CC BY
119
УДК543.4:544.2
Г. Х. Габитова, М. З. Шайдуллина, И. Д. Гурьянов, О. А. Решетник
СПОСОБЫ ДЕПОНИРОВАНИЯ ХЛЕБОПЕКАРНЫХ ДРОЖЖЕЙ
Ключевые слова: депонирование микроорганизмов, методы консервации, криопротекторы, Saccharomyces cerevisiae.
Работа посвящена анализу различных способов и условий для поддержания и сохранения микроорганизмов и технологически значимых хлебопекарных дрожжей. Рассматриваются краткосрочные, среднесрочные и долгосрочные методы хранения микроорганизмов, а также факторы, влияющие на жизнеспособность клеток при депонировании.
Keywords: storage of microorganisms, conservation procedures, cryoprotective agents, Saccharomyces cerevisiae.
This review is devoted to the analysis of different methods and conditions for the maintenance and preservation of microorganisms and technologically significant baking yeast. We consider the short, medium and extended methods for-storage of microorganisms, as well as the factors affecting the cell viability upon storage.
Введение
Работа бактериологической лаборатории всегда связана с необходимостью хранения микроорганизмов при возможности возобновления их культивирования и содержания коллекции культур. Используемое разнообразие методов хранения живых культур определяется техническими возможностями лабораторий, требованиями к продолжительности хранения и частотой обращения к ним. В общем случае все эти методы должны отвечать следующим потребностям: быть простыми в техническом исполнении, безопасными и надежными; подготовка культуры к депонированию и введение ее в работу должна занимать как можно меньше времени; метод должен обеспечивать быстрое восстановление жизнеспособности и активности клеток и гарантировать сохранениеих свойств.
Опубликованные наборы протоколов по данной тематике - это, по сути своей, успешные опыты прошлых лет, основанные на концептуальных идеях (изначально имеющие эмпирический характер), а их совершенствование - это комбинация и оптимизация различных приемов [1, 2]. Происходящие при консервации-реактивации структурно-
функциональные перестройки клеток могут приводить к потере некоторых свойств, например, снижать фитопатогенность микромицетов [3], образование пигментов [4].
Использование знаний, получаемых при изучении внутриклеточных процессов, протекающих при переходе микроорганизмов в состояние покоя в естественной среде обитания ограничено принципиальными отличиями задач исследователя от стабилизирующих факторов природы. Основными же задачами при депонировании культур микроорганизмов является поддержание жизнеспособности как можно большего числа клеток, составляющих культуру и их чистоты, предупреждение генетических и физиологических изменений, т.е. сохранение микроорганизмов в нативном состоянии, точкой отсчета которого является момент выделения клеток из внешней среды.
Существующих на сегодня приемов и методов хранения во многих случаях вполне достаточно,
однако увеличение их разнообразия открывает новые перспективы консервации биоматериалов, как для научных исследований, так и для практического использования.
Данный обзор, в основном, посвящен рассмотрению различных способов и условий для поддержания и сохранения технологически значимых хлебопекарных дрожжей.
Основные методы хранения и депонирования микроорганизмов
Метод периодических пересевов. Известны краткосрочные, среднесрочные и долгосрочные методы хранения микроорганизмов. Для непродолжительного хранения небольших коллекций широко распространенным и простым в исполнении способом поддержания являются периодические пересевы микроорганизмов на свежие питательные среды.
Периодическое культивирование позволяет при необходимости в достаточно короткие сроки увеличить биомассу микроорганизмов, при этом клетки будут находиться в физиологически активном состоянии. Метод общедоступен и позволяет легко контролировать чистоту штаммов невооруженным глазом, а наблюдаемые порой изменения культу-ральных признаков иногда отражают вырождение культуры микроорганизмов [5].
Очевидные недостатки лишают данный способ поддержания коллекций универсальности. Хотя он и подходит для многих микроорганизмов, в особенности, растущих на простых по составу питательных средах, при культивировании клеток с особыми потребностями к дефицитным и дорогим компонентам питательныхсред, подготовка которых осуществляется в несколько этапов и труднокультивируемым микроорганизмам данный способ теряет привлекательность.
Также существует необходимость строгого соблюдения протоколовпересевов, значительных временных затрат при подготовке культуральной посуды и питательных сред, рискиперекрестного загрязнения культур и случаи селекции при пересевах, в особенности, с использованием бактериологических петель, ошибки при обозначении штаммов, и т.д.
Известны случаи изменения биологических свойств микробных культур, и даже, их гибель. При частых пересевах из-за спонтанной диссоциации и возникновения гетерогенности культуры нередко происходит потеря исходного штамма-продуцента, а последующие варианты имеют сниженные способности к выработке целевых продуктов [6]. При нарушении регламента пересевов (несоблюдения интервалов) повышается риск обезвоживания куль-турыи только при работе с некоторыми микроорганизмами, способными формировать особые покоящиеся формы, позволяющие пережить неблагоприятные условия высушивания - споры, это не является серьезной проблемой.
