CC BY
34
УДК 543.4:544.2
Г. И. Садикова, И. Д. Гурьянов, С. В. Борисова ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ХИТОЗАНА ПРИ ДЕПОНИРОВАНИИ ХЛЕБОПЕКАРНЫХ ДРОЖЖЕЙ
Ключевые слова: хитозан, Saccharomyces cerevisiae.
В работе по определению бродильной энергии объемным методом установлено, что предварительное культивирование дрожжей на средах с 1 % хитозана приводит к снижению мальтазной и зимазной активности и повышению осмочувствительности клеток, при этом среда с минимальным содержанием хитозана в опыте не способствует статистически достоверному изменению подобных показателей. Полученные результаты позволяют утверждать, что использование хитозана при депонировании S. cerevisiae R2 с учетом его известных бактерицидных свойств целесообразно.
Keywords: chitosan, Saccharomyces cerevisiae.
In the work devoted to identification of fermentation energy by volumetric method was determined thatpre-cultivation of yeast on media containing 1% of chitosan leads to a decrease of maltase and zymase activity and increase of cells' osmotic sensitivity; wherein the medium with a minimum content of chitosan does not contribute to a statistically significant change in these indicators. The results suggest that the use of chitosan when depositing of S. cerevisiae R2 is appropriate because of its well-known bactericidal properties.
Введение
В начале прошлого века, в связи с появлением большого количества культур микроорганизмов, представлявших значительный интерес для науки и практики, возникла необходимость разработки способов их депонирования, гарантирующих сохранение активности и свойств клеток. Разработанные методы, основанные на бактериостазе, например, хранение при температурах -20°С, -70°С и т.д. подходят в основном для долгосрочного хранения. Замораживание микробной биомассы и последующее восстановление из замороженного состояния может привести к гибели большей части культуры. Лиофилизация повышает выживаемость клеток, но её существенным недостатком является то, что в первых пересевах большинство микроорганизмов обладает пониженной жизнеспособностью [1], а дрожжи вообще плохо переносят этот процесс [2]. Культуры, прошедшие процесс лио-филизации и заморозки, рекомендуется использовать только после 2-3 пересевов на питательных средах, соответствующих потребностям микроорганизмов. Для краткосрочных способов хранения широко распространенным и простым способом поддержания коллекций живых культур являются периодические пересевы на свежие питательные среды. Однако по мере увеличения объема коллекции это становится все более трудной задачей, поскольку при этом повышается риск обезвоживания культур и их гибели. Частично эта проблема решается при хранении микроорганизмов в толще полужидкого питательного агара (т.е. 0.6 % вес/объем). Иногда для подавления посторонней микрофлоры в субстрат добавляют антибиотики или какие-либо другие бактерицидные соединения. В качестве криопротекторов при депонировании могут выступать некоторые природные биополимеры [3]. В последние два десятилетия хитозан является одним из самых привлекательных биополимеров с бактерицидными свойствами, которые наряду с отсутствием токсичности, биосовместимостью, гипо-аллергенностью и биодеградируемостью, позволяют использовать его в качестве альтернативы и/или вспомогательного вещества в антимикробной тера-
пии, особенно по отношению к ряду бактериальных штаммов, резистентных к классическим антибиотикам [4].
В данной работе проводился анализ эффективности использования хитозана в составе питательных сред для поддержания и сохранения хлебопекарных штаммов Saccharomyces cerevisiae.
Экспериментальная часть
Использовали следующие среды и растворы: питательная среда «Сабуро», сусло-агар, 3 % раствор пищевого хитозана, 10 % раствор глюкозы, 10 % раствор мальтозы.
Мальтазная и зимазная активность дрожжей X cerevisiae R-2 оценивалась по стандартной методике [5]. Осмочувствительность, как характеристика отношения хлебопекарных дрожжей к дозировке поваренной соли, исследовалась по методике Н.М. Семихатовой [6].
При возобновлении культивирования микроорганизмов и выведении их из инактивированного состояния в первую очередь необходимо оценить жизнеспособность клеток, составляющих культуру. Косвенно этот показатель можно определить по скорости накопления биомассы в течение определенного времени. В нашей работе также оценивалась способность производственного штамма X cerevisiae R2 накапливать биомассу на обычной и модифицированных средах Сабуро (рис.1) и сусло-агаре (рис.2) в течение 96 часов.
В опытных вариантах с добавлением хитозана в количестве 0,5 % и 1 % скорость роста сахаромицетов была незначительно ниже по сравнению с контролем. С трёх чашек Петри из контрольных образцов на 96 часов опыта в среднем было получено около 3 грамм сухой биомассы. В варианте опыта с 0,25 % хитозана в среде рост на 72 часа культивирования превышал контрольный на 42 %. Таким образом, внесение хитозана в дрожжевую среду может стимулировать рост X cerevisiae R2.
Продолжительность культивирования, ч
Рис. 1 - Накопление биомассы & cerevisiae R2 на традиционной (К) и модифицированных средах Сабуро (среды содержащие 0,25 % (1), 0,5 % (2) и 1 % (3) хитозана)
Продолжительность культивирования, ч
Рис. 2 - Мальтазная (А) и зимазная (Б) активность дрожжей & cerevisiae R2, выращенных на традиционном (К) и модифицированном сусло-агаре (среды содержащие 0,25 % (1), 0,5 % (2)и 1% (3) хитозана)
Большое значение для производств, связанных с использованием дрожжей, имеет показатель бродильной энергии. Самым распространенным методом изучения бродильной активности дрожжей является определение количества углекислого газа, выделяемого при ферментативном гидролизе субстратов - сахаров. Мальтазная активность определяется временем, затраченным на выделение 10 мл СО2 при сбраживании 1 г мальтозы 0,5 граммами дрожжевой биомассы. Сокращение
продолжительности этого процесса благоприятно сказывается на интенсификации производства. Хитозан, теоретически, может по-разному влиять на этот показатель. По данным литературы данное соединение может служить пищевым субстратом для дрожжей, но с учетом его реологических свойств можно ожидать неспецифическое ингибирование мальтазной и зимазной активностей, связанных с изменением вязкости микроокружения клеток и доступности субстрата.
