CC BY
15
УДК 616-003.826+616-02/611-018.54+591.4+616.36-002.08 DOI: 10.22141/2308-2097.52.3.2018.141841
Степанов Ю.М., Дденко В.1., KAeHiHü I.A., Карачинова В.А., Ошмянська НЮ.
ДУ «1нститутгастроэнтерологи НАМН Укра!ни», м. Дн1про, Украна
Спектр жирних кислот сироватки KpoBi пащенпв i3 хрошчними дифузними захворюваннями печшки
залежно вiд етюлоги та мopфOAOгiчних особливостей
For cite: Gastroenterologia. 2018;52(3J:127-134. doi: 10.22141/2308-2097.52.3.2018.141841
Резюме. У статт'1 подано морфолопчн'1 особливост (за даними пстолопчних. метод'1в досл'щження, методу натвтонких зр'з'в та комп'ютерно! морфометрй) розвитку та прогресування хрон'нних. дифузних захворювань печнки, хрончного гепатиту, асоц'1йованого з в'русом С, та алкогольноi хвороби печнки. Показано, що залежно в 'щ ет'юлопчного фактора важлива в'щм'1нн'1сть була виявлена за характером, сту-пенем стеатозу та локал'зац'ею лпщних крапель, що св'щчить про розбiжнiсть деяких бЮхiмiчних механз-мiв накопичення лт^в у гепатоцитах. Розглянуто роль вльних жирних кислот сироватки кров'1 при даних захворюваннях, виявлено п'щвищення iх вмсту у сироватц кров'1, встановлено дефщит деяких фракцй, що може бути одшею з причин формування неалкогольноiжирово(хвороби печнки та ¡нших. захворювань, пов'язаних з обм'мом речовин. Маркером запальних процесв можна вважати ленолеву (С18:3) й арах'що-нову (С20:0) вльнi жирн кислоти. Запропоновано ндекси сп'тв'щношення жирних кислот, що дозволяють охарактеризувати та встановити метабол'нш шляхи розвитку та прогресування захворювання, що в'щ'1грае важливу роль у диференцйованому пiдходi при встановленн нозолопчних. форм захворювань печнки. Ключовi слова: неалкогольна жирова хвороба печiнки; алкогольний стеатогепатит; стеатоз печiнки; хрон'чний гепатит С; газова хроматограф':я; вльнi жирн кислоти; полненасиченi жирн кислоти
Орипнальж досл^ження Original Researches ■ < ■ i ГАСТРОЕНТЕРОЛОПЯ GASTROENTEROLOGY
Патолопя печшки i жовчовив^дно! системи / Pathology of Liver and Biliary Excretion System
Вступ
Патолопя печшки займае провщне мюце серед хвороб оргашв травлення. Щороку в крашах СНД рееструеться вщ 500 тис. до 1 млн людей, яы стражда-ють вщ захворювань даного органа. В Укрш'ш за остан-ш 10 роив поширенють цих захворювань збтьшилась на 20,1 % [1, 2]. Серед них хрошчш дифузш захворювання печшки (ХДЗП) рiзноl етюлоги, що перебиають iз достатньо неспецифiчними клшчними проявами [2—4]. Спектр структурних порушень при ХДЗП також значно варше залежно вщ нозологи: вщ доброяысного накопичення печшкових триглщервддв фольований стеатоз) до запалення та некрозу гепатоцилв — стеато-гепатиту, а з часом — до цирозу печшки та гепатоцелю-лярно'1 карциноми (ГЦК) [5—7]. Вважаеться, що ХДЗП найближчим часом стане найчастшим показником до трансплантаци печшки в свт [8, 9].
Уже доведено, що порушення синтезу та утитза-Щ1 втьних жирних кислот виступае одшею з причин формування ХДЗП та шших захворювань печшки, пов'язаних i3 порушенням обмiнy лiпiдiв.
Дослiдження на тваринах та клшчш спостереження пiдтверджyють концепцш, згiдно з якою пошкоджен-ня гепатоцилв, характерне для ХДЗП, обумовлюеться надлишком первинних метаболiчних сyбстратiв (глю-кози, фруктози та жирних кислот) у печшщ, внаслiдок чого жирш кислоти впливають на бiохiмiчнi шляхи, що призводить до пошкодження клггин [6, 7]. Рiзнi аспек-ти цих шляхiв, що ведуть до стеатогепатиту, потенцшно варiюватимyть у пащентав залежно вiд етiологií захворювання, наявност ожирiння або дiабетy, але в резуль-татi однаково призведуть до ускладнень [8].
