CC BY
142
ЛАБОРАТОРНЫЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК 612.115.4:615.012.8
СРАВНЕНИЕ ДВУХ АЛЬТЕРНАТИВНЫХ МЕТОДОВ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ ОЧИСТКИ ПРИ ПОЛУЧЕНИИ ПРЕПАРАТА VIII ФАКТОРА СВЕРТЫВАНИЯ ПЛАЗМЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА В ДОЗИРОВКЕ 500 ЕДИНИЦ/ФЛАКОН
А.В. Ямкин, О.В. Стронин, Л.Н. Никитина, Н.А. Семенова, А.А. Епанчинцев, Н.С. Шквыря
Филиал ФГУП "НПО "Микроген" Минздравсоцразвития России в г. Томск "НПО "Вирион"
E-mail: [email protected]
THE COMPARATIVE ANALYSIS OF TWO ALTERNATIVE CHROMATOGRAPHIC PURIFICATION METHODS FOR MANUFACTURE OF PREPARATION OF HUMAN COAGULATION FACTOR VIII AT A DOSAGE OF 500 INTERNATIONAL UNITS/VIAL
A.V. Yamkin, O.V. Stronin, L.N. Nikitina, N.A. Semenova, A.A. Epanchintsev, N.S. Shkvyrya
"Virion" - Tomsk Branch of the Federal State Unitary Company "Microgen" Scientific Industrial Company for Immunobiological Medicines" of the Ministry of Health and Social Development of the Russian Federation
Сравнивались два метода хроматографической очистки при получении фактора VIII с дозировкой 500 ЕД/фл.
Метод 1 - с использованием эксклюзионной и ионообменной хроматографий, метод 2 - с использованием одной ионообменной хроматографии. Установлено, что метод 1, несмотря на более низкий выход фактора VIII. обеспечивал более высокую степень очистки целевого белка по сравнению с методом 2. Таким образом, метод 1 является предпочтительным методом очистки при получении препарата VIII фактора свертывания плазмы крови человека.
Ключевые слова: фактор свертывания VIII, эксклюзионная хроматография, ионообменная хроматография.
Two methods of chromatographic purification for manufacture of preparation of human coagulation factor VIII at a dosage of 500 IU/vial were compared. Size exclusion chromatography and ion-exchange chromatography were used in method 1, ion-exchange chromatography only was used in method 2. It was found that despite lower recovery, method 1 provided higher level of purification of factor VIII in comparison with method 2. Thus, purification method 1 is preferable for preparation of human coagulation factor VIII.
Key words: coagulation factor VIII, size exclusion chromatography, ion exchange chromatography.
Введение
Гемофилия А является врожденным заболеванием, при котором нарушается свертывание крови. Лечение больных гемофилией А основано на регулярных инъекциях препарата фактора свертывания крови VIII. Препараты фактора VIII ежегодно входят в программу государственных гарантий оказания гражданам РФ бесплатной медицинской помощи, разрабатываемой Минздравсоцразвития РФ и утверждаемой Правительством РФ. В России такие препараты не производятся, поэтому сейчас 100% применяемых очищенных препаратов фактора свертывания VIII являются импортными [1, 3]. Это обуславливает актуальность разработки технологии для получения отечественного препарата фактора свертывания крови VIII.
В предыдущей публикации [4] нами представлен оригинальный способ (патент №2324495) получения препарата VIII фактора свертывания крови человека. Цель работы: сравнение эффективности очистки с использованием эксклюзионной (5ЕС) и ионообменной хроматографий (ШС) и одной ионообменной хроматографии при получении препарата VIII фактора свертывания плазмы крови человека в дозировке 500 ЕД/фл.
