CC BY
154
ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ПРОАНТОЦИАНИДИНОВ КОРНЕВИЩ С КОРНЯМИ САБЕЛЬНИКА БОЛОТНОГО COMARUM PALUSTRE L.
О.А. ЁРШИК. Г.Н. БУЗУК, Г.Д. КОРОБОВ.
УО «Витебский государственный медицинский университет» Кафедра фармакогнозии и ботаники
Резюме. В статье изучена противовоспалительная активность на модели острого карагиненового отека извлечений из корневищ с корнями сабельника болотного. а также суммы проантоцианидинов, выделенной и очищенной на сорбенте Sephadex-LH 20.
Экспериментально доказано. что основной группой биологически активных веществ. благодаря которой корневища с корнями сабельника болотного обладают выраженной противовоспалительной активностью. являются проантоцианидины. Выраженная противовоспалительная активность. отсутствие побочных эффектов в отличие от синтетических противовоспалительных средств позволяет говорить о более предпочтительном. эффективном и безопасном использовании извлечений из корневищ с корнями сабельника болотного в профилактике и лечении многих воспалительных заболеваний. В ходе эксперимента определили. что извлечения из корневищ с корнями сабельника болотного и выделенная сумма проантоцианидинов не обладают ульцерогенным действием.
Ключевые слова: сабельник болотный. проантоцианидины. карагинен. противовоспалительная активность. ульцерогенность.
Abstract. The article has researched the anti-inflammatory activity using the model of extractions out of an acute carrageenan-induced edema of rhizomes with roots of Comarum palustre. as well as the sum of proantocyanidins extracted and purified on sorbent Sephadex-LH 20.
It has been experimentally proved. that proantocyanidins are the main group of biologically active substances owing to which the rhizomes with roots of Comarum palustre possess the clearly expressed anti-inflammatory activity. Clear antiinflammatory activity. absence of side effects in comparison to synthetic antiinflammatory drugs. allows us to speak abont a more effective. safe and preferable use of extractions of rhizomes with roots of Comarum palustre in profilactics and treatment of many anti-inflammatory diseases. In the course of the experiment it was determined that the extractions of rhizomes with roots of Comarum palustre and the extracted sum of proantocyanidins do not possess ulcerogenous action.
Адрес для корреспонденции: Республика Беларусь. 210023. г. Витебск. пр. Фрунзе. 27. Витебский государственный медицинский университет. тел: 3709-29; моб. (МТС): 5908290. - Ёршик О.А.
1
Согласно имеющимся литературным данным. проантоцианидины обладают широким спектром фармакологической активности: антиоксидантной [1]. цитопротекторной [2]. гастро- и кардиопротекторной [3]. противоопухолевой. противосклеротической [4]. а также значительной противовоспалительной [5. 6]. в том числе влияющей на метаболизм хондроцитов и экспрессию ЦОГ-1 и ЦОГ-2 [6]. Последняя активность в значительной степени объясняет положительный эффект сабельника болотного на опорно-двигательный аппарат содержащимися в этом растении проантоцианидинами. Данное обстоятельство послужило основанием для выбора проантоцианидинов в качестве основной группы действующих веществ для стандартизации сырья и лекарственных средств из сабельника болотного.
В экспериментальных исследованиях по изучению новых противовоспалительных средств более широко применяется модель острого воспалительного отека. которая традиционно проводится с помощью применения флогогена. а именно карагинена. Данная модель острого воспалительного отека позволяет объективно оценить противовоспалительную активность препаратов и предсказать их клиническую эффективность [7].
Карагинен (carrageenan) - сульфатированный мукополисахарид. выделенный из ирландского морского мха Chondrus.
Целью настоящей работы является изучение противовоспалительной активности извлечений из корневищ с корнями сабельника болотного и очищенной фракции суммы проантоцианидинов.
Методы
В качестве объекта исследования использовали корневища с корнями сабельника болотного. заготовленные в августе 2007 г. в местах естественного произрастания в окрестностях г. Витебска Республики Беларусь. До проведения экспериментов образцы хранились в бумажных пакетах при комнатной температуре.
Получение извлечений из корневищ с корнями сабельника болотного.
Пробу сырья (корневищ с корнями сабельника болотного). измельченного до размера частиц. проходящих сквозь сито с отверстиями 0.25 мм. помещали в круглодонную колбу вместимостью 500 мл. прибавляли 70% спирт этиловый. присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на водяной бане при температуре 80°С в течение 20 минут [8]. Содержимое колбы процеживали. упаривали досуха. Сухой остаток растворяли в дистиллированной воде. Вводили крысам - самцам внутрижелудочно в течение 5 дней в следующих дозах: 930. 630 и 460 мг/кг.
