CC BY
99
УДК 619:615.286.435.31:732.3/6.1
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОАНТОЦИАНИДИНОВ В САБЕЛЬНИКЕ БОЛОТНОМ COMARUM PALUSTRE L
Л. В.ТИТОВИЧ, Н. Г.ТОЛКАЧ
УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины» г. Витебск, Беларусь
(Поступила в редакцию 19.01.2018)
В статье предложена методика количественного определения проантоцианидинов в различных вегетативных органах сабельника болотного спектрофотометрическим методом, основанная на кислотном гидролизе указанных соединений до антоцианиди-
нов в присутствии катализатора (ионовРв3+). Подобраны оптимальные условия извлечения суммы проантоцианидинов из растительного сырья сабельника болотного. Расчет содержания проантоцианидинов проводился с использованием удельного показателя поглощения, определенного для очищенной суммы проантоцианидинов, выделенных из
сырья сабельника болотного. Установлено, что наибольшее содержание проантоцианидинов сабельника болотного локализуется в стеблях и корневищах с корнями, что позволяет рекомендовать указанные вегетативные органы в качестве лекарственного растительного сырья сабельника болотного.
Ключевые слова: сабельник болотный, определение, проантоцианидины, методика, экстрагент.
The article examines methodics of definition of proanthocyanidins in different organs of Comarum palustre are suggested by spectror- hotometric ways based on acid hydrolysis of
indicated combinations into anthocyanidins (ions Fe3+ acting as catalyst). Set optimal conditions have been cveated for the extraction of a sum ofproanthocyanidins out of vegetable raw substance material of Comarum palustre. The calculation of proanthocyanidins content was conducted with the use of a specific indicator of absorbtion which was estimated for purified mixture of proanthocyanidins out of vegetable raw substance material of Comarum
palustre. The relative inaccuracy of the suggested methodics ave notable for good results reproduction and its execution does not reguire Standard samples. The greatest contents of proanthocyanidins discovered in stems and rhizomes which allow to recommend the indicated organs of Comarum palustre as medical vegetable substance.
Key words: comarum palustre, definition, proanthocyanidins, methodics, extragent.
Введение. На сегодняшний день в условиях промышленного животноводства и концентрации значительного поголовья крупного рогатого скота на ограниченной территории увеличивается риск возникновения и распространения паразитозов. Поэтому важным аспектом успешного развития животноводства является благополучие хозяйств по инвазионным заболеваниям. Многие паразитарные болезни наносят огромный экономический ущерб из-за падежа животных, снижения прироста массы, недополучения приплода, больших затрат на проведение лечебно-профилактических мероприятий.
Часто паразитозы, например, такие как стронгилятозы желудочно-кишечного тракта крупного рогатого скота при своей широкой распространенности в республике, протекают без выраженных клинических симптомов, но больные животные отстают в росте и развитии и по этой причине нередко выбраковываются.
По мнению большинства исследователей, широкое распространение и большой экономический ущерб от паразитарных болезней сельскохозяйственных животных объясняется большой репродуктивной способностью гельминтов, устойчивостью яиц к факторам внешней среды низкой результативностью оздоровительных мероприятий.
Наиболее перспективными направлениями исследований на сегодняшний день являются поиск и организация производства новых отечественных противопаразитарных средств растительного происхождения. Связано это, с возможностью наличия остаточных количеств синтетических препаратов в животноводческой продукции и, в конечном итоге, неблагоприятном воздействии на человека. В отличие от синтетических, лекарственные средства из растительного сырья обладают малой токсичностью, экологической безопасностью, значительно лучшей переносимостью, возможностью длительного приема.
Одним из таких перспективных растений является сабельник болотный, содержащий различные вещества, действующие губительно на микроорганизмы, простейших и гельминтов. Однако несмотря на широкое использование сабельника болотного в медицине, для практики ветеринарной медицины официнальные препараты из этого растения не разработаны. Нет также данных о влиянии сабельника болотного на организм животных. Поэтому актуальным является получение лекарственных форм из сабельника болотного, разработка новых лекарственных средств и их дальнейшая стандартизация.