Таким образом, при увеличении состава коллекции ее поддержание становится все более трудной задачей и, к сожалению, при выборе этого способа хранения, как основного, большинство бактериальных культур гибнет при высыхании в лабораторных условиях.
Частично проблемы частых пересевов решаются при хранении микроорганизмов в толще полужидкого питательного агарапод слоем глицерина или минерального масла [7]. С помощью этого методамногие виды сапрофитныхбактерий успешно сохранятсягодами (до 14 лет), а коллекции дрожжей и мицелиальных грибовнадежнееобновлятькаждые 2 - 3 года. Микроорганизмы обычно выращивают глубинно в пробирках в толще полужидкого агара (0.6 % вес/объем) или высевают на поверхность плотной скошенной среды. В пробирку, поверх выросших микроорганизмов наносят определенное количество стерильного масла. Высота столбика масла в пробирке должна быть не более 1 смнад поверхностью питательной среды [8]. Перед использованием масло стерилизуют в сушильном шкафу при температуре 160-180°С в течение нескольких часов. Иногда предварительно его автоклавируют [8, 9]. Слой масла защищает культуры от высыхания и подавляет их активный рост. Созданную таким образом коллекцию обычно хранят в холодильнике при температуре выше 0 °С. При необходимости обновления коллекции или для проверки жизнеспособности проводят посевы в свежие питательные среды, используя инокуляционные иглы или бактериологические петли. Пересеянные культуры таким же образом покрывают маслом, а первоначальные посевы хранят до подтверждения чистоты коллекционных штаммов.
Преимущества хранения под вазелиновым маслом заключаются в возможности создания небольшой коллекции микроорганизмовдаже в плохо оснащенной лаборатории, сокращении затрат на пересевы при среднейпродолжительности сохранения стабильности микробных культур.
Как для любого культивирования к общим недостаткам этого метода добавляется вероятность загрязнения и потери штамма вследствие использования нестерильных материалов.
Методхранения в водно-солевых растворах и буферах применим для непродолжительного хранения (несколько месяцев) бактерий, мицелиаль-ныхгрибов и дрожжей X Cerevisae. Этот способ
консервации клеток, находящихся в растворе, основан на их способности постепенно снижать функциональную активность и переходить в покоящееся состояние - гипобиоз [6]. Пробирки с растворами хранят в холодильнике при температуре 4-8 °С. Важным фактором стабильности клеток при использовании этого метода является правильное значение рН консервирующего раствора (для большинства сахаромицетов оптимум рН 5,5) [10].
Высушивание на твердых носителях более всего подходит для спорообразующих микроорганизмов и дрожжей. Перечень носителей достаточно широк - бумага, песок, почва, желатин, активный уголь и т.д. Технику этого метода на примере бумажных носителей можно представить так: бумажный диск пропитывают суспензией микроорганизмов и высушивают в вакуумном десикаторе. После загрузки дисков в пробирки, их переносят в холодильник для хранения. В одной ёмкости можно хранить множество носителей, содержащих одну и ту же культуру, часть из которых всегда можно использовать для оценки ее чистоты и жизнеспособности. Высушенные на носителях культуры микроорганизмов при необходимости легко транспортиро-вать.Данный метод подходит и для хранения хлебопекарных дрожжей. Для возобновления работы с культурой, диск достают пинцетом и стерильно вносят его в подходящую питательную среду [6].
Хлебопекарные дрожжи хорошо выдержива-ютвысушивание, это свойство используется при их коммерческом производстве. Высушивание осуществляют в несколько этапов. В самом начале при прессовании дрожжей для максимального обезвоживания используются фильтр-прессы или вакуум-фильтры. Для ускорения удаления влаги, спрессованные дрожжи отправляются на стадию измельчения, где грануляторы и формовочные машины формируют из дрожжевой массы нити или гранулы. Последующие этапы в зависимости от используемого оборудования отличаются в деталях. Эффективность производства сушеных дрожжей и их качество напрямую зависят отскоростивысушивания, поскольку сам процесс ощутимо снижает ферментативную активность клеток [11]. Для оптимального-высушивания требуется выполнение нескольких условий. Температуру дрожжевой массы следует поддерживать на уровне 30°С. В конечном этапе влажность дрожжей должна быть снижена до 7,58%. Остаточная влага сохраняет стабильность внутриклеточных биомолекул, ее удаление приведет кконформационным изменениям белков -денатурации, и гибели клеток. Однако при повышенном содержании воды в клетках (более 10 %) их метаболическая активность сохраняется, что может привести, к автолизу (разрушению клеток под воздействием собственных ферментов). Поэтому последний этап и является самым важным иопределяет выбор технологического оборудования. Выбор метода (многостадийная сушка, сушка под вакуумом, в виброкипящем слое, методом сублимации) определяет здесь активность ферментов брожения после возобновления культивирования и стойкость дрожжей при хранении. Более подробно об аппарат-
ном обеспечении этих процессов можно узнать, используя следующую ссылку[12].