Материал и методы
Препарат VIII фактора получали из свежезамороженной плазмы крови (СЗП) по технологической схеме, фактически состоящей из следующих этапов:
Таблица 1
Характеристика раствора криопреципитата и элюата, полученных при очистке методом 1 (SEC+IEC) и методом 2 (1ЕС) (М±т)
Наименование объекта исследования Концентрация VIII фактора свертывания [ЕД/мл] Содержание общего белка [мг/мл] Удельная активность VIII фактора свертывания [ЕД/мг] Три-н-бутил- фосфат, [мкг/мл] Тритон Х100 [мкг/мл] Выход фактора VIII [%] Коэффициент вариации показателя "Выход фактора VIII” [%]
Вирусинактивированный криопре- 11±3 50±12 0,19±0,05 3000 10000 35±7* 20
ципитат n=13 SEC+IEC n=6 60±8 2,2±0,5 28±8 0,2±0,1 0,3±0,1 57±5** 8,8
IEC n=7 50±9 3,6±0,3 12±3 0,8±0,2 0,6±0,2 0 1 0 14,3
Примечание: М - среднее арифметическое значение по выборке; т - стандартное отклонение по выборке; п - объем выборки; * - по отношению к свежезамороженной плазме; * - по отношению к содержанию фактора VIII в растворе криопреципитата.
Рис. 1. Профиль элюции раствора криопреципитата при ионообменной хроматографии 8БС-элюата (метод 1) и активность фактора VIII в разных хроматографических пиках:
- - активность фактора VIII, ЕД/мл;
- оптическая плотность при длине волны 280 нм, тАи
- разморозка СЗП при температуре 3-4 °С до полного исчезновения льда и формирования отчетливо видимого осадка [5, 15];
- отделение осадка (криопреципитата) центрифугированием на проточной центрифуге ОТР101-К1 (Россия) при l5000 об/мин в течение (40+10) мин;
- растворение криопреципитата в цитратном буфере в соотношении 1:4 при температуре (25±2)
°С в течение 30 мин. Соотношение “буфер : криопреципитат” было 4 л : 1 кг соответственно;
- удаление нерастворимого осадка из раствора криопреципитата центрифугированием при 2500 g в течение 10 мин;
- вирусинактивирующая обработка раствора криопреципитата сольвент-детергентным методом в течение 6 часов при температуре (27+2) °С с использованием в качестве вирусинактивирующих агентов три-н-бутилфосфата и Тритона Х-100 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Германия) в конечных концентрациях
0,3 и 1% соответственно [6, 7, 9];
- осветляющая фильтрация вирусинактивированного раствора с использованием префильтров с диаметром пор 5 мкм (ООО “Палл Евразия”, Москва).
Далее фильтрат подвергался хроматографической
очистке двумя альтернативными методами.
Метод 1 с использованием SEC и IEC:
- очистка фильтрата с помощью SEC, для чего вируси-нактивированый раствор криопреципитата наносили на хроматографическую колонну PI200/750 (YMC Europe, Германия) с сорбентом Sepharose 4FF (GE Healhcare Bio-Sciences AB, Швеция) на скорости 60+20 см/ч при давлении в хроматографической системе (2,5±0,5) бара, при комнатной температуре;
- сбор элюата, содержащего фактор VIII, добавление
стабилизаторов;
- доочистка и концентрирование полученного хроматографического элюата с помощью IEC, для чего элюат наносили на хроматографическую колонну XK50/30 (GE Healhcare Bio-Sciences AB, Швеция) с сорбентом DEAE-Toyopearl 650M (Tosoh corporation, Япония) на скорости 70+20 см/ч при давлении в хроматографической системе (2,5±0,5) бара;
Метод 2 с использованием одной IEC:
- очистка и концентрирование фильтрата с помощью IEC, для чего вирусинактивированный раствор криопреципитата наносили на хроматографическую колонну XK50/30 c сорбентом DEAE-Toyopearl 650M на скорости 50+20 см/ч при давлении в хроматографической системе (2,5+0,5) бара;
После хроматографической очистки методами 1 и 2 следовали следующие этапы:
Таблица 2
Аналитические данные показателей качества препарата с дозировкой 500 ЕД/фл, произведенного с использованием очистки эксклюзионной и ионообменной хроматографий
Наименование показателя качества №600410 №610610 №620710
1 2 3 4
Описание. Аморфный порошок или пористая масса от белого до светло-желтого цвета Пористая масса белого цвета Пористая масса белого цвета Пористая масса белого цвета