Получение очищенной фракции суммы проантоцианидинов корневищ с корнями сабельника болотного.
Для получения и очистки фракции суммы проантоцианидинов применяли сорбент Sephadex-LH 20 [9].
Пробу сырья. измельчённого до размера частиц. проходящих сквозь сито с диаметром 0.25 мм. экстрагировали 70% этиловым спиртом на кипящей
водяной бане в течение 20 минут. Готовое извлечение охлаждали и центрифугировали со скоростью 1000 об/мин в течение 15 минут [8].
Колонку с сорбентом предварительно кондиционировали 96% этиловым спиртом и заливали полученный экстракт. Затем элюировали 96% этиловым спиртом со скоростью 1 мл/мин. Элюирование проводили до тех пор. пока при 280 нм оптическая плотность элюированной жидкости не будет постоянной. В качестве раствора сравнения при спектрофотометрии использовали дистиллированную воду. Затем элюировали фракцию суммы проантоцианидинов 70% водным ацетоном. ацетон выпаривали. полученный остаток растворяли в дистиллированной воде [9]. Вводили крысам - самцам внутрижелудочно в течение 5 дней в следующих дозах: 10. 20 и 40 мг/кг.
В опыт брались здоровые животные после предварительной адаптации их в условиях вивария и наблюдения за их состоянием в течение 4 - 5 дней. В период исследования особи содержались в одинаковых условиях.
Эксперименты проводились на 80 крысах - самцах линии ’^Б1аг массой 200-250 г.
Острое экссудативное воспаление вызывали введением под плантарный (подошвенный) апоневроз правой задней лапы крысы 0.1 мл 1% раствора карагинена. приготовленного на изотоническом растворе хлорида натрия.
В эксперименте в течение 5 дней крысам вводили фитопрепараты внутрижелудочно. последнее внутрижелудочное введение проводили за 1 час до введения карагинена [7. 10. 11. 12. 13. 14].
Установлено. что субплантарное введение карагинена вызывает острую воспалительную реакцию. протекающую в 3 этапа:
фаза 1 - нарастание отека (первые 2 часа после инъекции карагинена);
фаза 2 - максимум развития отека (3-4 часы после инъекции карагинена);
фаза 3 - регрессия отека (12-24 часы после инъекции карагинена).
Динамика развития отека заканчивается полностью восстановлением исходных параметров воспаленной конечности [13].
Субплантарное введение изотонического раствора натрия хлорида отечной реакции практически не вызывало. что свидетельствует о высокой флогогенной активности используемого нами образца каррагенана.
В качестве препарата сравнения использовали ацетилсалициловую кислоту в дозе 200 мг/кг [7]. контрольная группа животных получала эквивалентный объем дистиллированной воды. Препарат сравнения и дистиллированная вода были введены в аналогичном режиме: внутрижелудочно в течение 5 дней.
Через 3.5 часа после инъекции карагинена животных умервщляли. соблюдая «Правила работы с лабораторными животными».
Противовоспалительный эффект препаратов оценивали по индексам ингибирования (ИИ). которые рассчитывали по формуле:
— — —
ИИ = —5---^ х 100.
—н / в
где. тв - средние значения масс воспаленной лапы
тн/в - средние значения масс невоспаленнои лапы животных.
Об интенсивности воспаления судили по проценту прироста массы лапы крысы и угнетения отека на пике воспаления.
Унифицированными гематологическими методами оценивались СОЭ и содержание лейкоцитов [15, 16].
Результаты исследования
С помощью визуального метода путем наложения кривой нормального распределения для данного числа наблюдений на полученные эмпирические данные оценили их распределение. Для примера на рис. 1 показано
распределение лейкоцитов в 1 мм3 крови под действием препаратов.