Многим требованиям к условиям хранения микроорганизмов отвечают способы, основанные на бактериостазе - торможении протекающих в клетках физиологических процессов при замораживании биомассы и, в некоторых случаях, ее последующем высушивании.
При лиофилизации (сублимационной сушке) влагу из замороженных суспензий микроорганизмо-вудаляют под вакуумом, что способствует сохранению структуры исходного материала. Процесс осуществляется в две стадиив ходе которых происхо-дятпоследовательные фазовые переходы воды по схеме: жидкость - твердое (лед) - пар. Для длительного хранения микроорганизмов этот метод считается одним из самых экономичных и эффективных. При сублимации замороженных суспензий бактерий и вирусовизоляты удается сохранять в жизнеспособном состоянии в некоторых случаях более 30 лет [6]. Высушенные по данной технологии дрожжи отличаются высокой дисперсностью, лиофилизация повышает выживаемость клеток, но её существенным недостатком является то, что в первых пересевах дрожжевые клетки обладаютповышенной осмо-чувствительностью инизкой бродильной энергией (активностью). Культуры, прошедшие процесс лиофилизации и заморозки, рекомендуется использовать только после 2-3 пересевов на питательных средах, соответствующих их потребностям.
Хранение микроорганизмов при низких и ультранизких температурах в специально подобранных криосредах следует выбирать для депонирования микроорганизмов, которые не выдерживают лиофилизацию (базидиомицеты, спирохеты, мико-плазмы, водные фикомицеты и многие другие) [13, 14].
Данный метод относительно прост в исполнении. На первом этапе подготовки к глубокой заморозке в специальные пластиковые пробирки с закручивающимися крышками вносят по 0,5-2 мл суспензии клеток в криосреде. Пробирки помещают в коробку из пенопласта или пластиковый бокс, заполненный изопропанолом, и переносят в низкотемпературные морозильники (с температурой минус 80°С). Замораживание суспензий в специальных боксах способствует медленному и постепенному их охлаждению (со скоростью ~ 1°С/мин), а это впоследствии влияет на выживание и восстановление культуры клеток [9]. Длительное хранение образцов в условиях низкотемпературного морозильника вполне возможно, однако всегда следует помнить о риске потери коллекции в случае продолжительного отключения электроэнергии. Для предотвращения подобной ситуации и увеличения продолжительности хранения после суточного выдерживания при температуре минус 80°С, ампулы переносят в азотное хранилище, в качестве которого,в самом простом варианте, может выступать сосуд Дьюара,и хранят в азоте при температуре минус 196°С или над его уровнем впа-рах при температуре минус 150-170°С. Метод хранения в жидком азоте по-прежнему очень популярен и имеет множество вариантов. Для его осуществле-
ния производятся криохранилища, программные замораживатели и различные аксессуары [15, 16].
К основным преимуществам криогенного хранения микроорганизмов можно отнести: стабильность свойств депонированных микроорганизмов, относительно небольшие временные и материальные затраты на поддержание коллекции, возможность использования замороженных культур в качестве прямого инокулята, снижение риска загрязнений культуры, что бывает особенно актуально при работе с большим количествомизолятов.
Некоторые молочнокислые бактерии при таком способе консервации остаются живыми и сохраняют интенсивность брожения до 2 лет хранения [17, 18], но, как продемонстрировано в указанных работах, этот срок будет различаться для разных видов лак-тобацилл, а для кокковых форм сокращен в 4 раза. Такой способ хранения не рекомендуется применять для криочувствительных бактерий из-за повреждений клеточных структур и высокой вероятности генетического обмена между клетками, что может способствовать неконтролируемой селекции культуры [6, 10, 18, 19]. Существенным недостатком метода является то, что замораживание микробной биомассы и последующее восстановление из замороженного состояния может привести к гибели большей части культуры. Кроме того, при загрузке и выгрузке хранящихся культур часть азота улетучивается в атмосферу и в конечном итоге вкриохрани-лище необходимо добавлять новую порцию азота.
Своеобразным синтезом описанных выше методов является способ хранения микроорганизмов в растворе глицерина на поверхности и в микропорах специальных бусин. Для изготовления бусин применяются стекло,керамика, перлит, пластмассы. Такие системы хранения были успешно коммерциализированы некоторыми компаниями (Thermo Fisher-Protect, Pro-LabDiagnostics- Microbank™, HardyDiagnostic - CryoBeads™ и др.). В общем виде, протоколы криохранения включают в себя последовательность стадий приготовления суспензии клеток изолята, ее эмульгирования с криосредой до надежного связывания клеток с пористыми гранулами носителя, и удаления избытков криосреды. Флаконы затем выдерживают в течение 12 часов при температуре -70°С, а после переносят в сосуд Дьюара с жидким азотом. По мере необходимости носители с помощью инокуляционнойиглы извлекают из флакона и раскладывают в колбы с подходящими питательными средами. Известно, что при использовании данной системы хранения микроорганизмы сохраняют жизнеспособность до 10 лет [20].
