.
Сведения об авторах
Самойлова Зоя Юрьевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории физиологии и генетики микроорганизмов, Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (ИЭГМ УрО РАН), 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13; e-mail: samzu@mail.ru Безматерных Ксения Викторовна, инженер лаборатории физиологии и генетики микроорганизмов, ИЭГМ УрО РАН; e-mail: hydrargyrum@iegm.ru
Тюленев Алексей Валерьевич, кандидат биологических наук, инженер лаборатории физиологии и генетики микроорганизмов, ИЭГМ УрО РАН; e-mail: leksey333@yandex.ru
Лепехина Елена Владимировна, кандидат биологических наук, инженер лаборатории физиологии и генетики микроорганизмов, ИЭГМ УрО РАН; доцент кафедры химии и биотехнологии, Пермский национальный исследовательский политехнический университет (ПНИПУ), 614990, г. Пермь, Комсомольский пр., 29; e-mail: alenshick@mail.ru
Петерс Михаил Александрович, аспирант лаборатории физиологии и генетики микроорганизмов, ИЭГМ УрО РАН; e-mail: mixeu-mhz@mail.ru
Ушаков Вадим Юрьевич, кандидат биологических наук, ведущий инженер лаборатории физиологии и генетики микроорганизмов, ИЭГМ УрО РАН; доцент кафедры физиологии растений и микробиологии, Пермский государственный национальный исследовательский университет (ПГНИУ), 614990, г. Пермь, ул. Букирева, 15; e-mail: ushakovvad@yandex.ru
Брысова Марина Николаевна, старший лаборант лаборатории физиологии и генетики микроорганизмов, ИЭГМ УрО РАН; e-mail: m-brysova75@mail.ru
Материал поступил в редакцию 21.10.2016 г.