Категорированная гистограмма распределения лейкоцитов в 1 мМ крови
6 5 4 3 2 1 0
2050 4385 6720 9055 11390 13725 2050 4385 6720 9055 11390 13725 2050 4385 6720 9055 11390 13725
3218 5553 7888 10223 12558 14893 3218 5553 7888 10223 12558 14893 3218 5553 7888 10223 12558 14893
препарат: 1
6
^ 5
Ю 5 (С 4
СО з О) 3 СО 2
препарат: 4
препарат: 2
препарат: 3
2050 4385 6720 9055 11390 13725
3218 5553 7888 10223 12558 14893
2050 4385 6720 9055 11390 13725 2050 4385 6720 9055 11390 13725
3218 5553 7888 10223 12558 14893 3218 5553 7888 10223 12558 14893
6 5 4 3 2 1 0
2050 4385 6720 9055 11390 13725
3218 5553 7888 10223 12558 14893
препарат: 5
препарат: 6
препарат: 7
3
Рис. 1 Распределение лейкоцитов в 1 мм крови под действием препаратов. На рис. цифрами 1-7 обозначены следующие группы наблюдений:
0 - контроль (группа животных, получавших дистиллированную воду);
1 - получавших ацетилсалициловую кислоту, 200 мг/кг;
2 - получавших болотного. 460 мг/кг;
3 - получавших болотного. 630 мг/кг;
4 - получавших болотного. 930 мг/кг;
извлечение из корневищ с корнями сабельника
извлечение из корневищ с корнями сабельника
извлечение из корневищ с корнями сабельника
0
5 - получавших сумму проантоцианидинов. 10 мг/кг;
6 - получавших сумму проантоцианидинов. 20 мг/кг;
7 - получавших сумму проантоцианидинов. 40 мг/кг.
Как видно на рис. 1. распределение лейкоцитов в 1 мм крови под действием ацетилсалициловой кислоты. 200 мг/кг (препарат 1). извлечения из корневищ с корнями сабельника болотного. 930 мг/кг (препарат 4) и суммы проантоцианидинов. 40 мг/кг (препарат 7) имеет гомогенный характер. Для остальных групп препаратов. а именно. извлечения из корневищ с корнями сабельника болотного. 460 мг/кг (препарат 2) и 630 мг/кг (препарат 3). суммы проантоцианидинов. 10 мг/кг (препарат 5) и 20 мг/кг (препарат 6). разброс вокруг средней значительный. наблюдаются выбросы.
Отклонения от нормального распределения характерно и для показателя СОЭ. и для индекса ингибирования.
препарат
Рис. 2. Влияние извлечений из корневищ с корнями сабельника болотного и суммы проантоцианидинов на прирост массы лапы крысы при моделировании карагиненового отека.
Поэтому для обработки полученных результатов применяли непараметрические критерии. Для оценки достоверности различия полученных результатов применяли однофакторный дисперсионный анализ с использованием частной декомпозиции первого типа [17, 18, 19].
В ходе исследования выявлено, что при внутрижелудочном введении извлечений из корневищ с корнями сабельника болотного, выделенной и очищенной суммы проантоцианидинов наблюдается выраженное
противовоспалительное действие. которое доказано снижением выраженности «карагиненового отека».
Результаты исследований отражены в таблице 1 и на рис. 2.
Оценка влияния извлечений из корневищ с корнями сабельника болотного и суммы проантоцианидинов на экссудативную фазу воспалительной реакции показала. что данные извлечения существенно ослабляли флогогенное действие карагинена. угнетая выраженность отека на 63.3-87.6% (очищенная сумма проантоцианидинов. 40 мг/кг) и на 41.2-81.0% (извлечение из корневищ с корнями сабельника болотного. 460 мг/кг) по сравнению с группой контроля. В этих же условиях использование ацетилсалициловой кислоты в дозе 200 мг/кг тормозило развитие отека на 46.088.0 % (табл. 1).
Таблица 1
Влияние извлечений из корневищ с корнями сабельника болотного и суммы проантоцианидинов на угнетение отека лапы крысы при моделировании карагиненового воспаления
Экспериментальная группа Доза. мг/кг Угнетение отека на пике воспаления. %
Контроль (дистиллированная вода)
Ацетилсалициловая кислота 200 46.0-88.0*
Сумма проантоцианидинов 10 27.0-67.7*
Сумма проантоцианидинов 20 53.5-82.3*
Сумма проантоцианидинов 40 63.3-87.6*
Извлечение из корневищ с корнями сабельника болотного 460 41.2-81.0*
Извлечение из корневищ с корнями сабельника болотного 630 28.3-69.0*
Извлечение из корневищ с корнями сабельника болотного 930 14.2-41.2*
* Р < 0.05 по сравнению с контролем.
На рис. 2 видно. что извлечение из корневищ с корнями сабельника болотного в меньшей дозе. а именно. 460 мг/кг (препарат 2). оказывает более сильное противовоспалительное действие. чем извлечения из корневищ с корнями сабельника болотного в дозах 630 мг/кг (препарат 3) и 930 мг/кг (препарат 4). Противовоспалительный эффект выделенной и очищенной суммы проантоцианидинов носит дозозависимый эффект (с увеличением дозы противовоспалительный эффект также увеличивается). Очищенная сумма проантоцианидинов в дозе 40 мг/кг (препарат 7) оказывает выраженный противовоспалительный эффект. сила которого сравнима с
противовоспалительным эффектом аспирина в дозе 200 мг/кг (препарат 1).
