CC BY
5МРНТИ 34.15.23
А.Б. СЕЙДАЛИНА1, К О. КАРАМЕНДИН1, Н.Г. КЛИВЛЕЕВА1, Н С. ОНГАРБАЕВА1, А.И. КЫДЫРМАНОВ1, С. ФЕРЕЙДОУНИ2 1ТОО «Научно-производственный центр микробиологии и вирусологии», Алматы,
Казахстан
Венский университет ветеринарной медицины, Вена, Австрия
СОЗДАНИЕ НОВОЙ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ОДНОВРЕМЕННОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ПОДТИПОВ ГЕМАГГЛЮТИНИНА ВИРУСА ГРИППА А Н1, ИЗ, Н5, Н7 И РАЗРАБОТКА
ТЕХНОЛОГИЙ ПРОИЗВОДСТВА
Аннотация
В статье представлены результаты разработки тест-системы для одновременной дифференциальной диагностики подтипов гемагглютинина вируса гриппа А Н1, НЗ, Н5, Н7 в инфицированных материалах больных (носоглоточные, ротовые смывы) в обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР).
Установлен оптимальный режим совместимости праймеров с отработкой температурно-временных показателей для постановки мультиплекс - ПЦР.
Изобретение относится к клинической вирусологии, а именно к разработке средств для идентификации вируса гриппа А в ПЦР.
Ключевые слова: грипп, тест-система, мультиплексная полимеразная цепная реакция, праймер.
Грипп является наиболее распространенным инфекционным заболеванием вирусной этиологии, наносящий не только значительный вред здоровью человека, но и чрезвычайно большой экономический ущерб. Даже обычный сезонный вирус гриппа и связанные с ним осложнения служат причиной смерти более 200 тысяч человек в год.
В современный период наибольшую угрозу представляют новые пандемические варианты вируса гриппа А, которые могут возникнуть в результате рекомбинации генов вирусов гриппа человека, животных и птиц, а также возврат старых высокопатогенных вариантов гриппа, к которым у населения уже отсутствует иммунитет [1, 2, 3].
Спектр эпидемических штаммов вируса гриппа и их характеристика меняются в зависимости от сезонов года. В последнее время в мире, в том числе и различных регионах Казахстана, наблюдается одновременная циркуляция вирусов гриппа подтипов А(Н1Ш), А(НЗ№) и типа В [4]. Кроме того, необычайная сложность эпидемической ситуации связана с появлением реассортантных вирусов. Поэтому грипп, несмотря на успехи, достигнутые в области лечения и профилактики, является одной из немногих инфекций, вызывающих непредсказуемые и чрезвычайные эпидемические ситуации [5].
В последние годы для обнаружения и идентификации вирусов в мире большое распространение получил метод ПНР, основанный на амплификации ДНК-копий специфического участка генома вирусов [6]. Несмотря на широкое применение ПЦР в диагностике заболеваний, с ее помощью можно обнаружить только один инфекционный агент, в то время как мультиплекс ПЦР позволяет выявить несколько возбудителей одновременно в одной реакции, что значительно снижает стоимость диагностических процедур при сочетании высокой чувствительности и скорости реакции.
В связи с этим, разработка предлагаемой нами мультиплексной ПЦР тест-системы, является актуальной задачей, направленной на своевременную дифференциальную диагностику вирусов гриппа с целью оптимизации мероприятий по контролю над распространением возбудителей вирусных инфекций в Казахстане.
Материалы и методы
Сбор полевых материалов. Для вирусологических и молекулярно-биологических исследований с октября 2019по март 2020 гг. проведен сбор биологических материалов от пациентов с признаками гриппа.
Выделение вирусной РНК из клинических образцов проводили с использованием коммерческого набора QIAamp RNA Mini (Qiagen, Hilden, Germany), согласно рекомендациям производителя.
Конструирование сегментспецифических праймеров.
Конструирование праймеров проводили с помощью компьютерной программы OligoExplorer. Праймеры выбирали, применяя следующие параметры:
- длина праймеров 18-22 п.н.о.; процентное содержание G+C пар - 40-60;
- отсутствие залипания праймеров на самих себя;
- отсутствие образования димеров;
- температура плавления в пределах 50-56 °С;
Мультиплекс полимеразная цепная реакция.
Оптимальный режим совместимости праймеров к вирусам гриппа и ОРВИ устанавливали при их одинаковых концентрациях и условиях термоциклирования в мультиплекс - ПИР Подбор оптимального режима для постановки мультиплекс - ПИР проводили путем варьирования параметров температуры и времени. Реакцию ставили в термоциклере SimpliAmpThermalCyclerAppliedBiosystems (США).
Пробы кДНК и ДНК вносили одновременно каждой по 2 мкл в реакционную смесь.
Электрофоретический анализ продуктов ПЦР. Электрофорез проводили в 2% растворе агарозы (Sigma, США) в трис-ацетатном буфере при напряжении 88V (8 вольт/см) на аппарате Biostep (Великобритания).