До 25 % ушх випадкiв хронiчних захворювань печшки пов'язаш з уживанням алкоголю. ХДЗП як
© «Гастроентеролопя» / «Гастроэнтерология» / «Gastroenterology» («Gastroenterologia»), 2018 © Видавець Заславський О.Ю. / Издатель Заславский А.Ю. / Publisher Zaslavsky O.Yu., 2018
Для кореспонденци: Степанов Юрiй Миронович, доктор медичних наук, професор, ДУ «1нститут гастроентерологп НАМН УкраТни», пр. Слобожанський, 96, м. Днiпро, 49074, УкраТна; e-mail: gastrodnepr@i.ua
For correspondence: Yu. Stepanov, MD, PhD, Professor, State Institution "Institute of Gastroenterology of the National Academy of Medical Sciences of Ukraine', Slobozhanskii аvenue, 96, Dnipro, 49074, Ukraine; e-mail: gastrodnepr@i.ua
алкогольного, так i неалкогольного генезу характеризуемся пщвищенням вщкладення триглiцеридiв у гепатоцитах унаслщок надлишкового накопичення вiльних жирних кислот (ВЖК) у печшщ i/або 1х пщси-леного синтезу органом з ацетилкоензиму А (ацетил-КоА), особливо при недостатносп останнього. Про-дукщя триглiцеридiв у гепатоцитi прямо залежить вiд умiсту в ньому жирних кислот, ацетил-КоА та глюко-зи, що в процесi глiколiзу перетворюеться у фосфатид-ну кислоту, яка запускае синтез триглщервддв. У мiру накопичення жиру гепатоцити стають бшьш чутли-вими до токсичного впливу та втрачають сво1 функ-цюнальш властивостi [10]. Головну роль у накопи-ченнi жиру в гепатоцит на тлi споживання алкоголю вщграе ацетальдегiд — основний токсичний продукт метаболiзму етанолу. У процесi окиснення етанолу вiдмiчаеться пiдвищене використання коферменту НАД+, який, приеднуючи протон, вщновлюеться до НАДН+. Пiдвищення вщновлено! форми НАДН+ при систематичному вживаннi алкоголю знижуе актив-нiсть основних ферменпв лiпоксигеназного шляху, яю забезпечують транспорт жирних кислот у мггохондри, зменшуе 1х внутрiшньомiтохондрiальне окиснення, що призводить до вираженого порушення метаболiзму жирiв, накопичення в клiтинах печiнки триглiцеридiв та розвитку стеатозу [9, 10].
Сучасш функцiональнi методи дiагностики (яысш показники стеатозу) не завжди вщображають реальну картину. Серед них магштно-резонансна спектроско-пiя — найбiльш точний метод кшьысного визначення стеатозу, проте найбтьш затратний, тому бiопсiя печшки е единим тестом, що дозволяе вiрогiдно встано-вити дiагноз i залишаеться золотим стандартом оцш-ки тяжкостi стеатозу, але е випадки, у яких виконання бюпси не рекомендуеться [2].
Газова хроматографiя на сьогоднi е единим методом, що дозволяе визначити жирнокислотний склад у бюлопчних субстратах. Перевага цього методу поля-гае у швидкост виконання й високiй чутливост методу, завдяки чому можливо виявити найменшi кон-центрацп сполук у дослщному зразку (до 10-12 моль). Впровадження цього методу в кшшчну практику лiкарiв дозволяе дiагностувати захворювання печiнки на ранньому еташ розвитку та коригувати виявленi порушення [11].
Жирнокислотний склад сироватки кровi пащенпв зi стеатозом характеризуеться зниженням загального вмiсту ВЖК за рахунок дефiциту ненасичених жирних кислот. У сукупност з морфологiчними методами дослщжень використання довголанцюгових ВЖК для дiагностування захворювань, пов'язаних iз порушен-ням структури, функцiй та в'язкост гепатоцитiв, вщ-кривае можливiсть для розкриття патогенезу ХДЗП iз метою тдвищення диференщально! дiагностики та ефективност лiкування виявлених порушень [12].
Мета роботи — оцшка вiльних жирних кислот у си-роватцi кровi пацiентiв iз ХДЗП залежно вщ його етю-логи та морфолопчних особливостей, визначення ролi цих змш у прогресуваннi патологи печiнки.
Матерiали та методи
Обстеженi 66 пащентав i3 ХДЗП, середнiй вш (59,2 ± 2,4) року. Уш обстежеш XBopi були розподiленi на групи залежно вiд етiологiчних факторiв при фор-муванш та прогресуваннi стеатозу та фiброзу печiнки: I — неалкогольна жирова хвороба печiнки (НАЖХП, n = 38); II — хрошчний гепатит, асоцiйований з вiру-сом С (ХГС) (n = 13); III — алкогольна хвороба печшки (АХП, n = 15). Серед обстежених пащенпв жшок було 46 %, а чоловтв — 54 %.
За допомогою методики черезшюрно! пункцш-но! трепан-бiопсii печшки в кожного пащента взято 3 стовпчики тканини з VII сегмента право! частки органа. Цю методику виконували пiд безперервним ультразвуковим контролем пiд мiсцевою анестезiею натвавтоматичною голкою Colt Shot 16 G. Для псто-логiчних дослiджень бюптати фiксували в 10,0% роз-чиш нейтрального формалшу, зневоднювали в спиртах висхщно! концентраци i заливали в парафш (за загаль-ноприйнятим у морфолопчнш практицi методом). Гiстологiчнi зрiзи товщиною 3—5 мкм забарвлювали гематоксилшом i еозином та за Маллорi в модифшаци Слiнченка [13].
Для проведення комп'ютерно! морфометри бю-птати фотографували i здшснювали вимiрювання за допомогою програми ImageJ 1.45S (розроблена в National Institutes of Health, США). Комп'ютерний ш-декс фiброзу — це отримане на цифровому зображен-нi спiввiдношення площi колагену до загально! площi бiоптату. Нашвтоны зрiзи отримували за допомогою ультратому УМТП-7 iз використанням скляних но-жiв. Гiстологiчнi зрiзи товщиною 1 мкм забарвлювали толу!диновим синiм. Дослщження напiвтонких зрь зiв проводили методом свплово! мшроскопи високо! роздтьно! здатност (iмерсiйне масло, об'ектив х100). Отримаш данi доповнювали iнформацiйну картину при вивченш парафiнових зрiзiв.