Анализ источников. Сабельник болотный представляет собой небольшой многолетний полукустарник с длинным деревенеющим подземным стеблем. Надземная часть стебля - приподнимающиеся ветви. В нижней части ветви голые с блестящей поверхностью буровато -пурпурного или ржаво-бурого цвета, в верхней - зеленые, густо опушенные. Стебель постепенно переходит в длинное (до 1 м) горизонтальное корневище, которое имеет гладкую блестящую поверхность бурого цвета; наиболее старые его участки - черно-бурого цвета. В узлах корневище выпускает тонкие нитевидные корни длиной 5-10 см [1-3].
Листья сложные непарноперистые; нижние состоят из 5-7 листочков, на длинном черешке, у основания расширенном в виде стеблеобъ-емлющего влагалища; верхние - из 3-5 листочков, с прилистниками, к основанию сросшимися с черешком. Отдельные листочки сложного
листа продолговато-ланцетные, острозубчатые, сверху темно-зеленого цвета, снизу беловато-зеленые или почти белые от обилия волосков. Жилки выдаются с нижней стороны листа, часто темно-пурпурного цвета. Соцветие рыхлое из немногочисленных цветков, олиственное. Цветоножка выходит из пазух листьев, густо опушена.
Цветки имеют двойную чашечку, разрастающуюся при созревании плодов. Чашелистиков 10; из них 5 наружных (подчашие) - маленькие, узкие; внутренние чашелистики значительно крупнее и шире наружных, слегка завернутые внутрь с темно-пурпурной бархатистой поверхностью. Лепестки мелкие, значительно мельче чашелистиков, темно-пурпурные. Тычинки и пестики многочисленные, сидят на коническом цветоложе. Плод сборный; плодики — многочисленные семянки. Высушенное растение имеет слабый очень приятный запах, напоминающий аромат чая. Цветет в июне-июле, плоды созревают в августе [1-3].
Сабельник болотный широко применяется в народной медицине. Его корневище в форме настоя и отвара применяется как ранозажив-ляющее и болеутоляющее при гастралгии, настойка из корневищ - при бронхитах, туберкулёзе и особенно часто - при различных заболеваниях суставов. Препараты на основе сабельника болотного хорошо зарекомендовали себя, показали положительные результаты при практически полном отсутствии токсичности и побочных эффектов [4, 14].
В современной отечественной медицине не существует аналогов лекарственных средств сабельника болотного, поэтому актуальным является стандартизация сырья сабельника болотного и разработка лекарственных средств на его основе [14].
Химический состав сабельника болотного представлен полифе-нольным комплексом, в котором преобладают дубильные вещества, главным образом, конденсированные [1-3]. В настоящее время конденсированные дубильные вещества рассматриваются как высокополимерные производные проантоцианидинов (рис. 1). Конденсированные дубильные вещества - линейные полимерные производные кате-хинов, лейкоантоцианидинов и других восстановленных форм флаво-ноидов [5,14].
Как правило, представляют собой линейные полимеры, отдельные мономеры (катехины и лейкоантоцианидины, соединенные С2-С6 связью) которых способны к ограниченному вращению вокруг соединяющей их связи, в результате чего молекула может приобретать стабильную спиральную конформацию с фенольными гидроксилами, расположенными по периферии такой спирали. Помимо высокополимерных, в растениях также содержатся олигомерные производные проантоцианидинов со степенью полимеризации 1-10.