Подлинность. Препарат должен содержать: фактор VIII, натрий-ион, хлор-ион,сахарозу Обнаруживается активность фактора VIII. Качественные реакции на натрий-ион, хлор-ионы и сахарозу положительные Обнаруживается активность фактора VIII. Качественные реакции на натрий-ион, хлор-ионы и сахарозу положительные Обнаруживается активность фактора VIII. Качественные реакции на натрий-ион, хлор-ионы и сахарозу положительные
Растворимость. Содержимое бутылки (флакона)с препаратом должно растворяться в 20 мл воды для инъекций в течение 20 мин при легком покачивании при комнатной температуре Содержимое флакона с препаратом растворяется в 20 мл воды для инъекций в течение 20 мин при легком покачивании при комнатной температуре Содержимое флакона с препаратом растворяется в 20 мл воды для инъекций в течение 20 мин при легком покачивании при комнатной температуре Содержимое флакона с препаратом растворяется в 20 мл воды для инъекций в течение 20 мин при легком покачивании при комнатной температуре
Прозрачность. Должен выдерживать сравнение с эталоном IV Выдерживает сравнение с эталоном IV Выдерживает сравнение с эталоном IV Выдерживает сравнение с эталоном IV
Цветность. Должен выдерживать сравнение с эталоном Y6 Выдерживает сравнение с эталоном Y6 Выдерживает сравнение с эталоном Y6 Выдерживает сравнение с эталоном Yí
Механические включения. Должен выдерживать требования РД 42-501-98 Выдерживает требования РД 42-501-98 Выдерживает требования РД 42-501-98 Выдерживает требования РД 42-501-98
рН. От 6,6 до 7,4 7,1 6,9 7,0
Белок. Не более 1,0% 0,3% 0,5% 0,6%
Потеря в массе при высушивании. Не более 5% 2,6% 2,8% 3,0%
Активность фактора VIII. От 400 до 600 ЕД/ фл 480 ЕД/фл 450 ЕД/фл 480 ЕД/фл
Удельная активность. Не менее 1 ЕД/мг белка 7 ЕД/мг белка 5 ЕД/мг белка 4 ЕД/мг белка
Калий-ион. Не более 4 мг/л 1 мг/мл 3 мг/мл 3 мг/мл
Пирогенность. Должен быть апирогенным Апирогенный Апирогенный Апирогенный
Аномальная токсичность. Должен быть нетоксичным Нетоксичный Нетоксичный Нетоксичный
Стерильность. Должен быть стерильным Стерильный Стерильный Стерильный
- сбор элюата, содержащего фактор VIII, добавление
стабилизаторов, заморозка при температуре минус (50±5) °С; '
- контроль качества размороженного элюата;
- объединение партий размороженного элюата в лабораторно-промышленную серию, осветляющая и стерилизующая фильтрация промежуточного продукта;
- сублимационная сушка и контроль лиофилизирован-ного препарата с дозировкой 500 ЕД/фл.
Контроль качества размороженного элюата проводили по следующим показателям:
- концентрация (активность) VIII фактора свертывания. Определяли методом измерения активированного частичного тромбопластинового времени с использованием коммерческих наборов (“НПО Ренам”, Мос-
ква), в качестве стандарта использовали плазму с аттестованной активностью фактора VIII (“НПО Ренам”, Москва);
выход фактора VIII. Определяли как отношение общего количества фактора VIII в элюате после хроматографической очистки к общему количеству до хроматографической очистки;
содержание общего белка. Определяли биуретовым методом и методом Лоури [2]; удельная активность фактора VIII. Оценивали как отношение активности фактора VIII к количеству общего белка;
количество три-н-бутилфосфата. Определяли методом газовой хроматографии [10]; количество Тритона Х-100. Определяли методом об-
ращенно-фазовой хроматографии [12].
Контроль качества лиофили-зированного препарата с дозировкой 500 ЕД/фл проводили стандартными методами по показателям качества проекта ФСП на АнтигемоВир, лиофилизат для приготовления раствора для инфузий 500 ЕД. Дополнительное исследование молекулярномассового состава белков в исследуемом препарате в сравнении с препаратом Октанат проводили методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецил-сульфата натрия [14]. Пробы не были нормированы по содержанию белка. Денситометрию геля проводили с помощью программы Phoretix.1.0.
Результаты представлены в виде среднеарифметического значения с указанием среднеквадратичного отклонения. Коэффициент вариации рассчитывали в процентах как отношение среднеквадратичного отклонения к среднеарифметическому значению.
