Научная статья на тему 'Выделение плазменного фактора свертывания крови IX высокой степени очистки'

Выделение плазменного фактора свертывания крови IX высокой степени очистки Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

CC BY
403
93
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Журнал
Гематология и трансфузиология
WOS
Scopus
ВАК
CAS
RSCI
PubMed
Ключевые слова
СВЕЖЕЗАМОРОЖЕННАЯ ПЛАЗМА / КРИОСУПЕРНАТАНТ / ФАКТОР IX СИСТЕМЫ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ / ИОНООБМЕННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ / АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ / МЕТАЛЛ-ХЕЛАТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ / FRESH FROZEN PLASMA / CRYOSUPERNATANT / FACTOR IX / ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY / AFFINITY CHROMATOGRAPHY / IMMOBILIZED METAL ION AFFINITY CHROMATOGRAPHY

Аннотация научной статьи по биотехнологиям в медицине, автор научной работы — Дереза Татьяна Леонидовна, Скрылева И. А., Кутюрова О. Г., Берковский А. Л.

Разработан лабораторный метод выделения концентрата фактора IX (ФIХ) высокой степени очистки, включающий последовательные ступени ионообменной, аффинной и металл-хелатной хроматографии. Оптимизированные условия проведения стадий аффинной и металл-хелатной хроматографии позволяют обеспечить выход фактора свертывания крови IX (ФIХ) не менее 83 ± 10 и 82 ± 7% соответственно. Получаемый концентрат с удельной активностью ФIХ 19,6 ± 5,5 МЕ/мг содержит не более 0,0001; 0 и 0,0004 МЕ ФII, ФVII и ФХ на 1 МЕ ФIХ. Полученные результаты могут быть положены в основу технологии получения антигемофильного препарата ФIХ высокой степени очистки из плазмы донорской крови.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по биотехнологиям в медицине , автор научной работы — Дереза Татьяна Леонидовна, Скрылева И. А., Кутюрова О. Г., Берковский А. Л.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Isolation of highly purified plasma factor IX

The new laboratory method for isolation of highly purified concentrated factor IX (FIX) includes a series of stages ion exchange, affinity, and immobilized metal ion affinity chromatographies. Optimal conditions for affinity and immobilized metal ion affinity chromatography have resulted in FIX output of 83±10 and 82±7%, respectively. The resultant concentrate with FIX specific activity of 19.6±5.5 U/ml contains no more than 0.0001, 0, and 0.0004 U FII, FVII, and FX per unit of FIX. The results can be used for developing a technology for obtaining highly purified concentrated FIX from human plasma.

Текст научной работы на тему «Выделение плазменного фактора свертывания крови IX высокой степени очистки»

Гематол. и трансфузиол., 2014, т. 59, № 2

20. Camitta B.M., Thomas E.D., Nathan D.G., Santos G., Gordon-Smith E.C., Gale R.P., et al. Severe aplastic anaemia a prospective study of the effect of early marrow transplantation on acute mortality. Blood. 1976; 48(1): 63-9.

21. Bacigalupo A., Hows J., Gluckman E., Nissen C., Marsh J., Van Lint M.T., et al. Bone marrow transplantation (BMT) versus immunosuppression (IS) for the treatment of severe aplastic anemia (SAA): a report of the EBMT SAA working party. Br. J. Haematol. 1988; 70(2): 177-82.

22. Болдырева М.Н. HLA (класс II) и естественный отбор. "Функциональный"генотип, гипотеза преимущества "функциональной" гетерозиготности: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. М.; 2007.

[Boldyreva M.N. HLA class II and natural selection. "Functional" genotype hypothesis benefits "functional" heterozygosity. Dis. Moscow; 2007]. (in Russian)

23. Болдырева М.Н., Алексеев Л.П., Хаитов Р.М., Гуськова И.А., Богатова О.В., Янкевич Т.Э. и др. HLA-генетическое разнообразие населения России и СНГ. I. Русские. Иммунология. 2005; 26(5): 260-3.