На рисунках 3 и 4 представлены показатели мальтазной (А) и зимазной (Б) активности после культивирования дрожжей на контрольной и опытных питательных средах с различной концентрацией хитозана. Предварительное культивирование & cerevisiae R2 на среде с 1 % хитозана привело к
снижению мальтазной и зимазной активности на 29,3 и 10,7 % на среде Сабуро и на 21,4 и 14,2 % на сусло-агаре, соответственно. Среда с минимальным количеством хитозана не способствует статистически достоверному снижению подобных показателей.
120
А Б
Рис. 3 - Мальтазная (А) и зимазная (Б) активность дрожжей & cerevisiae R2, выращенных на традиционной (К) и модифицированных средах Сабуро (среды содержащие 0,25 % (1), 0,5 % (2)и 1% (3) хитозана)
120
А Б
Рис. 4 - Мальтазная (А) и зимазная (Б) активность дрожжей & cerevisiae R2, выращенных на традиционном (К) и модифицированном сусло-агаре (среды содержащие 0,25 % (1), 0,5 % (2)и 1% (3) хитозана)
Осмочувствительность - это свойство дрожжей снижать бродильную активность в средах с повышенным осмотическим давлением. Оно является также хорошим показателем устойчивости ферментов дрожжей.
Осмочувствительные хлебопекарные дрожжи медленнее поднимают тесто с повышенным содержанием соли и сахара. Настоящий метод определения осмочувствительности является общепринятым и используется в заводских лабораториях с целью выявления пригодности данной партии дрожжей для приготовления сдобного теста, содержащего повышенное количество сахара. В работе допустимые показатели осмочувствительности были получены в контрольном и первом варианте опыта (дрожжи, выращенные на среде с 0,25 % хитозана).
Сравнивая опытные варианты сред, следует отметить, что добавление хитозана в ряду концентраций 0,25-0,5-1 % не способствовало пропорциональному увеличению скорости роста & cerevisiae R2 и показало снижение бродильной активности по сравнению со стандартной используемой средой. Однако, принимая во внимание известную антимикробную активность данного соединения, его способность на определённых питательных средах и в некоторых концентрациях стимулировать рост, считаем, что его использование целесообразно. Необходимо отметить, что бактерицидные свойства находятся в прямой зависимости от молекулярной массы хитозана, выбранного для эксперимента.
Полученные результаты позволяют нам утверждать, что оптимальными питательными средами для депонирования сахаромицет являются среды, содержащие 0,25 - 0,5 % хитозана.
Выводы
1. Способность хитозана стимулировать рост хлебопекарных дрожжей на различных питательных средах, индивидуальна, но в целом его использование целесообразно.
2. Предварительное культивирование & cerevisiae R2 на среде с 1 % хитозана снижает мальтазную и зимазную активность на 29,3 и 10,7 % на среде Сабуро и 21,4 и 14,2 % на сусло-агаре,
соответственно. Среда с минимальным количеством хитозана не способствует статистически достоверному снижению подобных показателей.
3. Добавление хитозана в среду культивирования S. cerevisiae R2 повышает осмочувствительность дрожжевых клеток.
4. Среднесрочное депонирование S. cerevisiae R2 в среде с хитозаном не влияет на возобновляемость культуры.
5. Содержание в питательной среде хитозана в концентрации 0,25-0,5% является оптимальным для депонирования S. cerevisiae R2.
Литература
1. Y. Miyamoto-Shinohara, F. Nozawa, J. Sukenobe, T. Imaizumi, J. Gen. Appl. Microbiol., 56, 107-119 (2010).
2. М. Б. Куплетская, А. И. Нетрусов, Микробиология, 80, 6, 842-846 (2011).
3. А.В. Кантерова, В сб. Проблемы криобиологии 18, 2, Ин-т микробиол. НАН Бел, Минск, 2008, С. 213.
4. Е.В. Гладкова, И.В. Бабушкина, И.А. Мамонова, С.В. Белова, Вестник новых медицинских технологий, Эл. изд., 1 (2013).
5. Инструкция по микробиологическому и технохимическому контролю дрожжевого производства [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://docs.cntd.ru/document/1200069192, свободный.
6. Н.М. Семихатова Хлебопекарные дрожжи. Пищевая промышленность, Москва. 1980. 280 с.
© Г. И. Садикова, м.н.с. OpenLab "Репрограммирование соматических клеток" Института фундаментальной медицины и биологии КФУ, [email protected]; И. Д. Гурьянов, к.б.н., доцент кафедры технологии пищевых производств КНИТУ, [email protected]; С. В. Борисова, к.т.н. доцент той же кафедры, [email protected].
© G. 1 Sadikova, junior scientist, OpenLab "Reprogramming of somatic cells" Institute of fundamental medicine and biology, Kazan Federal University, [email protected]; I. D. Guryanov, candidate of biological science, assistant professor of Department of Food Manufactures, Kazan National Research Technological University, [email protected]; S. V. Borisova, candidate of technical science, assistant professor of Department of Food Manufactures, Kazan National Research Technological University, borsv 13 @yandex.ru.
