Способ выделения катехина из корневищ с корнями Comarum palustre L Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Бюллетень Брянского отделения РБО, 2014. № ¡(S). С. 71-74.

Bulletin of Bryansk dpt. of RBS, 2014.

N 1(3). P. 71-74.

ФИЗИОЛОГИЯ И БИОХИМИЯ РАСТЕНИЙ

УДК 547.836

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ КАТЕХИНА ИЗ КОРНЕВИЩ С КОРНЯМИ COMARUMPALUSTRE L.

The method of the isolation of catechin from rhizomes with roots of Comarum palustre L.

© О.А. Ёршик, Г.Н. Бузук O.A. Yorshyk, G.N. Buzuk

УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет», кафедра фармакогнозии с курсом ФПК и ПК 210023, Республика Беларусь, г. Витебск, пр-т Фрунзе, 27. Тел.: +375 (29) 590-82-90, e-mail: slawavgmu@mail.ru

Аннотация. В статье предложен способ выделения катехина из корневищ с корнями Comarum palustre L. методом колоночной хроматографии на сорбенте Sephadex. Чистоту катехина контролировали методом высокоэффективной жидкостной и тонкослойной хроматографии.

Ключевые слова: Comarum palustre L., катехин, Sephadex.

Abstract. The paper proposes a method of the isolation of catechin from rhizomes with roots of Comarum palustre L. by the column chromatography method on Sephadex sorbent. Purity of catechin was verified by HPLC and TLC.

Keywords: Comarum palustre L., catechin, Sephadex.

Введение

В современной медицинской практике широко применяется лекарственное растительное сырье сабельника болотного (корневище с корнями, трава). На их основе выпускают биологически активную добавку (БАД) «Сабельник-Эвалар» (настойка, таблетки, крем, капли), которая рекомендована Минздравом РФ в качестве общеукрепляющего средства при повышенных нагрузках на опорно-двигательный аппарат.

Химический состав сабельника болотного представлен полифенольным комплексом, в котором преобладают дубильные вещества, главным образом конденсированные.

Конденсированные дубильные вещества - линейные полимерные производные катехи-нов, лейкоантоцианидинов и других восстановленных форм флавоноидов. Как правило, представляют собой линейные полимеры, отдельные мономеры (катехины и лейкоантоциа-нидины, соединенные С2-С6 связью) которых способны к ограниченному вращению вокруг соединяющей их связи, в результате чего молекула может приобретать стабильную спиральную конформацию с фенольными гидроксилами, расположенными по периферии такой спирали. Помимо высокополимерных, в растениях также содержатся олигомерные производные проантоцианидинов со степенью полимеризации 1 -1O.

В список продуктов питания, богатых мономерными катехинами, входят виноград, клюква, яблоки, бобы, оболочки арахиса, пшеница, ячмень, какао и изделия из него, кофе, чай всех видов, особенно черный.

Катехины семян винограда обладают антиоксидантной активностью в водной фазе: снижают интенсивность свободнорадикального окисления липопротеинов низкой плотности у больных ишемической болезнью сердца, замедляют липосомальное окисление.

Известен способ выделения катехина, заключающийся в экстракции этилацетатом водной фракции, полученной флэш-хроматографией на тальке.

Недостатком данного способа является необходимость проведения сорбции, совмещенной с флэш-хроматографией, образование эмульсии при экстракции из водного раствора, невысокая степень очистки этилацетатом.

Существует способ, при котором выделяют катехин из бутанолрастворимых фракций этилацетатных экстрактов методом колоночной хроматографии.

Недостатком способа является его длительность (около 3 суток), невысокая степень очистки этилацетатом, выполнение анализа сопряжено с применением таких токсических растворителей как этилацетат, бутанол, хлороформ и метанол.

Задача изобретения - разработка простого и дешевого способа выделения катехина, позволяющего получать его в чистом виде для дальнейшего использования в производстве препаратов фенольных соединений.

Материалы и методы

В качестве объекта исследования использовали три серии образцов растений сабельника болотного, заготовленных в сентябре 2013 г. в местах естественного произрастания в окрестностях г. Витебск Республики Беларусь. Собранные растения высушивали целиком, затем разделяли на органы. До проведения анализов образцы хранились в бумажных пакетах при комнатной температуре.