Хроматографiчне дослщження ВЖК у сироватцi кровi було проведено з використанням апаратно-про-грамного комплексу для медичних дослiджень на базi газового хроматографа «ХРОМАТЕК-КРИСТАЛЛ 5000».
Обладнання. Газовий хроматограф iз полум'яно-iонiзацiйний детектором. Кварцева каптярна колонка (RESTEK) довжиною 60 м, внутршнш дiаметр 0,25 мм, нерухома фаза типу FFAP i товщиною плiвки 0,25 мкм.
Режим приладу при проведент досл1джень. 1зо-термiчна температура термостату становила 140 °С, температура випаровувача i детектора — 230 °С. Газ-носiй — азот, iз тиском на входi до колонки 1,8 атм. Витрати газу-ношя — 2 мл/хв, водню — 25 мл/хв, по-впря — 300 мл/хв. Спiввiдношення потоыв газу-носiя на викид i до колонки — 50 : 1. Хдентифшацш фракцш вiльних жирних кислот проводили зпдно iз стандартами метильованих жирних кислот фiрми «Restek».
KOH-метилювання лшд1в у бюлог1чних субстратах, як мстять воду (сироватка кров1, гомогенат тощо). До 0,14 мл проби додавали 2 мл гексану (30 °С ) i 0,28 мл КОН (1 М в 70% метанол^ 30 °С), пробiрки перемшу-вали впродовж 2,5 хв i витримували на водянiй баш при
30 °С впродовж 20 хв, перюдично помiшуючи. Реакцш зупиняли 0,03 мл оцтово! кислоти. Метильованi жирнi кислоти, як! знаходилися в гексановому шар!, анал!зу-валися на газовому хроматографi. При малш юлькосл проби до 28 мкл додавали 0,5 мл гексану i 56 мкл КОН (1 М в 70% метанол!, 30 °С) i проводили вш процедури, описан! вище [14]. Групу контролю становили вщносно здоров! особи (n = 7).
Для статистичного анал!зу даних використовували дескриптивну статистику; пор!вняння середшх зна-чень перемшних здшснювали за допомогою параме-тричних метод!в (t-критерш Стьюдента) за нормального розподту даних ознак, виражених в штервальнш шкал!. Вщповщшсть виду розподту ознак закону нормального розподтення перев!ряли за допомогою методу Шатро — Ушка. В шших випадках використовували непараметричний метод (U-критерш Манна — У]!тш). Ус! розрахунки виконували у програм! SPSS 9.0 for Windows [15]. Ус! засоби вим!рювально! техшки, як! використовувались при виконанш роботи, мали ме-тролопчну пов!рку в установленому порядку.
Результати та обговорення
Морфолопчна картина в I груш пащенпв являла собою осередки великокрапельно! жирово! дистрофи на rai вщсутносп ф!брозу або тонких ф!брозних септ та незначного накопичення клгган запалення. Для II групи пащенпв були характерш найбтьш виражеш показники запалення та активност гепатиту: шфть-тращя портальних тракпв вщ пом!рно! до виражено!, штрачасточкова шфтьтращя, вогнища некрозу гепа-тоципв, збтьшення юлькосп л!мфо!дних фол!кушв та жирова дистроф!я, яка найчастше супроводжувала пом!рне ф!брозування та в бтьшосп випадюв являла собою осередки др!бнокрапельного або змшаного сте-атозу, що розташоваш в середин! часточок i не зачша-ють прикордонну пластинку. Морфолопчна картина в III груш пащенпв характеризувалась в першу чергу значною дезоргашзащею лшщних включень та помп"-
ними змшами пстолопчно1 структури як за рахунок запалення, так пдрошчно1 дистрофи гепатоцитiв (рис. 1).
При бiохiмiчному дослiдженнi спектра ВЖК у си-роватцi кровi пацiентiв iз ХДЗП нами було щенти-фiковано бшьше 20 фракцiй, серед яких таю основнi насиченi жирнi кислоти: мiристинова С14:0, пентоде-канова С15:0, пальмгганова С16:0, стеаринова С18:0, такi основш ненасиченi жирнi кислоти: олешова С18:1, лiнолева С18:3, арахщонова С20:4 (табл. 1).
Незалежно вiд етiологiчного фактора розвиток ХДЗП супроводжувався статистично значущим пд-вищенням умiсту пальмгтновох та олешово! жир-них кислот у сироватш кровi порiвняно з контролем. В ушх групах хворих сумарний умют ВЖК у сироват-Ш кровi був пiдвищений: у I груш — у 21,2 раза, до (5,528 ± 0,967) мкг/мкл, р < 0,001; у II груш — у 23 раза, до (5,987 ± 3,109) мкг/мкл, р < 0,001, у III груш — у 45,5 раза, до (11,83 ± 6,19) мкг/мкл, р < 0,01, порiвняно з групою контролю ((0,26 ± 0,09) мкг/мкл) (табл. 1).
Для пащентав з I та II групи було характерним вiро-пдне пдвищення вмюту найбтьш токсично1 фракци — пальмггановох (С16:0) вiдповiдно на 22,2 % (р < 0,05) та на 20,8 % (р < 0,05) щодо контролю (табл. 1). При цьо-му бшьшють морфолопчних показниюв, пов'язаних iз запаленням, були найменш вираженими в I груш паць ентiв (рис. 2А).