Криопротекторы. Для защиты клеток от воздействия различных повреждающих факторов в процессе замораживания/размораживания и крио-храненияиспользуются, так называемые, криосреды. Это среды, содержащие криопротекторы - влаго-удерживающие и подавляющие образование кристаллов льда соединения различной природы, подо-бранныеизначально экспериментальным способом [6, 21]. Криопротекторы должны способствовать сохранению морфологических физиолого-биохимических и генетических свойств микроорга-
низмов, быть нетоксичными, по крайней мере, в используемых концентрациях, обладать низкой температурой замерзания в водных растворах. Наиболее удобны в работе криопротекторы с хорошей растворимостью в воде.
В соответствии с локализацией в системе и механизмами действиякриопротекторыразделены на три типа:
- внутриклеточные, способные просачиваться через клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану (глицерин, диметилсульфоксид);
- проходящие через клеточную стенку, но не через цитоплазматическую мембрану (моно-идисахариды, аминокислоты);
- внеклеточные (полисахаридах, декстран, ПЭГ-6000) [22, 23].
Внутриклеточные криопротекторы, как правило, более эффективны, их накопление в клетках (высокий уровень проникновения криопротекторов) может исключить образование льда во время криокон-сервации, но повышает риск токсического воздействия на компоненты клеток. Попытки снижения негативного действия криопротекторов направлены на оптимизацию протокольных процедур и времени добвлениякриопротектора в систему для заморозки.
С учетом огромного разнообразия микроорганизмов обойтись каким-либо одним криопротекто-ром в практической работе не представляется возможным. Поэтому при криоконсервации новых штаммов микроорганизмов следует предварительно проверить действие на них хотя бы нескольких, самых распространенныхзащитных соединений и в соответствии с предполагаемыми условиями хранения выбрать наиболее подходящие для конкретно-гоизолята.
Для криоконсервации и лиофилизации дрожжейшироко применяются сахариды и полисахариды (сахароза, глюкоза, трегалоза, декстран, агар), различные спирты (пропиленгликоль, манни-тол, сорбитол, метанол, этанол) пептиды, пептоны и коллоиды (молоко, сыворотки), соли (глутамат натрия) и т.д.
Среди протектантов внутриклеточной локализации наибольшую популярность получили глицерин (глицерол, пропантриол-1,2,3) и диметилсульфоксид (dimethylsulphoxid, DMSO). Глицерин успешно применяется в практикехранения различных про - и эукариотическихмикроорганизмов с высоким процентом выживаемости и сохранением свойств [10, 19]. Преимущества данного соединения - хорошая растворимость в воде и очень низкая токсичность. Эффективность таких криопротекторов, как глицерин и ДМСО зависят от их концентрации в среде, а оптимумы могут варьировать в диапазоне от 1 до 32 % [6,21]. Для некоторых сахаромицетдиметилсуль-фоксид является более предпочтительным криокон-сервантом [24]. Необходимо учитывать, что ДМСО оказывает токсическое действие намногие микроорганизмы и в таких случаях при размораживании клеточного материала следует удалять остатки криосреды. Было продемонстрировано ингибирова-ние роста аэробных бактерий (стафилококков, микрококков, псевдомонад, стрептококков, кишечной
палочки и др.) в присутствии 10 % ДМСО, однако данные концентрации не влияли на жизнеспособность анаэробов [25].
Защитные среды, не проникающие внутрь клеток, подходят для их сохранения в замороженном состоянии и при сублимационном высушивании. Среди подобных соединений присутствуют полимеры, способные связываться с клеточными оболочками и частично проникать через клеточные стенки, как поливинилпирролидон (Polyvinylpyrrolidone, PVP) [24], и соединения, используемые в медицине в качестве заменителей плазмы крови (гидрокси-этилкрахмал, декстран) [6, 24].
В последние десятилетия хитозан - производное природного полимера - хитина привлекает внимание многих исследователей в связи с его биосовместимостью, гипоаллергенностью, биодеградируемо-стью и отсутствием токсичности [26]. Благодаря адсорбирующим свойствам хитозана данное соединение, выступая в качестве защитной среды внеклеточного действия, может способствовать снижению количества токсичных метаболитов в межклеточном пространстве криосреды и т.о. повышать выживаемость клеток. Хитозан обладает антиоксидантными, т.е. связывающими кислород свойствами, что может явиться преимуществом при криоконсервации и лиофильном высушивании клеток в его присутствии. Перечисленные свойства данного соединения позволятуспешно использовать его в качестве крио-протектора или вспомогательного вещества в составе многокомпонентных защитных сред при депонировании дрожжей, особенно с учетом его бактерицидных свойств [7].
Прочие сахариды и полисахариды
Лактоза является эффективным протектантом при криохранении Lactobacillusdelbrueckii, S. cere-visiae. Хранение сахаромицетов в смеси 5% лакто-зыс 10% глицериномимеет преимущества перед использованием чистого глицерина или ДМСО [24].