[Boldyreva M.N., Alekseev L.P., Khaitov R.M., Guskova I.A.,

Bogatova O.V, Yankevich T.E., et al. HLA-genetic diversity of the population of Russia and the CIS. I. Russians. Immunologiya. 2005; 26(5): 260-3]. (in Russian)

24. Чумак А.А., Астрелина Т.А., Яковлева М.В., Лебедева Л.Л., Пухликова Т.В., Дышлевая З.М. и др. Особенности генетического полиморфизма HLA-антигенов при приобретенной апластической анемии у детей. Вестник Российского университета дружбы народов. 2013; 1: 15-9.

[Chumak A.A., Astrelina T.A., Yakovleva M.V., Lebedeva L.L., Pukhlikova T.V., Dyshlevaya Z.M., et al. Peculiarities of genetic polymorphism of HLA-antigens with acquired aplastic anemia in children. Vestnik Rossiyskogo universiteta druzhby narodov. 2013; 1: 15-9]. (in Russian)

25. Кулагин А.Д. Апластическая анемия: иммунопатогенез, клиника диагностика, лечение. Новосибирск: Наука; 2008. [Kulagin A.D. Aplastic anemia: immunopathogenesis of clinic, diagnostics, treatment (Aplasticheskaya anemiya: immunopa-togenez, klinika diagnostika, lechenie). Novosibirsk: Nauka; 2008]. (in Russian)

Поступила 05.11.13 Received 05.11.13

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 615.382.03:616.151.514].012

ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМЕННОГО ФАКТОРА СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ IX ВЫСОКОЙ

СТЕПЕНИ ОЧИСТКИ

Дереза Т.Л., Скрылева И.А., Кутюрова О.Г., Берковский А.Л.

ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава России, Москва

Резюме. Разработан лабораторный метод выделения концентрата фактора IX (OIX) высокой степени очистки, включающий последовательные ступени ионообменной, аффинной и металл-хелатной хроматографии. Оптимизированные условия проведения стадий аффинной и металл-хелатной хроматографии позволяют обеспечить выход фактора свертывания крови IX (OIX) не менее 83 ± 10 и 82 ± 7% соответственно. Получаемый концентрат с удельной активностью OIX 19,6 ± 5,5 МЕ/мг содержит не более 0,0001; 0 и 0,0004 МЕ ФИ, OVII и OX на 1 МЕ OIX. Полученные результаты могут быть положены в основу технологии получения антигемофильного препарата ФЖ высокой степени очистки из плазмы донорской крови.

Ключевые слова: свежезамороженная плазма; криосупернатант; фактор IX системы свертывания крови; ионообменная хроматография; аффинная хроматография; металлхелатная хроматография.

ISOLATION OF HIGHLY PURIFIED PLASMA FACTOR IX

Dereza T.L., Skryleva I.A., Kutyurova O.G., BerkovskyA.L.

Hematology Research Center, 125167, Moscow, Russia

Summary. The new laboratory method for isolation of highly purified concentrated factor IX (FIX) includes a series of stages - ion exchange, affinity, and immobilized metal ion affinity chromatographies. Optimal conditions for affinity and immobilized metal ion affinity chromatography have resulted in FIX output of 83±10 and 82±7%, respectively. The resultant concentrate with FIX specific activity of 19.6±5.5 U/ml contains no more than 0.0001,0, and 0.0004 U FII, FVII, and FX per unit of FIX. The results can be used for developing a technology for obtaining highly purified concentrated FIX from human plasma.

Key words: fresh frozen plasma; cryosupernatant; factor IX; ion exchange chromatography; affinity chromatography; immobilized metal ion affinity chromatography.

Фактор IX (ФГХ) системы свертывания крови, или фактор Кристмаса, представляет собой витамин

Для корреспонденции:

Дереза Татьяна Леонидовна, кандидат технических наук, старший научный сотрудник лаборатории фракционирования белков крови и стандартизации методов контроля препаратов плазмы ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава России.

Адрес: 125167, Москва, Новый Зыковский проезд, д. 4а.

Телефон: + 7 (495) 612-85-72.

E-mail: dereza@blood.ru, drztata@gmail.com

Corresponding author:

Dereza Tatiyana, PhD (drztata@gmail.com).