Результаты и обсуждение
С учетом полученных эпидемиологических данных из 285 положительных на грипп А биоматериалов (носоглоточные смывы от больных с признаками инфекции) сформирован набор из пулов для молекулярного анализа состава РНК и ДНК-содержащих вирусных метапопуляций возбудителя гриппа А.
Дополнительно в набор вошли 13 казахстанских штаммов возбудителей гриппа и референсные варианты вирусов гриппа, предназначенные для испытания чувствительности тест-систем.
Для разработки технологии производства ПЦР тест-системы для дифференциальной диагностики подтипов гемагглютинина вируса гриппа А сконструирован комплект праймеров для амплификации фрагмента кДНК. В результате анализа основных параметров выбраны и синтезированы 3 прямых и 3 обратных праймера для специфической ПЦР-диагностики подтипов вируса гриппа А.
Далее были отработаны оптимальные условия постановки реакции. Обратная транскрипция проводилась при температуре +480С в течение 45 мин. Денатурацию кДНК в исследуемой пробе осуществляли при температуре +950С. Гибридизацию (отжиг) специфических олигонуклеотидных затравок (праймеров) с исследуемой ДНК проводили при температуре +52°С. Комплементарные цепи ДНК синтезировали с помощью термостабильной ДНК-полимеразы при температуре +72°С. В результате проведения 35 циклов амплификации концентрация синтезированного фрагмента в исследуемой пробе увеличивалась экспоненциально, что позволяло учесть результаты анализа с помощью электрофореза в агарозном геле.
Следующим этапом исследования явилось испытание чувствительности и специфичности тест-системы, которое проводили с использованием приготовленных и охарактеризованных тест-панелей клинических образцов, собранных в эпидемиологический сезон 2019-2020 гг., а также казахстанских изолятов и референсных штаммов вируса гриппа различных подтипов. Данные исследований отображены в
таблице. По результатам проведенного тестирования показана высокая специфичность и чувствительность разработанной тест-системы.
Таблица - Результаты испытаний чувствительности набора для дифференциальной диагностики подтипов гемагглютинина вируса гриппа А (Н1, НЗ, Н5, Н7) на клинических образцах, казахстанских и референсных штаммах
Клинические пробы и штаммы Количество клинических образцов положительных на грипп А, идентифицированных с помощью набора дифференциальной диагностики подтипов вируса гриппа А:
HI НЗ Смешанная инфекция (HI и НЗ) Н5 Н7
Клинические пробы (п=285) 173 (60,7%) 94 (32,9%) 18 (6,3%) - -
Референсные штаммы вирусов гриппа А (п=8) 3 2 - 2 1
Казахстанские штаммы вирусов гриппа А (п=13) 7 - - 5 1
Как видно из таблицы, с помощью разработанного набора определена подтиповая структура инфекций вируса гриппа А, где 60,7% исследованных проб отнесены к вирусу гриппа А с подтипом гемагглютинина HI и 32,9% идентифицированы как вирус гриппа А/НЗ; 6,3% выявлены как микст-инфекции. Вирус гриппа А с подтипами гемагглютининов Н5, Н7 не выявлены в этиологической структуре гриппозной инфекции эпидемиологического сезона 2019-2020 гг.
Праймеры для идентификации подтипов вируса гриппа А /Н5, Н7 амплифицировали ожидаемые продукты только соответствующих подтипов референсных штаммов и казахстанских изолятов птичьего происхождения.
Таким образом, разработанная технология приготовления ПЦР тест-системы для дифференциальной диагностики подтипов гемагглютинина вируса гриппа А/Н1, НЗ, Н5, Н7 в ПНР, обеспечивает высокую специфичность и чувствительность набора, что позволяет использовать ее в качестве инструмента для идентификации эпидемически актуальных подтипов вирусов гриппа А.
На следующем этапе был изготовлен экспериментальный набор для одновременной дифференциальной диагностики в ПЦР возбудителей гриппа А HI, НЗ, Н5, Н7 -включающий: ПЦР-буфер (универсальная смесь, содержащая ПЦР-буфер для Taq-полимеразы, MgC12, и дНТФ); смесь ферментов обратной транскриптазы и полимеразы, короткие нуклеотидные затравки (праймеры). Разработанная тест-система предназначена для проведения 50 реакций.
Заключение
Таким образом, в ходе исследований решены следующие задачи:
- разработаны комплекты праймеров для одновременного выявления гриппа А подтипов HI, НЗ, Н5, Н7 методом мультиплескс ПЦР;
- оптимизированы условия ПЦР для достижения ее высокой чувствительности и специфичности;
- установлены аналитические характеристики ПЦР - чувствительность и специфичность.
Составлено временное наставление по применению тест-системы М-ПЦР для дифференциальной диагностики возбудителей гриппа А HI, НЗ, Н5, Н7.
Составлена инструкция по изготовлению и контролю тест-системы М-ПЦР для дифференциальной диагностики возбудителей гриппа А HI, НЗ, Н5, Н7, в которой осуществлен анализ действующей нормативной документации, относящейся к данному документу; определены технические требования к продукции и конкретные показатели
этих требований, установлены методы испытаний - по всем предусмотренным показателям и требования безопасности производства продукции, определены требования к маркировке, упаковке, транспортированию и хранению продукции.