Трегалоза - это натуральный криопротектант, присутствующий в дрожжевых клетках. Как криопротектант для S. Cerevisiae и психрофильных дрожжей используется в концентрациях 5-19% [27, 28].
Величина криопротекторных свойств декстрана зависит от степени его полимеризации, например, для защиты псевдомонад оптимально соединение с молекулярной массой 250-1000 кДа, при 10 кратном снижении молекулярной массы данное соединение значительные защитные свойства не проявляет. Декстранычащевсегонетоксичныдлямикроорганиз-мов, ахимическая инертность позволяет использовать его в смеси с другими криопротекторами в составе многокомпонентных защитных сред [24].
Внеклеточные полисахаридыманнан и глюко-маннан, синтезируемые дрожжами S. Cerevisiae и Hansenulacapsulate были использованы с частичным успехом для повышения выживаемости в жидком азоте некоторых штаммов дрожжей, замороженных с 10% ДМСО или глицерином [29].
Гидроксиэтилкрахмал применяется как индивидуальный криопротекторв концентрации от 2,5 до 25%и в комбинации с 50 % сыворотки или 3,4% бычьего сывороточного альбумина при замораживании
в азоте и хранении S.ceгevisiae [24]. При хранении сахаромицет может быть более эффективен, чем ДМСО или глицерин.
Спирты и их производные. Для криохранения 5". Cerevisiae метанол некоторыми авторами считается не менее эффективным, чем глицерин или ДМСО [24,30]. При ускоренной заморозке сахаромицет этиловый спирт в концентрациях 2-10% в отличие от глицерина проявляет существенные защитные свойства. Данный эффект нивелируется при замедлении скорости охлаждения [30].
Пропиленгликоль (1,2-propanediol) используется в криомикробиологии в концентрациях 5-10%. Является криопротектором для 5. Ceгevisiae [31], эн-томопатогенных микромицетов[ 32].
Маннитолидульцит при заморозке 5. Cerevisiae проявляют худшие свойства по сравнению с глюкозой и глицерином. Инозитол при 5% концентрации, имел незначительный криопротективный эффект для 5. Cerevisiaeи Б. ^агит [24].
Сорбитол используется в криобиологии в концентрациях 1-36 %. Высокий уровень защиты Бас-chaгomycesexiguus в присутствии 10% сорбитола был подтвержден даже через 20 циклов замораживания-размораживания. Наблюдаемый уровень сохранности был похож на таковой при суспендирова-нииэтих же культур с 10 % ДМСО, однако был существенно выше, чем с глицерином или ПЕГ. Сор-битол (2М) может применяться при криопрезерва-ции клеток S. Cerevisiae и Schizosacchaгomycespombe для электропорации [33].
Пептиды, протеины и гликопротеины
Бактериологический пептон в 10% концентрации значительно увеличивает сохранение замороженных 5. Ceгevisiae [24].
У многих видов рыб, насекомых, и растений обнаружены натуральные антифризные белки (АФБ), которые защищают жидкости их тел от заморозки. Натуральные АФБ редко используются для крио-хранения микроорганизмов. Установлено, что химерный АФБ, экспрессированный в 5. ceгevisiae, увеличивает выживаемость дрожжей в два раза после быстрого замораживания в жидком азоте. Внеклеточные гликопротеины, продуцируемые Rhodospoгidiumtoгuloides и дрожжами Lipomy-cesstaгkeyi использовали для повышения выживаемости нескольких штаммов дрожжей, замороженных в жидком азоте в среде с 10% ДМСО или глицерина [24].
Комплексные криосреды
При сравнении жизнеспособности клеток в процессе консервации и последующего хранения установлено явное преимущество использования комплексных защитных сред по сравнению с защитными средами, содержащими какой-либо один крио-протектор. Обязательным свойством соединений, составляющих многокомпонентную среду, является их химическая инертность.
Известна сахарозо-желатиновая среда, содержащая 10% сахарозы и 0,1% агара в 1,5% желатине [34], которая предлагается для хранения бактерий и актиномицетов.
Обезжиренное молоко(10-20 %) с добавлением
глицерина использовали для криоконсервации многих видов бактерий и грибов [24]. При 10 % концентрации глицерина данная среда подходит для замораживания дрожжей S. cerevisiae [35].
Глицерин (10%) в сочетании с 5% лактозой, мальтозой или раффинозой был использован для криоконсервации дрожжей S. cerevisiae и ряда других микроорганизмов.
Триптиказно-соевый бульон (соевый пептон) значительно отличается от других пептонов тем, что содержит также углеводы (около 14% об/об.). Этот вид пептона использовался в концентрациях 0,5-5% в качестве основной среды в нескольких исследованиях по криоконсервации. Криозащитные свойства такого бульона без каких-либо других специфических добавок были обнаружены для сахаромицетов [24].