Так, дифузна шфтьтращя портальних трактiв у I груш пащенпв зустрiчалася вiрогiдно рiдше — у 9,1 % випадюв порiвняно з 43,75 % випадюв у II групi та 37,5 % випадюв у III груш; осередки некрозу та лiмфо-1дш фолили також зустрiчались вiрогiдно рiдше, нiж у пацiентiв iз ХГС.
Iз чим же в такому випадку пов'язане збiльшення токсично1 фракци? На нашу думку, таке збтьшення може пояснюватися в тому чи^ й поширеною пдро-шчною дистрофiею гепатоцитiв, що зустрiчалася в цш групi пацiентiв частiше за iншi — у 54,5 % випадюв по-рiвняно з 18,75 % випадюв в II груш та 25,0 % випадюв в III груш.
Рисунок 1 — А) Перипортальний фiброз без септ (F1 за Metavir) за умов розвитку НАЖХП. Забарвлення
за Маллорi в модиф'каци Слнченка, зб. х200. Б) Локалiзована велико- та середньокрапельна жирова дистроф 'я на mi щльного перипортального ф'брозу (F3 за Metavir) за умов розвитку ХГС. Забарвлення за Маллорi в модифкацп Слнченка, зб. х100. В) Численн ф'брозш септи (F3 за Metavir) та помiрна активнсть гепатиту за умов розвитку АХП. Забарвлення за Маллорi в модифкацп Слнченка, зб. х200
Таблиця 1 — Спектр вльних жирних кислот (мкг/мкл) сироватки кров'1 в па^ент'в '¡з хро^чними
дифузними захворюваннями печ'1нки, М ± т
Бюх1м1чний показник Групи
Контрольна (n = 7) I (n = 38) II (n = 13) III (n = 15)
Бутират C4:0 2,63 ± 0,84 5,34 ± 1,18 5,653 ± 2,88 5,354 ± 3,632**
Капроат С6:0 0,07 ± 0,02 0,809 ± 0,297* 0,654 ± 0,389 1,397 ± 0,528*
Каприлят С8:0 0,51 ± 0,07 1,926 ± 0,761* 1,983 ± 0,816 8,118 ± 5,245
Додеканоат С12:0 0,002 ± 0,000 0,012 ± 0,005 0,004 ± 0,003 0,005 ± 0,002
Тридеканоат С:13 0 0,002 ± 0,000 0,002 ± 0,000 0,001 ± 0,000
Мiристат С14:0 0 0,008 ± 0,005 0,014 ± 0,013 0,067 ± 0,057
Пентадеканоат С15:0 0,020 ± 0,003 0,022 ± 0,006 0,006 ± 0,003* 0,007 ± 0,002**
Пентадеканоат С15:1 (cis-10) 0 0,008 ± 0,004 0,008 ± 0,006 0,003 ± 0,002
Палымлтат С16:0 0,001 ± 0,000 0,004 ± 0,001* 0,034 ± 0,028* 0,016 ± 0,006
Палымлтолеат С16:1 (cis-9) 0,001 ± 0,000 0,003 ± 0,001 0,004 ± 0,001 0,003 ± 0,000
Гептадеканоат С17:0 0,016 ± 0,003 0,024 ± 0,007 0,036 ± 0,026 0,029 ± 0,010
Гептадеканоат С17:1 (cis-10) 0,0012 ± 0,000 0,005 ± 0,002 0,005 ± 0,004 0,008 ± 0,004
Стеарат С18:0 0,04 ± 0,01 0,052 ± 0,018 0,008 ± 0,003 0,009 ± 0,004
Олеат С18:1 (cis-9) 0,007 ± 0,002 0,013 ± 0,005 0,012 ± 0,006 0,062 ± 0,001**
Октадеканоат C18:1 (trans-9) 0,003 ± 0,001 0,015 ± 0,009 0,016 ± 0,010 0,044 ± 0,035
ЛЫолеат С18:2 (cis-9,12) 0 0,007 ± 0,003 0,020 ± 0,017 0,011 ± 0,005
Лiнолеаíдат С18:2 (trans-9,12) 0,015 ± 0,004 0,135 ± 0,074 0,114 ± 0,075 0,059 ± 0,048
Лiноленат С18:3 (cis-9,12,15) 0,13 ± 0,07 0,368 ± 0,131 0,517 ± 0,336 0,765 ± 0,202
Арахщат С20:0 0 0,014 ± 0,006 0,058 ± 0,047 0,083 ± 0,075
Ейкозеноат С20:1 (cis-11) 0,009 ± 0,001 0,175 ± 0,145 0,195 ± 0,182 0,031 ± 0,024
Генекозаноат С21:0 0,04 ± 0,01 0,680 ± 0,576 0,113 ± 0,063 0,295 ± 0,099*
ВЖК 0,26 ± 0,09 5,528 ± 0,967*** 5,987 ± 3,109*** 11,83 ± 6,19**
Примтки: в'рогщтсть змн м'ж показниками хворих порiвняно з групою контролю: * — р < 0,05; ** — р < 0,01; *** — р < 0,001.