он
он
Рис. 1. Пример проантоцианидина, выделенного из растения Sorghum (эпикате-хин-[^->8)-эпикатехин] 15-(4ß->8)-катехин)
Согласно имеющимся литературным данным, проантоцианидины обладают широким спектром фармакологической активности: антиок-сидантной [6], цитопротекторной [7], гастро- и кардиопротекторной [8], противоопухолевой, противосклеротической [9], а также значительной противовоспалительной [10, 11], в том числе влияющей на метаболизм хондроцитов и экспрессию COX-1 и COX-2 [11]. Последняя активность в значительной степени объясняет положительный эффект сабельника болотного на опорнодвигательный аппарат содержащимися в этом растении проантоцианидинами. Данное обстоятельство послужило основанием для выбора проантоцианидинов в качестве основной группы действующих веществ для стандартизации сырья и лекарственных средств из сабельника болотного [14].
Целью данной работы является разработка методики количественного определения проантоцианидинов и изучение локализации указанных соединений в растении сабельник болотный.
Материал и методика исследований. В качестве объекта исследования использовали три серии образцов растений сабельника болотного, в местах естественного произрастания в окрестностях г. Витебска Республики Беларусь. Собранные растения высушивали целиком, затем разделяли на вегетативные органы. До проведения анализов образцы хранились в бумажных пакетах при комнатной температуре.
Для количественного определения конденсированных дубильных веществ использовали модифицированный метод Porter [12,14], в основе которого лежит кислотный гидролиз олигомерных и полимерных
проантоцианидинов до антоцианидинов в присутствии катализатора (ионов Fe3+). Метод является высокочувствительным, однако изменение в соотношении реактивов в рецептуре и температурных условий в значительной степени снижают выход продукта цветной реакции и чувствительность определения [13, 14 ].
При подборе оптимальных условий извлечения суммы проантоциани-динов из различных органов сабельника болотного было изучено влияние следующих факторов: тип экстрагента, измельченность сырья, время экстрагирования, соотношение сырья и экстрагента.
При установлении оптимального экстрагента были исследованы вода и водные растворы этанола различных концентраций (10 - 96 %). Полученные данные по влиянию концентрации этанола на экстракцию суммы проантоцианидинов из корневищ сабельника болотного представлены на рис. 3. Как видно их представленных на рис. 3 данных, лучшим экстрагентом для извлечения суммы проантоцианидинов является водный раствор этанола в диапазоне концентраций 50 - 80% с максимумом при 70 %. Данная концентрация этанола использовалась в дальнейших исследованиях
^ 4 -
ш
0
Ь-
ш
1 т I 2 - т
ьг
!
° 0 -,-,-Т-,-,-,-,
0 10 20 30 40 50 60 ТО 80 00 100 Конце грация этанола. %
Рис. 2. Влияние концентрации этанола на извлечение суммы проантоцианидинов из корневищ сабельника болотного
Для установления оптимального времени экстракции извлечение из сырья проводили в течение 5-120 мин.
Наибольший выход проантоцианидинов наблюдается при экстракции в течение 20 мин. Дальнейшее увеличение времени экстракции отрицательно влияет на этот процесс, что может быть обусловлено конденсацией олигомерных и высокополимерных растворимых в водном этаноле проантоцианидинов в нерастворимые.
На извлечение проантоцианидинов из сырья сабельника болотного оказывает влияние соотношение сырья и экстрагента. Оптимальное
извлечение суммы проантоцианидинов наблюдается ри соотношении сырья экстрагента 1:40.
Кроме перечисленных выше параметров, на степень извлечения проантоцианидинов также оказывает степень измельченности сырья. Максимальная экстракция проантоцианидинов наблюдается при наименьшей из исследованной (0,25-2 мм) измельченности сырья сабельника болотного. Исследовать степень извлечения проантоцианидинов из сырья измельченностью менее 0,25 мм не представляется возможным, так как при экстракции образуется устойчивая суспензия, что препятствует измерению оптической плотности на спектрофотометре.