Результаты и обсуждение
Обобщенные данные, полученные при производстве 13 экспериментальных серий, представлены в таблице 1. Установлено что, 65% фактора VIII терялось на стадии криофракционирования СЗП. Следует отметить, что без стадии криофракционирования при производстве препаратов иммуноглобулина и альбумина белки, образующие криопреципитат, входят в состав осадка А8, который является отходом производства [8, 15], поэтому даже с потерями криофракционирование увеличивает рентабельность производства препаратов крови [5]. Несмотря на высокое содержание белка в криопреципитате, удельная активность фактора VIII в нем была низкая, так как основную массу криопреципитата составляют примесные белки (табл. 1). На стадии SEC при использовании метода 1 удалялось значительное
Рис. 2. Профиль элюции раствора криопреципитата при ионообменной хроматографии раствора криопреципитата (метод 2) и активность фактора VIII в разных хроматографических пиках:
- - активность фактора VIII, [ЕД/мл];
- оптическая плотность при длине волны 280 нм, [тАИ]
Рис. 3. Молекулярно-массовый состав исследуемого препарата и препарата Октанат с дозировкой 500 ЕД/фл: 1 - препарат “Октанат” (ОКТАФАРМА Фармацевтика, Австрия); 2 -исследуемый препарат (“НПО Вирион”); 3 - маркеры молекулярных весов, кДа
количество примесных белков, что повышало в 68 раз удельную активность фактора VIII по сравнению с раствором криопреципитата. Однако концентрация фактора VIII в SEC-элюате составляла 4,5±05 ЕД/мл, что было недостаточно для дальнейшего производства препарата [8]. Это обусловило необходимость введения стадии концентрирования. При производстве препаратов крови методами выбора для концентрирования являются ультрафильтрация и IEC [5, 11, 13]. Предпочтение было отдано методу IEC, так как он позволяет не только концентрировать, но и дополнительно очищать полупродукт [5, 8, 13]. Это подтверждает типичный профиль элюции, получаемый при нанесении SEC - элюата на ионообменную колонну (рис. 1).
Судя по этому профилю, в “проходной фракции” элюировались примесные белки, оставшиеся после SEC, с неопределяемой активностью фактора VIII. После очистки методом 1 удельная активность фактора VIII была в 147 раз выше по сравнению с раствором криопреципитата. Выход фактора VIII относительно раствора криопреципитата при очистке методом 1 был 1,2 раза ниже по сравнению с методом 2 (табл. 1). При этом коэффициент вариации значений выхода был в 1,6 раза ниже по сравнению с методом 2, что указывает на менее стабильный выход при использовании метода 2 (табл. 1). Возможно, это было связано с разной концентрацией общего белка в растворе криопреципитата, наносимого на ионообменную колонну. Так, концентрация общего белка в растворе криопреципитата варьировала от 32 до 65 мг/мл. Несмотря на то, что условия IEC при методе 2 были подобраны таким образом, чтобы с ионообменными группами сорбента связывались только молекулы фактора VIII, возможно, происходило и неспецифическое связывание примесных белков раствора криопреципитата, что снижало емкость сорбента для целевого белка. В результате этого часть целевого белка не связывалась с сорбентом, а элюировалась вместе с примесями, что подтверждалось выявлением активности фактора VIII в “проходной фракции” IEC (рис. 2). Недостатком метода 2, кроме менее стабильного выхода, было то, что количество общего белка при его использовании было в 1,6 раз выше по сравнению с методом 1. Это обуславливало снижение удельной активности фактора VIII - интегрального показателя, характеризующего эффективность метода очистки. Так, при использовании метода 1 данный показатель был в 2,3 раза выше по сравнению с методом 2 (табл. 1). Это связано с тем, что метод 1 включает две стадии очистки: SEC и IEC. На стадии SEC удалялось основное количество белковых примесей, за счет чего снижались общее количество белка и вязкость раствора. В результате целевой белок более эффективно связывался с ионообменными группами сорбента. Следовательно, проведение SEC перед IEC обеспечивало более эффективное удаление примесей по сравнению с методом 2.
Следует отметить, что как после очистки методом 1, так и методом 2 удалялась основная часть вирусинакти-вирующих агентов, и их количество находилось в пределах допустимой нормы для препаратов фактора VIII (табл. 1) [7, 9].