К-зависимый глобулярный одноцепочечный гликопротеин, синтезируемый печенью. Концентрация ФК в плазме составляет 5 мкг/мл [1]. ФК входит в состав так называемого протромбинового комплекса (ПК), который включает в себя протромбин, или фактор II, проконвертин, или фактор VII, фактор Стюарта, или фактор X, и антигемофильный глобулин В, или фактор IX).

Недостаточность ФК приводит к тяжелому наследственному заболеванию - гемофилии В. Распространенность гемофилии В составляет 2,61 ± 1,61 на 100 000 человек мужского населения [2].

25

Гематол. и трансфузиол., 2014, т. 59, № 2

В течение длительного времени основным терапевтическим препаратом при лечении гемофилии В являлся криосупернатант (КСН) плазмы донорской крови. В состав КСН входят такие белки плазмы, как альбумин, иммуноглобулины различных классов, а также белки ПК [3]. Однако КСН имеет ряд недостатков, ограничивающих его применение в качестве лекарственного средства, в том числе высокий риск передачи трансмиссивных инфекций, частые аллергические реакции и необходимость больших объемов для переливания. В настоящее время для терапии гемофилии В используют концентраты Ф1Х средней и высокой степени очистки, обладающие высокой степенью вирусной безопасности, получаемые как из плазмы, так и рекомбинантного происхождения. На основании клинических исследований было показано, что концентраты Ф1Х средней степени очистки при длительном применении могут вызывать у больных тромбоэмболические осложнения, связанные с наличием в препаратах больших количеств ФП и ФX [4]. В связи с этим предпочтительно использовать концентраты Ф1Х высокой степени очистки. В настоящее время в России разработана технология получения только одного препарата на основе Ф1Х из плазмы донорской крови средней степени очистки - Агемфила В [5, 6].

Цель настоящего исследования - разработка лабораторного метода получения высокоочищенного Ф1Х из свежезамороженной плазмы (СЗП), пригодного в дальнейшем к масштабированию, и оптимизация условий хроматографической очистки, позволяющая обеспечить максимальный выход целевого белка на каждой стадии хроматографической очистки.

Материалы и методы

Ионообменная хроматография на DEAE-Toyopearl. Стадию ионообменной хроматографии проводили в опытно-производственном отделе глубокой переработки плазмы ФГБУ Гематологический научный центр (ГНЦ) Минздрава России с применением автоматизированной хроматографической системы BiоProcess ("Amersham Pharmacia Biotech", Швеция). Использовали хроматографические колонки BPG 200 той же фирмы. КСН получали из СЗП по методу J. Newman и соавт. [7]. КСН после доведения рН и электропроводности загружали на колонну, заполненную слабым анионообменником DEAE-Sepharose Fast Flow (DEAE-Sepharose FF) ("Amersham Pharmacia Biotech", Швеция). Колонну уравновешивали и промывали после загрузки КСН стартовым буферным раствором, содержащим 0,01М трис-HCl и 0,06M трехзамещенный цитрат натрия, рН 7,2-7,8. Выделение ПК проводили в ступенчатом градиенте ионной силы, создаваемом повышением концентрации хлорида натрия (NaCl) в стартовом буферном растворе от 0,2 до 0,36 М. Получаемый ПК диализовали против стартового буферного раствора с использованием установки для диализа ("Millipore", США) и подвергали антивирусной обработке с помощью три-п-бутилфосфата и твина-80 (1 и 0,3% соответственно) при перемешивании в течение 6 ч при комнатной температуре. ПК после антивирусной обработки наносили на колонку с DEAE-Sepharose FF. Хроматографию проводили в тех же условиях.

Аффинная хроматография на Toyopearl AF-Heparin. Стадии аффинной и металл-хелатной хроматографии проводили с использованием хроматографической системы AKTA Explorer 100 с программным обеспечением Unicorn, версия 5.1 ("GE Healthcare", Швеция). Использовали хроматографические колонки XK26/20, X16/20 и Tricorn 10/100 той же фирмы. Доводили электропроводность ПК до значения, соответствующего электропроводности стартового буферного раствора. Полученный раствор наносили на колонку, заполненную аффинным сорбентом Toyopearl AF-Heparin ("TosoH", Япония) и уравновешенную буферным раствором, содержащим 10 мМ Трис-HCl и 20 мМ трехзамещенный цитрат натрия, рН 7,2. Выделение Ф1Х проводили в ступенчатом градиенте ионной силы, создаваемом увеличением концентрации хлорида натрия в стартовом буферном растворе. Ф1Х элюировали буферным раствором с концентрацией NaCl 0,5 М. Линейная скорость элюции составляла 60 см/ч.