Рисунок 2 — Великокрапельна жирова дистроф'я гепатоцитв, характерна для пацентв I групи. А) Стеатоз без ознак запалення на ^ портального фiброзу без септ. Забарвлення за Маллор1 в модиф'каци Слнченка, зб. х200. Б) Гомогенн лЫдн'! включения темно-янтарного кольору. Напвтонкий зр'з печшки хворого на НАЖХП. Забарвлення толущиновим синм, зб. х1000
Крiм цього, у пащентав I групи вiдбувалося шдси-лення синтезу пентадеканово! кислоти (С15:1) iз бiльш низькомолекулярних попередниюв. Це можна поясни-ти тим, що при формуваннi НАЖХП вiдбуваеться пере-будова метаболiчних шляхiв з активним використанням протонату, який е субстратом не ттьки для синтезу жирних кислот iз непарним числом атомiв вуглецю, а й для утворення амiнокислот (глутамату, аспартату, глутамiну), азотистих основ фосфолшщв. На мшро-структурному рiвнi дислiпiдемiя характеризуеться на-явнютю великих гомогенних (простих за складом) жи-рових крапель у цитоплазмi гепатоцитiв. За допомогою методики натвтонких зрiзiв були локалiзованi цi лшд-нi включення темно-янтарного кольору, яи рiвномiрно заповнювали всю цитоплазму гепатоципв (рис. 2Б).
На вiдмiну вщ цього для II групи пащенпв були ха-рактернi найбiльш виражеш показники запалення та активностi гепатиту: шфтьтращя портальних трактiв вiд помiрноl до виражено!, iнтрачасточкова шфтьтращя, вогнища некрозу гепатоцитiв (рис. 3А).
Необидно зазначити, що збтьшення ктькосп лiм-фо!дних фолiкулiв, що е ознакою персистенци ХГС, вiрогiдно частше зустрiчалося в цiй групi порiвняно з 12,5 % випадкiв в III групi пацiентiв, зовсiм не зустрь чалося в I груш. Вiрогiдна рiзниця мiж дослщжувани-ми групами проявлялась i в частот виявлення адгези лiмфоцитiв та нейтрофтьних лейкоцитiв у синусоидах. У дослщжуваних препаратах напiвтонких зрiзiв парен-хiми печiнки пацiентiв II групи адгезiя нейтрофiльних лейкоцитiв в синусощах була виявлена в 31,25 % випад-ыв, а адгезiя лiмфоцитiв — у 75,0 %, у той час як у I груш пащентав адгезiя нейтрофтьних лейкоцилв була виявлена в 9,1 % випадыв, а адгезiя лiмфоцитiв — у 27,3 %.
Змши в спекщ ненасичених жирних кислот при ХДЗП характеризувалися накопиченням моноенових жирних кислот за рахунок зростання частки пальмгго-лешово! кислоти (С16:1) в I груш пащенпв в 1,8 раза, у II груш — в 1,7 та в III груш — 8,8 раза, а також зни-женням вмюту полiенових кислот, що виникало лише завдяки втсутносп фракци жирно! кислоти С20:4.
Рисунок 3 — Жирова дистрофiя гепатоципв, характерна для па^ен^в II групи. А) Характерна локалiзацiя
лпщних крапель, перипортальне запалення та фiброзування. Забарвлення за Маллорi в модиф 'каци Слнченка, зб. х200. Б) Гетерогеннсть лпщних крапель, '¡нкруста^я лпщних включень лпщами високо/ щшьносл. Напвтонкий зр'з печ'1нки, забарвлення толущиновим синм
— Г
j
w>l 1, rJ| МВ< I
, - . 4 'I
i ■ М f *
4
J 1
L ' * ■
4 1'. .
I „ >..
Г »Л-' \ .t
• *
А_
_____1_—__:_u
? ' -
.... ■ ' ■* > U '
lSI1
jb
jk
iff 0 r
Рисунок 4 — Жирова дистроф'т гепатоцитв, характерна для пацентв III групи. А) На тл'1 поширено/ бтково/ дистрофп осередки велико/середньокрапельного стеатозу займають до 30 % боптату. Забарвлення гематоксилном та еозином, зб. х200. Б) ЛЫдн крапл'1 поряд i3 загиблими гепатоцитами. Напвтонкий зр 'з печ'1нки, забарвлення толу/диновим синм
Отже, треба зазначити, що II група пащенпв характе-ризувалася менш вираженими, але бтьш рiзноманiт-ними змiнами лiпогенезу. Це пттверджуеться також i тим, що дослщження бiоптатiв методикою нашвтон-ких зрiзiв дозволило продемонструвати гетерогеннiсть складу лшщних крапель у гепатоцитах, а також гетеро-геннiсть !х розмiру. Так, за допомогою методики натв-тонких зрiзiв у II груш пащенпв були виявленi лшт-ш краплi янтарного кольору, дрiбнi та середш лiпiднi краплi бурого кольору, дуже дрiбнi прозорi краплi, яю рiвномiрно заповнювали цитоплазму гепатоцитiв. У лшщних краплях великого розмiру спостериалась ш-крустацiя лiпiдами бiльш високо! щiльностi, що харак-теризувалась бтьш темним кольором (рис. 3Б).
У III груш пащенпв спостериалися найбтьш по-мiтнi змiни морфолопчно! будови здебтьшого за ра-хунок дезоргашзаци будови, запалення, апоптозу та некрозу гепатоципв, осередково1 жирово1 дистрофи гепатоципв (рис. 4). Також у пащенпв цiе! групи вияв-лено й вiрогiдне пiдвищення пальмiтиново! (С16:0) та олешово1 (С18:1) кислот.
З метою об'ективiзацil результатiв було проведено послщовне морфометричне дослiдження бiоптатiв iз пщрахунком iндексу фiброзу (вiдношення площi фь брозно1 тканини до загально1 площi бiоптату), iндексу стеатозу (кiлькiсть гепатоципв у сташ жирово1 дистрофи на 100 клiтин) та ктькосп апоптотично змiнених клiтин у 5 послщовних великих полях зору.