Более низкий выход при использовании метода 1 в
конечном итоге может обуславливать более высокую цену препарата, полученного с использованием этого метода. Однако в настоящее время основное внимание во всем мире уделяется именно степени очистки белков с направленным терапевтическим действием, полученных из плазмы крови, поэтому при получении препарата фактора VIII с дозировкой 500 ЕД/мл технологическая схема, включающая метод 1, представлялась более перспективной. В таблице 2 представлены основные показатели качества 3 серий препарата с дозировкой 500 ЕД/фл, произведенного в 2010 г. с использованием метода 1. Исследование молекулярно-массового состава образцов произведенного препарата в сравнении с зарегистрированным и широко применяемым в настоящее время в России препаратом “Октанат” (500 ЕД/фл, производитель ОКТАФАР-МА Фармацевтика, Австрия), показало, что по молекулярно-массовому составу вышеуказанные препараты сопоставимы (рис. 3), что указывает на возможность замещения дорогостоящих импортных аналогов высококачественным отечественным препаратом VIII фактора свертывания.
Заключение
Комбинирование эксклюзионной и ионообменной хроматографий является предпочтительным методом очистки при получении препарата VIII фактора свертывания плазмы крови человека с дозировкой 500 ЕД/фл по сравнению с очисткой одной ионообменной хроматографией.
Литература
1. Государственный реестр лекарственных средств : официальное издание (по состоянию на 2011 г.) [Электронный ресурс]. - URL: http://grls.rosminzdrav.ru.
2. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У. и др. Справочник биохимика.
- М. : Мир, 1991. - С. 466-467.
3. Ямкин А.В., Стронин О.В., Никитина Л.Н. и др. Способ получения и свойства препарата VIII фактора свертывания плазмы крови человека // Сибирский медицинский журнал (Томск) . - 2009. - № 2, Вып. 2. - С. 17-20.
4. 17 апреля - Международный день гемофилии : электронный журнал “Медицинские Ведомости” 2002. - Т. 47, Вып. 4 [Электронный ресурс]. - URL: http://www.medcom.spb.ru.
5. Burnouf T. Modern plasma fractionation // Transfus. Med. Rev.
- 2007. - Vol. 21(2). - P. 101-117.
6. Burnouf T. еt al. A minipool process for solvent-detergent treatment of cryoprecipitate at blood centres using a disposable bag system // Vox Sang. - 2006. - Vol. 91(1). - P. 56-62.4.
7. Dichtelmuller H.O. et al. Robustness of solvent / detergent treatment of plasma derivatives: a data collection from Plasma Protein Therapeutics Association member companies // Transfusion. - 2009. - Vol. 49(9). - P. 1931-1943.
8. Dmoszynska A. et al. Pharmacokinetics of Optivate(®), a high-purity concentrate of factor VIII with von Willebrand factor in patients with severe haemophilia A // Haemophilia. - 2011. -Vol. 17(2). - P. 185-90.
9. Guidelines on viral inactivation and removal procedures intended to assure the viral safety of human blood plasma products : Annex 4. - WHO Technical Report, Series, 2004. -No. 24. - P. 177.
10. Nellaiappan K. et al. Validation of simple and sensitive gas
chromatographic method for the analysis of tri-n-bytyl phosphate from virally inactivated human immunoglobulin // J. Chromatography B. - 2001. - Vol. 757. - P. 181-189.
11. Roberts P.L., Lloyd D., Marshall PJ. Virus inactivation in a factor VIII/VWF concentrate treated using a solvent/detergent procedure based on polysorbate 20 // Biologicals. - 2009. -Vol. 37(1). - P. 26-31.
12. Strancar A. et al. Extraction of Triton X-100 and its determination virus-inactivated human plasma by the solvent-detergent method // J. of Chromatography A. - 1994. - Vol. 658. -P. 475-481.
13. Strategies for protein purification handbook from GE healthcare [Электронный ресурс]. - URL: www.geliefesciences.com/ protein-purification.
14. Weber K., Osborn M. The reliability of molecular weight determinations by dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis // J. Biol. Chem. - 1969. - Vol. 244. - P. 440616.
15. Yazer M.H. et al. Cryoprecipitate prepared from plasma frozen within 24 hours after phlebotomy contains acceptable levels of fibrinogen and VIIIC // Transfusion. - 2010. - Vol. 50(5). -P. 1014-18.
Поступила 07.04.2011