Описание методики. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц (250). Около 0,500 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в круглодонную колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 20 мл 70 % спирта этилового, закрывают пробкой, взвешивают с погрешностью ±0,01 г, присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 20 мин. После охлаждения до комнатной температуры колбу с пробкой взвешивают и доводят до первоначальной массы 70 % спиртом этиловым. Содержимое колбы центрифугируют в течение 10-15 мин со скоростью 2-3 тыс.об/мин. 0,1 мл полученного извлечения переносят в круглодонную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 0,9 мл 70 % спирта этилового, 0,2 мл железосодержащего реактива (2 % раствор FeNH4(SO4)2 в 1 н растворе кислоты хлороводородистой) и 6 мл 5 % раствора кислоты хлороводородистой концентрированной в п-бутаноле (смешивают 950 мл спиртап -бутилового с 50 мл кислоты хлороводородистой концентрированной (24,8 %)), присоединяют колбу к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 60 мин. Раствор охлаждают при комнатной температуре.
После охлаждения измеряют оптическую плотность при длине волны 550 нмв кювете с толщиной слоя 10 мм, используя в качестве раствора сравнения такой же раствор без спиртового извлечения без нагревания.
Содержание суммы проантоцианидинов в процентах (Х) в абсолютно сухом сырье вычисляют по формуле 1:
А*У1*У2* 100
~ У3*т* (100-Ж)* Е^
где: А - оптическая плотность исследуемого раствора; Е1 %1ст -удельный показатель поглощения суммы проантоцианидинов, равный 352; VI - объем экстракта, мл (20 мл); V2 - объем раствора для спек-трофотометрирования, мл (7,2 мл); V3 - объем экстракта, взятый для определения, мл (0,1 мл); т - масса сырья в граммах; W - потеря в массе при высушивании сырья в процентах.
1. Приготовление бутанола кислого: 950 мл спирта н-бутилового смешивали с 50 мл кислоты хлороводородистой концентрированной и перемешивали. Срок годности раствора 1 месяц.
2. Приготовление железосодержащего реактива: 0,5 г квасцов желе-зоаммонийных растворяли в 25 мл 2М раствора кислоты хлороводородистой, выдерживали в течение 12-16 часов, затем фильтровали через бумажный фильтр. Срок годности раствора 1 месяц [5, 14]. Показатель удельного поглощения продукта реакции проантоцианидинов с реактивом Портера был определен для суммы проантоцианидинов корневищ с корнями сабельника болотного, выделенных и очищенных с помощью колоночной хроматографии [5, 14].
Результаты исследований и их обсуждение. Количественного определения суммы проантоцианидинов представлены в табл. 1. Таким образом, результаты проведенных исследований создают предпосылки для решения проблемы химической стандартизации корневищ с корнями сабельника болотного. С учетом экспериментально установленных оптимальных условий экстракции и модифицированного метода Porter была исследована локализация суммы проантоцианидинов в различных органах сабельника болотного.
Таблица 1. Метрологическая характеристика методики количественного определения суммы проантоцианидинов в корневищах с корнями сабельника болотного
, % n S S 2 t(p,f) - X , % n=3, %
4,11 10 0,75 0,56 2,26 0,47 4,38 2,53
Результаты количественного определения суммы проантоцианидинов в пересчете на цианидина хлорид представлены в табл. 2.
Таблица 2. Содержание суммы проантоцианидинов в различных органах сабельника болотного
Сырье Содержание суммы проантоцианидинов, %
Серия 1 Серия 2 Серия 3
стебель 4,55 ± 0,19 4,19 ± 0,18 4,69 ± 0,21
корневище с корнями 4,60 ± 0,20 4,58 ± 0,20 4,70 ± 0,18
лист 0,76 ± 0,03 1,86 ± 0,08 1,71 ± 0,07
цветок 0,70 ± 0,27 0,72 ± 0,03 0,73± 0,03
Исходя из данных табл. 2, наибольшее содержание проантоцианидинов локализуется преимущественно в стебле и корневище с корнями сабельника болотного.