Морфометричне дослщження показало, що ш-декс стеатозу був найвищим у I груш пашенпв — (0,36 ± 0,11), що пщтверджуе даш морфолопчного дослiдження щодо поширеностi жирово1 дистрофи, при цьому iндекс фiброзу був найменшим та стано-вив (0,0443 ± 0,0110). У II груш пащенпв було зафш-совано найбтьш значш коливання iндексу стеатозу iз середнiм значенням (0,23 ± 0,09), у той час як шдекс фiброзу становив (0,0812 ± 0,0600). III група пащенпв вiрогiдно вiдрiзнялась вiд I групи за шдексом фiброзу (0,1266 ± 0,0130) та стеатозу (0,2289 ± 0,1500), при цьому щ показники в данш групi були найвищими.
При розрахунку коефiцieнтiв спiввiдношення окре-мих фракцш жирних кислот було виявлено зниження kl в групах пащенпв: у I — в 1,4 раза; II — у 8,5 раза; у III — у 38,0 раза, що свщчить про зниження акгивносп основного ферменту лшоксигеназного шляху Д9-десатурази та, як наслщок, зниження клиинного росту та диферен-щацй за рахунок 11 впливу на текучiсть мембран та сиг-нально! трансдукцй' (рис. 5). Було виявлено зниження k2 в I груш пащенпв в 1,3 раза, у II груш — у 8,3 раза та в III груш — у 5,3 раза порiвняно з контролем, що може свщчити про зниження активносп Дб-десатурази.
Про недостатню активнють ферменту елонгази свтчило зниження k3 в I груш 3 раза, у II груш — у 6,0 раза та III груш — 7,0 раза порiвняно з контролем, що втображае зниження активносп синтезу ненасичених жирних кислот у пащенпв вшх груп (рис. 5).
Таким чином, для пащенпв iз НЖХП е характерни-ми численш морфолопчш та бiохiмiчнi патомеханiзми: пiдвищення синтезу ВЖК у сироватщ кровi та !х нако-пичення у печшщ (токсичний вплив), запальнi проце-си (ушкодження гепатоцитiв), присутнiсть окисного стресу (табл. 2).
Для пащенпв iз НАЖХП та ХГС тератя перш за все повинна бути направлена на детоксикацш оргашзму, зниження вмюту ВЖК; для пацieнтiв iз токсичним гепатитом алкогольного генезу — на зниження окисного стресу та захист органел клиин, уш щ факти слiд врахо-вувати при призначенш лiкування пацieнтам iз хрошч-ними дифузними захворюваннями печiнки.
Висновки
1. У пащенпв iз ХДЗП у лiпiдному екстрактi сиро-ватки кровi було виявлено пiдвищення вмюту ВЖК, що шдтверджуе гiпотезу про пролонговану лшоток-сичну дiю цих кислот на печшку, рiзнонаправленi змь ни окремих фракцiй ВЖК, зниження/втсутшсть вмi-сту арахгдоново! жирно! кислоти (С20:4) в мембранних структурах гепатоципв як наслток iнтенсивного вико-ристання ще! фракцй' у вiльнорадикальних реакщях та синтезi простагландинiв.
Рисунок 5 — Коеф '1ц'1енти спiввiдношення фракцй вльних жирних кислот л'т'щного екстракту
сироватки KpoBi
Примтки: kl — стввщношення концентрацй стеариново/ кислоти та олеУновоУ (С18:0/С18:1); k2 — стввщношення концентрацй пальм'толетово) кислоти та пальм'пиново)'(С16:1/С16:0); k3—стввщношення концентрацй стеариново/ кислоти та пальмтиново/ (С18:0/С16:0).
Таблиця 2 — Узагальнююча схема морфоб'юхЫчних змн при ХДЗП. ХрошчН дифузн захворювання печнки (ппотетичн морфоб'юх'м'чн патомеханзми)
Неалкогольна жирова хвороба печшки Хронiчний гепатит, асоцiйований i3 вiрусом С Алкогольна жирова хвороба печiнки
Токсичш процеси (б 'юх'ш 'нний показник) Палыммтинова С16:0 Стеаринова С18:0 ttt Палымiтинова С16:0 СтеариноваС18:0 ttt Палым^инова С16:0 СтеариноваС18:0 t
Загибель гепатоцилв (морфолопчний показник) Гщротчна дистрофiя t Некроз гепатоцитiв tt Гщротчна дистрофiя Некроз гепатоцитiв Апоптоз гепатоцилв ttt
Запалення (бЮх'ш 'нний показник) ОлеТнова С18:1 (cis-9) в 1,8 раза ОктадеканоТнова С18:1 (trans-9) у 5 разiв t ОлеТнова С18:1 (cis-9) в 1,7 раза ОктадеканоТнова С18:1 (trans-9) у 5,3 раза t ОлеТнова С18:1 (cis-9) у 8,8 раза ОктадеканоТнова С18:1 (trans-9) у 14,6 раза t t
Запалення (морфолопчний показник) Перипорталына Ыфтытрафя 1нтрачасточкова iнфiлытрацiя Адгезiя лiмфоцитiв ЛiмфоТднi фолiкули Виражена перипорталына iнфiлытрацiя 1нтрачасточкова Ыфтытрафя
Оксидативний стрес (б 'юх'1м '1чний показник) Арахщонова С20:0 в 4,0 раза Арахiдонова С20:0 в 4,5 раза Арахiдонова С20:0 в 6,4 раза
Коефщенти ВЖК (б 'юх'1м '1чний показник) kl, k2, k3 i kl, k2, k3 i kl, k2, k3 i
2. Типова морфолопчна картина при НАЖХП являла собою осередки великокрапельно! жирово! дистрофп на xni незначного фiброзування та запалення. Для ХГС були характерш найбiльш вираженi показники запалення та активност гепатиту на тлi жирного фiброзування та дрiбнокрапельного або змшаного стеатозу. У групi ХГС були зафшсоваш найбiльш значнi коливання шдексу стеатозу зi середнiм значенням (0,23 ± 0,09), у той час як шдекс фiброзу становив (0,0812 ± 0,0600). У гру-m АХП iндекси фiброзу (0,1266 ± 0,0130) та стеатозу (0,2289 ± 0,1500) були найвищими, а типова морфолопчна картина характеризувалася в першу чергу значною дезоргашзащею лшщних включень та помiтними змша-ми пстолопчно! будови за рахунок як запалення, так i гiдропiчно! дистрофи гепатоцитiв.