Факторы выживаемости клеток при хранении
Рассмотрим основные факторы, влияющие на выживаемость клеток при хранении. В первую очередь это физиологическое состояние клеток перед депонированием (определяется выбором среды и условий культивирования), адекватность метода хранения (зависит от выбора криопротекторов, температуры хранения, плотности клеток при заморозке и т.д.) и способа возобновления культивирования (способа и режима размораживания, стартовой питательной среды).
Выбор питательной среды и условий культивирования будет влиять на устойчивость микроорганизмов к воздействию условий хранения. Однозначно правильного ответа на вопрос, какую среду использовать для размножения объекта консервации - полную или минимальную - на сегодняшний момент не существует. В некоторых протоколах рекомендуется предварительное культивирование на питательных средах, содержащих все необходимые для роста дрожжей вещества, так как в данном случае процент жизнеспособных клеток выше. Стресс, вызванный малоблагоприятными условиями минимальной питательной среды, может привести к замедлению скорости роста, которая уже не восстановится после их реактивации [36]. С другой стороны, дефицит питательных компонентов и их истощение со временем является сигналом для реорганизации метаболизма, что ведет к экономии пищевых и энергетических ресурсов. В этом случае клетки готовятся к гипобиозу, и переход в анабиотическое состояние, вероятно, будет более плавным [6]. Выбор правильного соотношения нутриентов в питательной среде может увеличивать резистентность клеток к неблагоприятным факторам при лиофилизации[10].
Известно, что для каждой культуры есть оптимальный диапазон рН, вне которого рост клеток замедлен или вообще отсутствует. Существует корреляция между криорезистентностью пивных и пекарских дрожжей 5. ceгevisiaeи кислотностью среды культивирования. При рН 4,2 эти дрожжи растут быстрее, но их стойкость клиофилизации минимальная [6,10].
Осмотическое давление очевидно не менее важный фактор, чем кислотность среды [36]. Внесение
дополнительных соединений в обычные ростовые среды для подготовки культуры к заморозке может привести как к потере некоторых свойств (способности кбиосинтезу целевых продуктов), так и к полному подавлению роста биомассы.
Размножение микроорганизмов для последующей консервации может проводиться в питательном бульоне, в толще или на поверхности уплотненной среды. Продолжительность предварительного культивирования должна подбираться индивидуально. Единого мнения относительно преимущества глубинного или поверхностного способа культивирования по критериям устойчивости микробных клеток к циклам замораживания-размораживания на сегодняшний момент не существует [6].
Для каждого каталогизированного штамма микроорганизмов определена оптимальная температура инкубирования, которая отражена в паспорте культуры. Многие виды микроорганизмов имеют одинаковые температурные границы. Температурный диапазон роста молочнокислых бактерий 37-52°С [37], а большинства дрожжей - сахаромицетов 25-28°С [6]. Выращивание микроорганизмов в крайних температурных значениях зачастую меняет их метаболизм и увеличивает степень готовности клеток к экстремальным условиям хранения. В некоторых исследованиях с & cerevisiae, когда их температура культивирования снижалась с 30 до 15 °С, наблюдалось увеличение резистентности клеток [6], а клетки, пережившие воздействие высоких температур (но не выше 37°С), могут приобретать термо-и осмоустойчивость [36].
Известно, что толщина клеточной стенки у микроорганизмов варьирует и зависит от возраста клеток. Некоторые микроорганизмы способны формировать капсулы и слизистые слои, выполняющие защитную функцию. В поздних фазах роста при периодическом культивировании или при наступлении неблагоприятных условий роста наблюдается увеличение размеров капсул. Популяция дрожжей состоит изклеток гаплоидной и диплоидной форм, размножающихся вегетативным путем. Если такие диплоидные клетки перенестив среду, содержащую минимум питательных веществ, а также подвергнуть их воздействию температурного стресса (например, хранением при 4°С), то часть из них может перейтив стадию спорообразования [38]. При этом, клетка превращается в аск, содержащий аско-споры, устойчивые к воздействию различных физико-химических факторов [39].
На устойчивость дрожжевых клеток к криокон-сервации влияет также интенсивность аэрацииро-стовой среды. Этот процесс не только обеспечивает клетки необходимым для метаболизма кислородом, но также и способствует их равномерному распределению во всем объеме питательной среды, удаляет некоторые продукты обмена, что ведет к уменьшению чувствительности при заморозке.
Дрожжи сахаромицеты, выращенные в аэробных условиях, являются значительно менее осмочув-ствительными и более криорезистентными в сравнении с такими же дрожжами, предварительное культивирование которых осуществлялось анаэроб-
но. Аэробные дрожжи обнаруживают значительное содержание стеринов, которые играют важную роль в размножении дрожжей [36]. Негативное действие кислорода может проявляться при лиофильном высушивании, вследствие окисления клеточных оболочек и важных строительных компонентов [6, 10].
Возраст культуры и плотность клеток.