Металл-хелатная хроматография на Chelating Sepha-rose FF. Концентрат Ф1Х со стадии аффинной хроматографии обессоливали способом гель-фильтрации с использованием сорбента Sephadex G-25 Coarse ("GE Healthcare", США) для удаления ионов цитрата. Использовали колонку ХК26/50. Подготовку металл-хелатного сорбента Chelating Sepharose Fast Flow (Chelating Sepharose FF) ("GE Healthcare", США) проводили в соответствии с инструкцией производителя. Колонку заряжали ионами двухвалентной меди (Cu2+) в слабокислой среде. На колонку, уравновешенную стартовым буферным раствором, содержащим 0,05М ацетата натрия и 0,5М NaCl, рН 7,2, загружали Ф1Х-содержащий раствор после его обессоливания на Sephadex G-25 Coarse. Хроматографическую очистку проводили в градиенте концентраций глицина в стартовом буферном растворе, соответствующем раствору на стадии обессоливания. Ф1Х элюировали буферным раствором, содержащим 0,03 М глицина. Линейная скорость процесса составляла 60 см/ч.

Специфическую активность Ф1Х, Ф11, ФУП и ФХ во фракциях, получаемых в процессе хроматографической очистки, определяли коагулологическим методом на коа-гулометре MC4 Plus ("Amelung", Германия). За величину международной единицы активности (МЕ) принимали специфическую активность 1 мл нормальной плазмы. Содержание общего белка во фракциях определяли методом М.М. Бредфорда на спектрофотометре Ultrospec 2100 pro ("GE Healthcare", Швеция) [8]. Количественное определение содержания иммуноглобулинов (Ig) классов G, A и М (в г/л) проводили методом радиальной иммунодиффузии по Дж. Манчини [9]. Молекулярно-массовое распределение в получаемых концентратах изучали методом SDS-электрофореза на полиакриламидном геле в градиенте 4-15%. Использовали систему для электрофореза Fast System ("Amersham Biosciences", Швеция). Построение калибровочных графиков и все необходимые вычисления проводили с помощью программы Microsoft Excel.

Результаты и обсуждение

Все используемые в настоящее время технологии получения концентрата Ф1Х высокой степени очистки включают несколько ступеней хроматографии. При этом, как правило, первая стадия процес-

26

Гематол. и трансфузиол., 2014, т. 59, № 2

Рис. 1. Определение динамической емкости сорбента Toyopearl AF-Heparin по Ф1Х.

са (получение ПК) осуществляется батч-способом с использованием анионообменника DEAE-Sephadex. На последующих стадиях разделяют белки, входящие в состав ПК. Для этого используют комбинацию анионообменной и аффинной хроматографии [10], анионообменной и металл-хелатной хроматографии [11], аффинную хроматографию в сочетании с катионообменной. Однако в приведенных примерах общий выход в процессе очистки Ф1Х не превышает 30% от его исходного содержания в СЗП.

Предложенная нами схема включает выделение ПК из КСН донорской плазмы колоночным способом и последующее выделение Ф1Х из ПК с использованием 2 последовательных стадий хроматографической очистки - аффинной и металл-хелатной хроматографии.

В существующих технологиях аффинной очистки ПК в качестве сорбента, как правило, используют Heparin Sepharose FF ("GE Healthcare"). На предварительном этапе работ мы сравнили два аффинных носителя: Heparin Sepharose FF и Toyopearl AF-Heparin. Было показано, что после 7 циклов работы емкость Heparin Sepharose FF по Ф1Х снижается, что, по-видимому, связано с утечкой аффинного лиганда. В отличие от сорбента на основе се-фарозы, емкость сорбента Toyopearl AF-Heparin не снижается в течение по крайней мере 20-30 циклов. В связи с этим для дальнейшей работы был выбран этот сорбент. Для определения динамической емкости Toyopearl AF-Heparin по Ф1Х изучали зависимость специфической активности Ф1Х во фракции, не связывающейся с сорбентом, от нагрузки на сорбент по Ф1Х (рис. 1).