Заключение. Результаты исследований позволяют утверждать, что наибольшее содержание проантоцианидинов сабельника болотного локализуется в стеблях и корневищах с корнями, что позволяет рекомендовать указанные вегетативные органы в качестве лекарственного растительного сырья сабельника болотного. Также в ходе опыта были подобраны оптимальные условия извлечения суммы проантоцианиди-
нов, определен их удельный показатель поглощения и предложена методика количественного определения проантоцианидинов в различных вегетативных органах сабельника болотного, основанная на использовании модифицированного метода Porter.
ЛИТЕРАТУРА
1. Сезонноеразвитие сабельника болотного и багульника болотного в южной Карелии и динамика содержания минеральных и органических веществ в их растительном сырье / А.С.Лантратова [и др.] // Сезонная ритмика и продуктивность дикорастущих лекарственных растений. - М., 2017. - С. 62-73.
2. Люкшенкова, Е. Я. Фармакологическое изучение сабельника болотного (Comarum palustre L.) / Е. Я.Люкшенкова, М. Георгиу, Э. А. Бурдыкина-Шехтер // Аптечное дело. -2016. - № 2. - С. 34-44.
3. Наумчик, Г. Н. Фитохимическое исследование сабельника болотного и приготовление из него некоторых лекарственных препаратов автореф. дис.канд. фарм. наук / Н. Г. Наумчик. - Л., 1964. - 17 с.
4. Чемесова, И. И. Определение содержания дубильных веществ в корневищах Comarum palustre L. и настойке из него спектрофотометрическим методом / И. И. Чемесова // Растительные ресурсы. - 2004. - Вып. 3. - С. 122-129.
5. Miami University's centralized webserver for personal web pages [Electronic resource] / Professor Ann E. Hagerman. - Tannin Chemistry. - Oxford, 2002. mode ofaccess:http://www.users.muohio.edu/hagermae/tannin.pdf. - Date of access: 10. 10.2018.
6. Free radicals and grape seed proanthocyanidin extract: importance in human health and disease prevention / D. Bagchi [etal.] // Toxicology. -2017. - Vol. 148, N 2-3. -P. 187-197.
7. Cellular protection with proanthocyanidins derived from grape seeds /D. Bagchi [et al.] // Ann N Y Acad Sci. -2017. - Vol. 957. - P. 260-270. The cytotoxic effects of a novel
IH636 grape seed proanthocyanidin extract oncultured human cancer cells / X. Ye Mol. Cell.Biochem. - 1999. - Vol. 196, N 1-2. - P. 99-108.
9. Sovak, M. Grape Extract, Resveratrol, and Its Analogs: A Review / M. Sovak //J. Med. Food. - 2001. - Vol. 4, N 2. - P. 93-105.
10. Inhibitory effects of proanthocyanidins from Ribesnigrum leaves on carrageenin acute inflammatory reactions inducedin rats / N. Garbacki [et al.] // BMC Pharmacol. - 2017. -Vol. 4. - P. 25-32.
11. Effects of prodelphinidins isolated fromRibesnigrum on chondrocyte metabolism and COX activity / N. Garbacki [et al.] //NaunynSchmiedebergs Arch. Pharmacol. - 2017. - Vol. 365, N 6. - P. 434-441.
12. Porter, L. J. The conversion of procyanidins and prodelphinidins to cyanidin and delphinidin / L.J. Porter, L.N. Hrstich, B.C.Chaw // Phytochemistry. - 2016. - Vol. 25. -P. 22-230.
13. Хишова, О. М. Количественное определение проантоцианидинов плодов боярышника / О. М. Хишова, Г. Н. Бузук // Хим. фармац. журнал. - 2006. - Т. 40, N° 2. - С. 20 - 21.
14. Ершик, О. А. Количественное определение проантоцианидинов в сабельнике болотном COMARUM PALUSTRE L. / О. А. Ершик, Г. Н. Бузук //Вестник фармации -2007. - Т. 38, №4. - С. 1-8.