3. При розрахунку коефщентав сшввщношен-ня окремих жирних кислот було виявлено зниження k1 у групах пацieнтiв: у I — в 1,4 раза; у II — у 8,5; у III — 38,0 раза; k2 в групах пащенпв: у I — в 1,3 раза, у II — 8,3, III — у 5,3 раза, що свщчить про зниження активност ферменпв лшоксигеназного шляху, яы беруть участь у подовженш вуглеводного ланцюга та утворенш подвiйного зв'язку в молекулi жирно! ки-слоти; k3 в групах пащенпв: у I — у 3 рази, у II — 6, у III — у 7 разiв порiвняно з контролем, вщображае зниження синтезу ненасичених жирних кислот у па-щенпв всiх груп.
4. Морфолопчш та бiохiмiчнi показники при АХП вiрогiдно вiдрiзнялись вiд НАЖХП: за шдексом фiбро-зу ((0,1266 ± 0,0130) порiвняно з (0,0443 ± 0,0110)) та стеатозу ((0,2289 ± 0,1500) порiвняно з (0,36 ± 0,11)).
Науково-практичне впровадження. Ця робота взноситься до числа фундаментальних дослiджень у галузi бiохiмi! та морфологй'. Отриманi результати значно доповнюють сучаснi уявлення щодо бiохiмiчних ме-ханiзмiв розвитку хронiчних дифузних захворювань
печiнки. Визначення BMicTy втьних жирних кислот у сироватцi KpoBi пацieнтiв i3 хронiчними дифузни-ми захворюваннями печiнки впроваджено в ктшчну практику нашого iнституту, що дозволяе значно по-кращити диференцiальну дiагностику та ефективнiсть лiкування виявлених порушень. Метод юльюсно! гiстологiчноi оцiнки стади фiброзу та стеатозу при хрошчних дифузних захворюваннях печiнки за допо-могою комп'ютерно! морфометри дозволяе отримати числовi данi та проаналiзувати !х зв'язок iз iншими гiстологiчними, лабораторними та ктшчними даними. На вщмшу вiд звичайно! гiстологiчноi оцiнки бюптатав додаткова морфометрична характеристика дае мож-ливiсть отримання бiльш точних, об'ективних, вщтво-рюваних результатiв. Розробка пройшла апробацiю в лаборатори патоморфологи ДУ «1нститут гастроенте-рологи НАМН Укра!ни», КЗ УОЗ МКЛ №2 (м. Харюв), КЗ «ЦПМСД №2» (м. Вшниця) з позитивними результатами (значне тдвищення точностi морфологiчного достижения).
Конфлшт iHTepeciB. Автори заявляють про вщсут-нiсть конфлiкту iнтересiв при шдготовщ статтi.
References
1. Stepanov YuM. The use of essential phospholipids for the treatment of fatty liver disease. Gastroenterologia. 2016;(62):58-64. (in Russian).
2. Didenko VI. Recent advances in the assessment of hepatic steatosis. Gastroenterologia. 2015;(57):94-100. (in Ukrainian).
3. Chen R, Han S, Dong D, et al. Serum fatty acid profiles and potential biomarkers of ankylosing spondylitis determined by gas chromatography-mass spectrometry and multivariate statistical analysis. BiomedChromatogr. 2015 Apr;29(4):604-11. doi: 10.1002/ bmc.3321.
4. Wang DC, Sun CH, Liu LY, et al. Serum fatty acid profiles
using GC-MS and multivariate .statistical analysis: potential biomark-ers of Alzheimer's disease. Neurobiol Aging. 2012 Jun;33(6):1057-66. doi: 10.1016/j.neurobiolaging.2010.09.013.
5. Cao H, Hotamisligil GS. Fatty acid cl6: 1n7-palmi-toleate a lipokine and biomarker for metabolic status. Patent US20110213032A1; 2011.
6. Jiang M, Chen T, Feng H, et al. Serum metabolic signatures of four types of human arthritis. J Proteome Res. 2013 Aug 2;12(8):3769-79. doi: 10.1021/pr400415a.
7. Perez-Cornago A, Brennan L, Ibero-Baraibar I, et al. Me-tabolomics identifies changes in fatty acid and amino acid profiles in serum of overweight older adults following a weight loss intervention. J Physiol Biochem. 2014 Jun;70(2):593-602. doi: 10.1007/s13105-013-0311-2.