Результаты и их обсуждение

Данная задача решается экстракцией корневищ с корнями сабельника болотного водно -спиртовой смесью и выделением катехина колоночной хроматографией на микропористом сорбенте Sephadex, совмещая стадии разделения и очистки катехина, с последующим элюи-рованием катехина 96% спиртом этиловым.

Около 100 г корневищ с корнями сабельника болотного, измельчённых до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром пор 1 мм, экстрагируют 4000 мл 70% спирта этилового на кипящей водяной бане в течение 20 минут. Готовое извлечение охлаждают и центрифугируют со скоростью 1000 об/мин в течение 15 минут. Колонку, содержащую микропористый сорбент Sephadex ^Ш0100 с диаметром пор 25-100 ц), предварительно кондиционируют 96% спиртом этиловым и пропускают полученное извлечение. Затем элю-ируют 96% спиртом этиловым со скоростью 1 мл/мин. Весь элюат, пропущенный через колонку, собирают. Элюирование проводят до тех пор, пока при 280 нм значение оптической плотности новых порций элюата не будет постоянным. В качестве раствора сравнения при спектрофотометрии используют воду очищенную. Раствор полученной фракции выпаривают, высушенный остаток растворяют в 96% спирте этиловом.

Определяют состав и чистоту полученной фракции методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). Для этого на линию старта пластинки «Сорбфил ПТСХ-В» в виде полосы длиной 1 см наносят 5 мкл полученной фракции и 5 мкл стандартного образца катехина также в виде полосы 1 см. Хроматографическую пластинку помещают в камеру, которую предварительно насыщают в течение 2 часов смесью растворителей, содержащую этилацетат:метанол:воду:муравьиную кислоту безводную (8,5:0,3:0,35:0,4). Пластинку хроматографируют восходящим способом. Когда фронт растворителей пройдет около 10 см, пластинку вынимают из камеры и сушат на воздухе до полного удаления растворителей. Для обнаружения катехина хроматограмму погружают в раствор 1 г/л ванилина в 96% спирте этиловом, затем - в раствор 10 г/л кислоты серной в 96% спирте этиловом и выдерживают в сушильном шкафу при температуре 100-105 оС в течение 5 минут. На хромато-грамме полученной фракции наблюдают зону адсорбции с Rf 81-84 красного цвета, соответствующую аналогичной зоне адсорбции стандартного образца катехина (И" 81-84).

Определяют состав и чистоту полученной фракции методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЖЭХ). В качестве стандартного образца используют катехин,

растворенный в 1 мл 70% метанола водного. Исследования проводят на колонке 2огЪах 8Б-С18 (4,6^250 мм), температура колонки - 20°С. Хроматографический анализ проводят в градиентном режиме (табл. 1).

Таблица 1

Градиентный режим хроматографического анализа

Время анализа, мин Растворитель А Растворитель В

0 100 0

0-60 100—»40 0—60

60-65 40—0 60—100

Подвижная фаза: растворитель А: 1% водный раствор уксусной кислоты; растворитель В: смесь метанола:растворителя А (60:40). Скорость подачи элюента 1 мл/мин, для детектирования применяют УФ-детектор (Х=280 нм).

На хроматограмме полученной фракции (табл. 2) наблюдают хроматографический пик №2, соответствующий по времени удерживания стандартному веществу катехина ^=43,6) с максимумом поглощения при 279 нм. Хроматографический пик №1 - растворитель (70% метанол водный).

Таблица 2

Хроматографические характеристики пиков

№ пика 1Е(мин) S (mAU*s) S, %

1 3,4 19,7 0,3

2 43,6 6177,3 99,7

При хроматографировании выделенной фракции корневищ с корнями сабельника болотного обнаружена только одна хроматографическая зона, по значениям Rf (ТСХ), спектральным характеристикам и времени удерживания (ВЭЖХ) соответствующая катехину.

Заключение

Предложенный способ выделения позволяет получить очищенную фракцию катехина, пригодную для дальнейшего изучения ее качественного и количественного состава методом высокоэффективной жидкостной и тонкослойной хроматографии.