Резкое возрастание специфической активности во фракции, не связывающейся с сорбентом, свидетельствовало о том, что в данных условиях достигнуто насыщение активных групп сорбента целевым компонентом. В выбранных условиях динамическая емкость Toyopearl AF-Heparin по Ф1Х не превышает 12 МЕ на 1 мл геля (см. рис. 1). Для проведения дальнейших экспериментов была выбрана нагрузка по Ф1Х, составляющая 70-75% от динамической емкости или 7,86±0,70 МЕ/мл сорбента. Ф1Х выделяли в ступенчатом градиенте ионной силы. Типичная

Рис. 2. Хроматографическая очистка КП на сорбенте Toyopearl AF-Heparin. Условия: колонка ХК26/20; h = 11 см; давление 1--3 бар; температура комнатная, °С.

хроматограмма процесса выделения Ф1Х представлена на рис. 2.

На стадии сорбции и промывки стартовым буферным раствором удаляется до 30% общего белка, при этом компоненты ПК, а именно Ф11, ФУП, Ф1Х и ФХ, остаются связанными с колонкой. Промывка раствором промежуточной ионной силы позволяет удалить до 47% общего белка, в том числе основное количество Ф11, ФУП и ФХ, поскольку эти компоненты ПК в данных условиях удерживаются сорбентом слабее, чем целевой продукт Ф1Х. Целевую Ф1Х-содержащую фракцию элюировали повышением ионной силы стартового буфера до 0,5 М NaCl. По результатам 9 опытов выход по Ф1Х составил не менее 83±10%, при этом выход балластных компонентов в получаемом концентрате составляет 0,1 ± 0,01%, 0 и 0,9 ± 0,2% по Ф11, ФУ11 и ФХ соответственно. Аффинная очистка ПК c помощью сорбента Toyopearl AF-Heparin позволяет практически полностью удалить Ф11 и ФУ11, но получаемый концентрат содержит до 0,9% ФХ от его исходного содержания.

Рис. 3. Зависимость выхода Ф1Х и суммарных потерь от величины нагрузки на сорбент.

27

Гематол. и трансфузиол., 2014, т. 59, № 2

Рис. 4. Хроматограмма процесса очистки Ф1Х-концентрата на сорбенте Cu2+ Chelating Sepharose FF в градиенте глицина. Условия: колонка:Tricorn 10/5; h = 3, 5 см; давление 2-3 бар; температура комнатная, °С.

Рис. 5. Электрофореграмма фракций, полученных в ходе очистки FIX: 1 - маркер, 2 - КСН, 3 - ПК, 4 - концентрат FIX после стадии аффинной хроматографии, 5 - концентрат FIX после стадии металл-хелатной хроматографии.

Соотношение удельных активностей Ф1Х/ФП/ФУП/ ФХ в исходном ПК составляло 1/0,97 ± 0,18/0,03 ± 0,01/0,6 ± 0,002, а в получаемом концентрате Ф1Х -1/< 0,001/0/< 0,003 соответственно.

Поскольку в данных условиях не удается полностью очистить продукт от ФХ, на следующей ступени очистки использовали металл-хелатную хроматографию на сорбенте Chelating Sepharose FF. Сорбент заряжали ионами Cu2+. Перед загрузкой образца на колонку проводили его обессоливание на сорбенте Sephadex G-25 Coarse ("GE Healthcare"). Потери Ф1Х на стадии обессоливания не превышали 0,56%.