8. Copaci I, Lupescu I, Caceaune E, Chiriac G, Ismail G. Noninvasive markers of improvement of liver steatosis achieved by weight reduction in patients with nonalcoholic fatty liver disease. Rom J Intern Med. 2015 Jan-Mar;53(1):54-62. doi: 10.1515/rjim-2015-0008.
9. Butorova LI, Kalashnikova MA, Kraynikova NG, Osad-chuk MA, Plavnik TE, Tokmulina GM. Hepatoprotective therapy of alcoholic and non-alcoholic fatty liver disease. Effective Pharmaco-therapy. 2016;(34):12-21. (inRussian).
10. Baryshnikova NV, Belousova LN. Alcoholic liver disease: features of diagnosis and treatment. Consilium Medicum. Gastroen-terologiia. 2014;(2):16-18. (inRussian).
11. Didenko VI, Klenina IA, Babii SO, Karachynova VA. Topicality of identification of free fatty acids pattern in biologic substrates in the diagnosis of gastroenterological diseases. Gastroenterologia. 201;51(2):137-141. (in Ukrainian).
12. Zygalo EV, Jagmur VB,Klenina IA, Melanich SV Popok DV, Skorohod TO. The role of intestinal microbiota in the development of lipid metabolism disorders in patients with non-alcoholic fatty liver disease. Medychnyj forum. 2017;(12):31-34. (in Ukrainian).
13. Sapozhnikov AG, Dorosevich AE. Gistologicheskaia i mik-roskopicheskaia tekhnika: rukovodstvo [Histological and microscopic technique: a guide]. Smolensk: SAU; 2000. 476p. (in Russian).
14. Ichihara К, Yamaguchi C, Araya Y, Sakamoto A, Yoneda K. Preparation of fatty acid methyl esters by selective methanolysis of polar glycerolipids. Lipids. 2010 Apr;45(4):367-74. doi: 10.1007/ s11745-010-3404-5.
15. Eniukov IS. Metody, algoritmy, programmy mnogomerno-go statisticheskogo analiza. Paket PPSA [Methods, algorithms, programs of multivariate statistical analysis. Package PPSA]. Moscow: Finansy i statistika; 1986. 232 p. (in Russian).
Отримано 20.05.2018 ■
Степанов Ю.М., Диденко В.И., Кленина И.А., Карачинова В.А., Ошмянская Н.Ю. ГУ «Институт гастроэнтерологии НАМН Украины», г. Днепр, Украина
Спектр жирных кислот сыворотки крови пациентов с хроническими диффузными заболеваниями печени в зависимости от этиологии и морфологических особенностей
Резюме. В статье представлены морфологические особенно
сти (по данным гистологических методов исследования, метода полутонких срезов и компьютерной морфометрии) развития и прогрессирования хронических диффузных заболеваний печени, хронического гепатита, ассоциированного с вирусом С, и алкогольной болезни печени. Показано, что в зависимости от этиологического фактора важное отличие было выявлено по характеру, степени стеатоза и локализации липидных капель, что свидетельствует о расхождениях некоторых биохимических механизмов накопления липидов в гепатоцитах. Рассмотрена роль свободных жирных кислот сыворотки крови при данных заболеваниях, выявлено повышение их содержания в сыворотке крови, установлен дефицит некоторых фракций, что может
быть одной из причин формирования неалкогольной жировой болезни печени и других заболеваний, связанных с обменом веществ. Маркером воспалительных процессов можно считать ленолевую (С18:3) и арахидоновую (С20:0) свободные жирные кислоты. Предложены индексы соотношения жирных кислот, которые позволяют охарактеризовать и установить метаболические пути развития и прогрессирования заболевания, что играет важную роль в дифференцированном подходе при установлении нозологических форм заболеваний печени. Ключевые слова: неалкогольная жировая болезнь печени; алкогольный стеатогепатит; стеатоз печени; хронический гепатит С; газовая хроматография; свободные жирные кислоты; полиненасыщенные жирные кислоты
Yu.M. Stepanov, V.I. Didenko, I.A. Klenina, V.A. Karachinova, N.Yu. Oshmianska
State Institution "Institute of Gastroenterology of the National Academy of Medical Sciences of Ukraine", Dnipro, Ukraine
Spectrum of serum fatty acids in patients with chronic diffuse liver disease depending on etiology and
morphological features
Abstract. The study analyzes morphological features of the develop -ment and progression of hepatic steatosis in non-alcoholic fatty liver disease, chronic hepatitis C and alcoholic fatty liver disease. Depending on etiological factor, the important difference was noted in steatosis nature and degree, localization of lipid droplets, which proves the discrepancy between some biochemical mechanisms of lipid accumulation in the hepatocytes. The role of serum free fatty acids has been considered in these diseases, an increase of their content in the blood serum has been detected, as well as deficiency of certain fractions that may be one of the causes of non-alcoholic fatty liver disease and other
diseases associated with lipid metabolism. It was proved that linoleic (C18:3) and arachidonic (C20:0) free fatty acids can be considered as inflammatory markers. The indices of the fatty acids ratio have been proposed, which allows for better characterization and analysis of metabolic pathways responsible for the development and progression of fatty liver diseases. All this plays an important role in differentiated approaches to the diagnosis and treatment of liver diseases. Keywords: non-alcoholic fatty liver disease; alcoholic steatohep-atitis; liver steatosis; chronic hepatitis C; gas chromatography; free fatty acids; polyunsaturated fatty acids