Также на рис. 2 показано. что противовоспалительные эффекты извлечения из корневищ с корнями сабельника болотного. 460 мг/кг (препарат 2) и суммы проантоцианидинов. 40 мг/кг (препарат 7) отличаются не намного.
Категорированная гистограмма распределения показателя СОЭ, мм
О 7 03 6
5
О) 4
со 4
Т 3
с; 2
£ 1 5 0
—I----------------------------------------------------------1-1-Г”
1 3 5 7 9 11 13
препарат: 1
1 3 5 7 9 11 13
препарат: 2
1 3 5 7 9 11 13
препарат: 3
1 3 5 7 9 11 13
препарат: 4
1 3 5 7 9 11 13
препарат: 5
1 3 5 7 9 11 13
препарат: 6
1 3 5 7 9 11 13
препарат: 7
Рис. 3 Распределение показателя СОЭ, мм под действием препаратов
Но, как видно, на рис. 3 распределение показателя СОЭ, мм под влиянием выделенной суммы проантоцианидинов, 40 мг/кг (препарат 7) близко к нормальному, а также распределение имеет более плотный характер. Что касается индекса ингибирования, то под влиянием выделенной суммы проантоцианидинов, 40 мг/кг противовоспалительный эффект характерен для всех особей. Противовоспалительный эффект под влиянием извлечения из корневищ с корнями сабельника болотного, 460 мг/кг отчетливо выражен, но встречаются особи, у которых процент ингибирования проявляется более слабо.
Анализ периферической крови животных подтвердил выраженное противовоспалительное действие извлечений из корневищ с корнями сабельника болотного и выделенной суммы проантоцианидинов (рис.4 и 5).
Как видно на рис. 4, уже через 3 часа после введения карагинена крысам, спиртовые извлечения из корневищ с корнями сабельника болотного снижали повышенные СОЭ на 28,7-40,2% (препараты 2-4), выделенная сумма проантоцианидинов - на 32,2-42,5% (препараты 5-7). В этих же условиях использование ацетилсалициловой кислоты в дозе 200 мг/кг снижало СОЭ на 64,4 % (Р < 0,05 по сравнению с контролем).
8
препарат
Рис. 4. Показатели СОЭ у крыс на фоне применения извлечений из корневищ с корнями сабельника болотного и суммы проантоцианидинов при
моделировании карагиненового отека.
препарат
З
Рис. 5. Показатели содержания лейкоцитов в І ммЗ крови на фоне применения извлечений из корневищ с корнями сабельника болотного и суммы проантоцианидинов при моделировании карагиненового отека.
Как видно на рис. 5. уже через 3 часа после введения карагинена крысам. спиртовые извлечения из корневищ с корнями сабельника болотного снижали содержание лейкоцитов на 6.5-18.9% (препараты 2-4). выделенная сумма проантоцианидинов - на 2.8-25.4% (препараты 5-7). В этих же условиях использование ацетилсалициловой кислоты в дозе 200 мг/кг снижало содержание лейкоцитов на 12.8% (Р < 0.05 по сравнению с контролем).
Вскрытие желудков крыс и визуальный осмотр их слизистой оболочки показал. что извлечения из корневищ с корнями сабельника болотного. выделенная и очищенная сумма проантоцианидинов не оказывают ульцерогенного действия.
Структура поверхностного железистого эпителия хорошо сохранена. желудочные ямочки хорошо выражены и заполнены светло - розовым гомогенным секретом. Собственные железы обычной конфигурации. структура их эпителия не изменена. Сосуды во всех слоях стенки умеренно расширены.
Таким образом. основной группой биологически активных веществ. благодаря которой корневища с корнями сабельника болотного обладают выраженной противовоспалительной активностью. являются
проантоцианидины.
Выраженная противовоспалительная активность. отсутствие побочных эффектов. в отличие от синтетических противовоспалительных средств. позволяет говорить о более предпочтительном. эффективном и безопасном использовании извлечений из корневищ с корнями сабельника болотного в профилактике и лечении многих воспалительных заболеваний.