Для определения оптимальной нагрузки на ме-талл-хелатный сорбент проводили эксперименты с разным значением нагрузки по Ф1Х. Определяли выход Ф1Х и суммарные потери на стадиях загрузки образца и промывки стартовым буферным раствором (рис. 3). В данных условиях нагрузка 82-84 МЕ Ф1Х в 1 мл сорбента является максимальной. Дальнейшее ее повышение приводило к резкому снижению выхода Ф1Х за счет увеличения

Таблица 1

Соотношение факторов свертывания в белковых фракциях, полученных на последовательных ступенях очистки Ф1Х-содержащей фракции

Белковая фракция Содержание фактора свертывания в МЕ в расчете на 1 МЕ Ф1Х

фи ФУП ФХ

КСН 0,91 ± 0,09 0,92 ± 0,11 0,97 ± 0,12

ПК 0,97 ± 0,18 0,03 ± 0,01 0,60 ± 0,002

Концентрат Ф1Х после аффинной хроматографии < 0,001 Ниже пределов измерения < 0,003

Концентрат Ф1Х после металл-хелатной хроматографии < 0,0001 Ниже пределов измерения < 0,0004

потерь целевого компонента в элюате на стадиях загрузки и промывки стартовым буферным раствором. На основании полученных результатов последующие эксперименты проводили с нагрузкой на сорбент, не превышающей 83 МЕ/мл. Очистку Ф1Х-содержащего концентрата проводили в ступенчатом градиенте концентраций глицина в стартовом буферном растворе. Типичная хроматограмма процесса представлена на рис. 4.

Потери Ф1Х на стадиях загрузки и промывки стартовым буфером составляют не более 0,23%. В отличие от Ф1Х, ФХ на данном сорбенте удерживается слабее и основное его количество (не менее 95%) удаляется промывкой стартовым буферным раствором. Далее проводили элюцию Ф1Х повыше -нием концентрации глицина в стартовом буферном растворе до 0,03 М. По результатам 3 опытов по выделению высокоочищенного Ф1Х на Cu2+ Chelating Sepharose FF выход по целевому компоненту составил не менее 83 ± 0,7. Удельная активность Ф1Х в получаемом продукте по сравнению с загружаемым на сорбент сырьем увеличилась в 2,35 раза - до 19,43 ± 5,5 МЕ/мг белка.

Таблица 2

Содержание IgG, IgA, IgM во фракциях, полученных в ходе очистки Ф1Х

Белковая фракция IgG, г/л IgA, г/л IgM, г/л

КСН 10,43+3,50 1,82+0,60 0,50+0,06

ПК 0,31+0,01 0,26+0,03 0,27+0,08

Концентрат FK после аффинной хроматографии Отсутствует Отсутствует Отсутствует

Концентрат FK после металл-хелатной хроматографии Отсутствует Отсутствует Отсутствует

28

Гематол. и трансфузиол., 2014, т. 59, № 2

Таблица 3

Характеристики процесса выделения высокоочищенного концентрата Ф1Х из СЗП. Результаты представляют среднее значение из трех опытов

Белковая фракция А , МЕ/мг уд’ Выход Ф1Х, % Кратность очистки по отношению к исходной СЗП*

СЗП 0,018 ± 0,004 - -

ПК 2,80 ± 0,63 91 ± 4 155

Концентрат Ф!Х на стадии аффинной хроматографии 8,35 ± 0,90 83 ± 10 463

Концентрат ФГХ на стадии металл-хелатной хромато- 19,43 ± 5,50 82 ± 7 1079

графим

Примечание. * - рассчитана как отношение средней удельной активности фракции к средней удельной активности СЗП.

В табл. 1 представлено соотношение активностей компонентов ФIX/ФП/ФVП/ФX в ФК-содержащих растворах на стадиях процесса получения высокоочищенного концентрата ФГХ.

Таким образом, нами был получен концентрат ФК высокой степени очистки, в котором на единицу активности ФК приходится менее 0,04% ФX, менее 0,01% ФП, а концентрация ФУП ниже пределов измерения метода. В табл. 2 представлены данные о содержании примесных белков IgG, IgA, IgM во фракциях, получаемых в процессе очистки ФК, определенные методом радиальной иммунодиффузии в агарозном геле по Дж. Манчини. Уже на стадии аффинной хроматографии удалось полностью очистить продукт от Ig. Молекулярно-массовое распределение белков во фракциях, получаемых в процессе очистки ФК, исследовали методом SDS-электрофореза на градиентном полиакриламидном геле 4-15%. Элек-трофореграмма представлена на рис. 5. Как следует из результатов электрофореза, нам удалось очистить конечный продукт от многочисленных балластных белков, содержащихся в КСН и ПК. Концентрат Ф1Х после стадии металл-хелатной хроматографии, помимо Ф1Х с молекулярной массой 55кД, содержит также примеси с молекулярной массой около 300, 173 и 70 кД.