Выживаемость микроорганизмов при хранении во многом зависит от возраста культуры и времени, прошедшего после пересева. Наиболее жизнеспособными являются культуры, находящиеся в конце логарифмической фазы роста или в началестацио-нарной [6, 10]. Это особенно заметно при лиофильном способе консервацииклеток.Существенное значение имеет также и плотность клеточной суспензии при замораживании. Увеличение плотностиувели-чивает шансы сохранения культуры даже при низком уровне выживаемости клеток, но в то же время способствует возрастанию концентрации токсических метаболитов и приводит к учащению клеточ-ныхконтактов, что негативно сказывается на жизнеспособности. Большинство культур микроорганиз-мовлучше всего замораживать при исходных концентрациях 108-1010 клеток/мл [6, 19].
Промежуточный этап, сразу после внесения микроорганизмов в криосреду и до замораживания, называется уравновешивание или эквилибрация. В течение этого периода происходит стабилизация структур клетки, проникновение внутриклеточных криопротектантов и, таким образом, подготовка микроорганизмов к замораживанию [24, 40]. Биохимические процессы, протекающие в клетках втече-ние времени уравновешивания (обычно - 10—60 минут при 0-10°С) имеют как положительный, так и отрицательный характер. Требуемая продолжительность эквилибрации зависит от проницаемости клеток для криопротектанта и скорости проникновения криопротектора в клетки. ДМСО или метанол, как быстро проникающие протектанты (в интервале 1060 мин при 0-10 °С), не требуют длительных периодов уравновешивания, обычно15 мин при 4°С достаточно [24, 41]. В случае использования глицери-напериод эквилибрациидолжен быть длиннее (1-4 ч), атемпература выше [42].
Многие клетки, в особенности эукариотические, весьма чувствительны к осмотическому давлению среды. Поэтому чтобы свести к минимуму осмотический стресс при использовании таких протектан-тов, как, ДМСО, его следует вносить постепенно и при температуре около 4 °С.
Заключение
Разнообразие методов консервации определяется физиологическими и биохимическими особенностями микроорганизмов. Обнаружение новых видов микроорганизмов, совершенствование техники выделения, позволяющее использовать в работе не культивируемые ранее микроорганизмы, требует соответствующего развития методов их хранения. Для сохранения исходных свойств каждой группы микроорганизмов необходим индивидуальный подход при выборе предварительной подготовки культуры к консервации, метода консервации и после-
дующего возобновления культивирования. Создание же новых методов должно опираться на знание естественных механизмов адаптации микроорганизмов к стрессовым условиям, помогающим клеткам выживать в природных сообществах.
При депонировании ценных штаммов микроорганизмов лучше всего использовать несколько различных методов хранения, что с учетом разнообразия выбора технических средств в настоящее время совсем несложно.
Литература
1. JohnG. Day, GlynStacey.Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols.Springer Science & Business Media, 2007.347p.
2.YeastGrowthProtocols [Электронныйресурс]. - Режим доступа: http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/yeast-growth-protocols.html, свободный.
3. Методические указания к занятиям спецпрактикума по разделу «Микология. Методы экспериментального изучения микроскопических грибов» для студентов. / Авт.-сост. В.Д. Поликсенова, А.К. Храмцов, С.Г. Пискун, Изд-во: БГУ, Минск, 2004. 36 с.
4. Е.П. Феофилова.Пигменты микроорганизмов. Изд-во: Наука, Москва.1974. 218 с.
5. Н.С. Егоров. Промышленная микробиология, Изд-во.:Рипол Классик, «ВШ», Москва.1989. 688 с.
6. В.Д. Похиленко, А.М. Баранов, К.В. Детушев. Изв. ВУЗов. Поволж. Рег. Мед. Науки. 4. 12.99-121. (2009).
7. Г.И.Садикова,С.В.Борисова, И.Д.Гурьянов,Вестник КТУ.19. 16. 155-157. (2016).
8. М.Н.Пименова, Н.Н. Гречушкина, Л.Г.Азова, А.И. Нетрусов и др. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. Изд-во: МГУ, Москва, 1995. 224с.
9. J. Sourek, Int. J. ofSyst. Bact., 24, 3, 358-365. (1974).
10. T. Uzunova-Doneva, T. Donev. J.Cult. Collect. 4. 17-28. (2005).)
11. G. Luna-Solano, M.A. Salgado-Ervantes, M. Ramirez-Lepe, M.A. Garcia-Alvarado and G.C. Rodriguez-Jimenes,J. FoodProc. Eng.26. 2.135-147. (2003).
12.Производство сушеных дрожжей [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.prosushka.ru/279-proizvodstvo-sushenyx-drozhzhej.html,свободный.
13. В.И. Сафронова, Ю.С. Оследкин, О.В. Свиридова, Н.И. Воробьев. Методы консервации коллекционных культур микроорганизмов. Изд-во: ГНУ ВНИИСХМ, Спб. 2007. 32 с.
14. L. Homolka, In book: Laboratory Protocols in Fungal Biology: Current Methods in Fungal Biology. Springer, 2013. P. 9-16.