Разработанный способ выделения катехина позволяет получать его в чистом виде. Это дает возможность использовать корневища с корнями сабельника болотного в качестве источника фенольных соединений для получения из них препаратов. Данный метод не требует использования дорогостоящего оборудования и специфических органических растворителей.

Список литературы

Жукова О.Л. Фитохимическое изучение сабельника болотного, сухого экстракта на его основе и их стандартизация: автореф. дис. ... канд. фарм. наук. Всерос. науч.-исслед. ин-т. лек. и аромат. растений. М., 2007. 21 с.

Иванова С.З. Фенольные соединения луба лиственницы сибирской и лиственницы гмелина // Химия растительного сырья. 2011. № 2. С. 107-112.

Люкшенкова Е.Я., Георгиу М., Бурдыкина-Шехтер Э.А. Фармакологическое изучение сабельника болотного (Comarum palustre L.) // Аптечное дело. 1962. N° 2. С. 34-44.

Птицын А.В. Технология выделения флавоноидов винограда Vitis vinifera сорта «Изабелла» для косметики и изучение их свойств: автореф. дис. ... канд. хим. наук. Всерос. науч.-исслед. ин-т. лек. и аромат. растений. М., 2007. 26 с.

Спрыгин В.Г., Кушнерова Н.Ф. Природные олигомерные проантоцианидины - перспективные регуляторы метаболических нарушений // Вестник ДВО РАН. 2006. № 2. С. 81-90.

Чемесова И.И. Определение содержания дубильных веществ в корневищах Comarum palustre L. и настойке из него спектрофотометрическим методом // Растительные ресурсы. 2004. Вып. 3. С. 122-129.

Baba S. Absorption and urinary excretion of procyanidin B2 [epicatechin-(4P-8)-epicatechin] in rats // Free Radical Biology & Medicine. 2002. Vol. 33. N 1. P. 142-148.

Bourvellec C., Renard C.M. Non-covalent interaction between procyanidins and apple cell wall material. Part II: Quantification and impact of cell wall drying // Biochimica et Biophysica Acta. 2005. Vol. 1725. P. 1-9.

HagermanAnnE. Miami University's centralized web server for personal web pages [Электронный ресурс]. Tannin Chemistry. Oxford. 2002. Режим доступа: http://www.users.muohio.edu/hagermae/tannin.pdf. Дата обращения: 1.10.2006.

Lolito S.B. Influence of Oligomer Chain Length on the Antioxidant Activity of Procyanidins // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2000. Vol. 276. N 3. P. 945-951.

Lou H.X. A-type procyanidins from peanut skin // Phytochemistry. 1999. Vol. 51. P. 297-308.

McCallum J.A., Walker J.R.L. Proanthocyanidins in Wheat Bran // Cereal Chem. 1990. Vol. 67. N 3. P. 282-285.

Natsume M. Analyses of polyphenols in cacao liquor, cocoa, and chocolate by normal-phase and reversed-phase HPLC // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2000. Vol. 64. P. 2581-2587.

Sprygin V.G., KushnerovaN.F. Cranberry: a new source of oligomeric proanthocyanidins // Pharmaceutical Chemistry Journal. 2004. Vol. 38. N. 2. P. 100-104.

Сведения об авторах

Ёршик Ольга Александровна

кфарм.н., доцент кафедры фармакогнозии с курсом ФПК и ПК УО «Витебский государственный медицинский университет», Витебск E-mail: SlawaVGMU@mail.ru

Yorshyk Olga Alexandrovna

Ph.D. in Pharmaceutical science, Ass. Professor of the Department of Pharmacognosy Vitebsk State Medical University, Vitebsk E-mail: SlawaVGMU@mail.ru

Бузук Георгий Николаевич

д. фарм. н., профессор, заведующий кафедрой фармакогнозии с курсом ФПК и ПК УО «Витебский государственный медицинский университет», Витебск E-mail: buzuk@tut.by

Buwk Georgy Nicolaevich

Sc.D. in Pharmaceutical science,

Professor, Head oof the Department of Pharmacognosy

Vitebsk State Medical University, Vitebsk

E-mail: buzuk@tut.by