Заключение
1. На модели «карагиненового» воспаления изучена
противовоспалительная активность извлечений из корневищ с корнями сабельника болотного;
2. Доказано проявление противовоспалительной активности корневищ с корнями сабельника болотного благодаря содержанию суммы проантоцианидиновов;
3. Извлечения из корневищ с корнями сабельника болотного и выделенная сумма проантоцианидинов ульцерогенным действием не обладают.
Литература
1. Free radicals and grape seed proanthocyanidin extract: importance in human health and disease prevention / D. Bagchi [et al.] // Toxicology. - 2000. -Vol. 148. N 2-3. - P. 187-197.
2. Cellular protection with proanthocyanidins derived from grape seeds / D. Bagchi [et al.] // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 2002. - Vol. 957. - P. 260-270.
3. Mol. X. Ye. The cytotoxic effects of a novel IH636 grape seed proanthocyanidin extract on cultured human cancer cells / X. Ye Mol // Cell. Biochem. - 1999. - Vol. 196. N 1-2. - P. 99-108.
4. Sovak. M. Grape Extract. Resveratrol. and Its Analogs: а review / M. Sovak // J. Med. Food. - 2001. - Vol. 4. N 2. - P. 93-105.
9
5. Inhibitory effects of proanthocyanidins from Ribes nigrum leaves on carrageenin acute inflammatory reactions induced in rats / N. Garbacki [et al.] // BMC Pharmacol. - 2004. - Vol. 4. - P.25-32.
6. Effects of prodelphinidins isolated from Ribes nigrum on chondrocyte
metabolism and COX activity / N. Garbacki [et al.] // Naunyn Schmiedebergs Arch.
Pharmacol. - 2002. - Vol. 365. N 6. - P. 434-441.
7. Противовоспалительные свойства ряда препаратов растительного происхождения / А.В. Горбачева [и др.] // Бюллетень СО РАМН. - 2003. - №
1. - С. 12 - 15.
8. Ёршик. О.А. Количественное определение проантоцианидинов в сабельнике болотном Comarum palustre L. / О.А. Ёршик. Г.Н. Бузук // Вестник Фармации. - 2007. - № 4. - С. 10-17.
9. Miami University's centralized web server for personal web pages
[Electronic resource] / Professor Ann E. Hagerman. - Tannin Chemistry. - Oxford.
2002. - mode of access: http://www.users.muohio.edu/hagermae/tannin.pdf. - Date of access: 1.10.2006.
10. Хабриев. Р.У. Руководство по экспериментальному
(доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Р.У. Хабриев. - Москва. 2005. - 826 с.
11. Зверева. Е.Ю. Изучение противовоспалительных свойств липоевой кислоты и разработка ее лекарственной формы для наружного применения : автореф. ... дис. канд. фарм. наук : 15.00.01; 14.00.25 / Е. Ю. Зверева; Казанс кий гос. мед. ун - т Федерального агенства по здравоохр. и соц. развитию. -Тюмень. 2006. - 23 с.
12. Рыдловская. А. В. Противовоспалительные свойства нового
растительного препарата Артрофлекс и анализ механизма его действия: автореф. ... дис. канд. биол. наук: 14.00.25 / А.В. Рыдловская;
Межрегиональный Центр «Адаптоген». - СПб.. 2007. - 22 с.
13. Anti-inflammatory effect and mechanism of proanthocyanidins from grape seeds / LI Wen-Guang ^t al.] // Acta Pharmacol Sin. - 2001. - Vol. 22. - P. 1117-1120.
14. Proanthocyanidins. from Ribes nigrum leaves. reduce endothelial adhesion molecules ICAM-1 and VCAM-1 / N Garbacki [et al.] // Journal of Inflammation. - 2005. - 2:9. - P. 1-12.
15. Пособие по клинико-лабораторным методам исследований / Г.Н.Удинцев [и др.]:- Медицина. 1968. - 260 с.
16. Меньшиков. В.В. Лабораторные методы исследования в клинике / под ред. В.В. Меньшикова. - Москва: Медицина. 1987. - 364 с.
17. Поляков. Л.Е. Статистические методы исследования в медицине и здравоохранении / под ред. Л.Е. Полякова. - Ленинград: Медицина. 1971. - 198 с.
18. Бузикашвили. Н.Е. Медико-биологическая статистика / Н.Е. Бузикашвили. Д.В. Самойлова; под ред. Бузикашвили. - Москва: Практика. 1999. -455 с.
19. Электронный учебник по промышленной статистике [Электронный ресурс]. - Электрон. текстовые дан. и прогр. (374 мб). - Москва: StatSoft, Inc., 2001. - 1 электрон. опт. диск (CD-ROM).