15. Криоморозильники, -150°C...-175°С[Электронныйресурс]. - Режимдоступа: http://cryogt.com/ru/product-category/cryo-freezer/, свободный.
16. Вертикальный низкотемпературный морозильник MDF-U4186S [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http: //www. awt.ru/ catalog/morozilniki-
nizkotemperaturnye/panasonic-sanyo-mdf-u4186s/, свободный.
17. О.А. Савкина, Г.В. Терновской, М.Н. Локачук, Е.Н. Павловская, В.И. Сафронова. Сельскохозяйств. биол. Санкт-Петербург. 4. 112-119. (2014).
18. T. Donev. Methods for Conservation of Industrial Microorganisms. Sofia, 2001. 93р.
19. K. A. Malik, D. Claus.Rev. Biotech. & Gen. Eng. 5. 137-197.(1987).
20. Microbank™ Worldwide Performance Portfolio [Электронныйресурс]. - Режимдоступа:http://www.pro-lab-dkect.com/v/vspfiles/microbank/microbank-wwp-portfolio.pdf, свободный.
21. K. A. Malik,World J. of Microbiol.Biotechnol. 8. 80-82.(1992).
22. A. Criste,M. Giuburunca, O. Negreal, N. Fit,Scientific Papers: Animal Science and Biotechnologies, 47. 2. 67-72.(2014).
23. D. Tao, P.H.Li, J. Theor. Biol., 123. 305-310. (1986).
24. Z.Hubalek, Cryobio. 46.3. 205-229. (2003).
25. D.C. Fomin, I.S. Alycheva, L.I. Veselovskaya, S.M.Tatchin, Antibacterial properties of dimethylsulphoxide (in Russian), in: Khimioterapiainfektsiyilekarstven-noyustoychivostipatogennychmikroorganizmov, Moskva, 1973, P. 63-64.
26. К.Г. Скрябин, Г.А.Вихорева, В.П.Варламов. Хитини-хитозан: Получение, свойства и применение, Изд-во:Наука, Москва, 2002. 360 с.
27. E. Breierova, Cryo-Letters, 15. 191-197.(1994).
28. L. Diniz-Mendes, E. Bernardes, P.S. de Araujo, A.D. Panek, V.M.F. Paschoalin, Biotechnol. Bioengin. 65. 572-578.(1999).
29. E. Breierova, A. Kockova-Kratochvilova, Cryobiol., 29. 385-390.(1992).
30. J.G. Lewis, R.P. Learmonth, K. Watson, Cryobiol., 31.193-198. (1994).
31. Н.М. Пересецкая,Пробл. криобиол. 3. 56. (1993).
32. B. Sandskar, B. Magalhaes, Cryobiol., 31. 206-213.(1994).
33. M.Suga, M. Isobe, T. Hatakeyama, Yeast, 16.889-896. (2000).
34. Данилова М.В. Надирова И.М. Кудрявцев В.И. Лио-филизация бактерий. Методы хранения коллекционных культур микроорганизмов. Наука, Москва, 1967. 131с.
35. J.L. Schmidt, M. Diez, J. Lenoir, Sci. Alim. 11. 653-672.(1991).
36. Т.В.Меледина, С.Г.Давыденко, Л.М.Васильева, Физиологическое состояние дрожжей: Учеб. посо-бие.НИУИТМО; ИХиБТ, СПб., 2013. 48 с.
37. W. P. Hammes, R. F. Vogel,BlackieAcad.Press.,19-54. (1995).
38. Бабаева И.П. Биология дрожжей. Мир, Москва,1992. 96с.
39. В.Л. Пономарева, И.П. Высеканцев, Е.С. Онасенко, Естественные науки. 7. 28. 129-134. (2014).
40. J.G. Day, M.R. McLellan (Eds.), Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols, Humana Press, Totowa, NJ, 1995.
41. W. Zeroual, J.M. Millot, C. Choisy, M. Manfait, Biospec-troscopy. 1. 365-373. (1995).
42. G. Mata, D.Salmones, R. Perez, G. Guzman, Rev. Microbiol. 25. 197-200.(1994).
© Г. Х. Габитова, магистрант каф. технологии пищевых производств КНИТУ, [email protected]; М. З. Шайдуллина, магистрант той же кафедры, [email protected]; И. Д. Гурьянов, к.б.н., доцент той же кафедры, [email protected]; О. А. Решетник, д.т.н. проф., зав. каф. технологии пищевых производств КНИТУ, [email protected].
© G. Kh. Gabitova, master student of Department of Food Manufactures, KNRTU, [email protected]; M. Z. Shaiiliillina. master student of Department of Food Manufactures, KNRTU, [email protected]; 1 D. Guryanov, candidate of biological science, assistant professor of Department of Food Manufactures, KNRTU, [email protected]; O. A. Reshetnik, Dr. of technical science, Professor, Head of Department of Food Manufactures, KNRTU, [email protected].