В табл. 3 приведены средние значения характеристик разработанного процесса получения концентрата Ф1Х для каждой из стадий процесса. Суммарный выход Ф1Х составил 60% от его содержания в исходной СЗП.

Таким образом, разработанный лабораторный метод выделения концентрата фактора IX из донорской плазмы, включающий три последовательные стадии хроматографии: ионообменную, аффинную и металл-хелатную, позволяет получать концентрат Ф1Х, в котором содержание остальных факторов свертывания ФП, ФУП и ФХ не превышает 0,01, менее 0,001 и 0,04% на 1 МЕ Ф1Х соответственно. Кратность очистки конечного продукта по сравнению с СЗП составляет 1079 раз. Выход по Ф1Х на

стадиях аффинной и метталл-хелатной хроматографий составляет 83 ± 10 и 82 ± 7% соответственно. Средний выход высокоочищенного Ф1Х составил 60% от его исходного содержания в СЗП. Полученные результаты могут быть положены в основу технологии получения концентрата Ф1Х высокой степени очистки, обладающего прокоагуляционной активностью.

ЛИТЕРАТУРА [REFERENCES]

1. Furie B., Furie B.C. The molecular basis of blood coagulation. Cell. 1988; 53(4): 505-18.

2. Stonebraker J.S., Bolton-Maggs P.H., Michael Soucie J., Walker I., Brooker M. A study of variations in the reported haemophilia B prevalence around the world. Haemophilia. 2012; 18(3): 9-14.

3. Suomela H. Human coagulation factor IX. Isolation and characterization. Eur. J. Biochem. 1976; 71(1): 145-54.

4. Kusch M., Seitz R., Konig H. High sensitivity detection of activated factor IX: application to the analysis of different therapeutical factor IX concentrates and prothrombin complexes. Thromb. Haemost. 1998; 79(4): 778-83.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

5. Дереза Т. Л. Разработка хроматографического метода получения концентрата фактора IX из плазмы донорской крови: Автореф. дис. ... канд. техн. наук. М.; 2002.

[Dereza T.L. Development of chromatographic methods of obtaining concentrate factor IX of plasma of donor blood (Raz-rabotka khromatograficheskogo metoda polucheniya kontsentra-ta faktora IX iz plazmy donorskoy krovi). Dis. Moscow; 2002]. (in Russian)

6. Дереза Т.Л., Фетисова Л.В., Вязова Е.П. Ажигирова М.А. Концентрат фактора IX системы свертывания крови и способ его получения. Патент РФ № 2163140 от 20.02.01. http://ru-patent.info

[Dereza T.L., Fetisova L.V, Vyazova E.P., Azhigirova M.A. Concentrate factor IX blood clotting system and how to obtain it (Kontsentrat faktora IX sistemy svertyvaniya krovi i sposob ego polucheniya). Patent RF № 2163140 ot 20.02.01. http://ru-patent. info]. (in Russian)

7. Newman J., Johnson A. J., Karpatkin M.H., Puszkin S. Methods for the production of clinically effective intermediate- and high-purity factor-VIII concentrates. Br. J. Haematol. 1971; 21(1): 1-20.

8. Bredford М.М. А rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976; 72: 248-54.

9. Анастасиев В.В. Иммуноглобулин для внутривенного введения. Нижний Новгород: Изд-во НГМА; 2000. [Anastasiev V.V. Immunoglobulin for intravenous administration (Immunoglobulin dlya vnutrivennogo vvedeniya). Nizhniy Novgorod: Izd-vo NGMA; 2000]. (in Russian)

10. Burnouf T., Michalski C., Goudemand M., Huart J.J. Properties of a highly purified human plasma factor IX:c therapeutic concentrate prepared by conventional chromatography. Vox Sang. 1989; 57(4): 225-232.

11. Arrighi S., Borri M.G., Bucci E., Norelli F. Process for the isolation of highly purified factors IX, X and II from prothrombin complex or human plasma US Pat. 5,378,365, Jan. 1995. http:// www.uspto.gov

Поступила 07.08.13 Received 07.08.13

29

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.