Литература:
1 Rambaut A., Pybus O.G., Nelson M.I., Viboud C., Taubenberger J.K., Holmes E.C. The genomic and epidemiological dynamics of human influenza A virus // Nature. - 2008. - Vol. 453. - P. 615-619.
2 Memoli M.J., Athota R., Reed S., et al. The natural history of influenza infection in the severely immunocompromised vs nonimmunocompromised hosts // Clin Infect Dis. - 2014. - Vol. 58. - P. 214224.
3 Салтыкова T.C. Отсроченная смертность при гриппе среди лиц пожилого возраста// ЖМЭИ. - 2010. - №4. - С. 8-13.
4 Глебова Т.И., Ишмухаметова Н.Г., Баймаханова Б.Б., Кузнецова Т.В., Шаменова М.Г., Икранбегийн Р. Циркуляция вируса гриппа человека в Алматы и Алматинской области в 2008-2011 гг. II Мат-лы Межд. науч.-практич. конф. <А.ктуальные проблемы вирусологии, микробиологии, гигиены, эпидемиологии иммунобиологии», Алматы. - 2012. - С. 89-92.
5 Социальное значение эпидемий гриппа [Электронный ресурс]. Дата обновления: 16.11.15. — URL: http://www.vitaminov.net/rus-gripp-epydem-0-20371.html (дата обращения: 6.10.18).
6 Vemula S.V., Zhao J., Liu J., Wang X., Biswas S., Hewlett I. Current approaches for diagnosis of influenza virus infections in humans // Viruses. - 2016. - Vol. 8. - P. 96.
А.Б. СЕЙДАЛИНА1, К.Э. КАРАМЕНДИН1, Н.Г. КЛИВЛЕЕВА1, Н С. ОЦЕАРБАЕВА1, А Н. ^ЫДЫРМАНОВ1, С. ФЕРЕЙДОУНИ2 ^Микробиология жэне вирусология гылыми-енд1рют1к орталыгы»ЖШС, Алматы,
^азакстан
2
Вена ветеринарльщ медицина университету Вена, Австрия
Т¥МАУ ВИРУСЫНЬЩ А Н1, НЗ, Н5, Н7 ГЕМАГГЛЮТИНИН ТУР ТАРМАЦТАРЫН Б1Р МЕЗЕТТЕ ДИФФЕРЕНЦИАЛДЫ БАЛАУГА АРНАЛГАН ЖАЦА БАЛАУЛЬЩ ТЕСТ ЖУЙЕС1 МЕН 0НД1Р1С ТЕХНОЛОГИЯЛАРЫН
Э31РЛЕУ
Тушн
Макалада наукастардьщ инфекцияланган материалдарындагы (назофарингеальды, ауыз куысыньщ шайындылары) кер1 транскрипция - полимеразды т1збекп реакцияда (КТ-ПТР) тумау вирусыньщ - А Н1, НЗ, Н5, Н7 гемагглютинин тур тармактарын дифференциалды балау тест-жуйесш жасау нэтижелер1 келт1ршген.
Мультиплекс-ПТР журпзу ушш температура-уакыт керсетк1штер1 мен праймерлердщ уйлес1мд1л1г1н1ц оцтайлы режим1 бектлд1.
Энертабыс клиникалык вирусологияга, атап айщанда ПТР-де А тумауын аныктайтын куралдарды жасауга арналган.
К1лтт1 сездер:: тумау, тестжуйес1, мультиплекст1 полимеразды т1збект1 реакция, праймер.
IRSTI 34.15.23
A.B. SEIDALINA1, K.O. KARAMENDIN1, N.G. KLIVLEYEVA1, N.S. ONGARBAYEVA1, A.I. KYDYRMANOV1, S. FEREIDOUNI2
1LLP Research and Production Center for Microbiology and Virology, Almaty, Kazakhstan 2University of Veterinary Medicine Vienna, Austria
INVENTION OF A NOVEL TEST SYSTEM FOR SIMULTANEOUS DIFFERENTIAL DIAGNOSTICS OF INFLUENZA VIRUS A HEMAGGLUTININ SUBTYPES H1, H3, H5, H7, DEVELOPMENT OF PRODUCTION TECHNOLOGIES
Summary
The article presents the results of the development of a test system for the simultaneous differential diagnosis of hemagglutinin subtypes of influenza A H1, H3, H5, H7 virus in the materials of infected patients (nasopharyngeal, oral swabs) in a reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR).
Data on optimization of PCR parameters for differential diagnostics of causative agents of widespread infection are presented.
The optimal mode of compatibility of primers with the development of temperature-time parameters for the setting of multiplex-PCR was established.
The invention relates to clinical virology, in particular to the development of tools for identifying influenza A virus in PCR.
Key words: influenza, test system, multiplex polymerase chain reaction, primer.
Influenza is the most common infectious disease of viral aetiology, causing not only a significant threat to human health but also extensive economic consequences. Even the usual seasonal influenza virus and its associated complications cause more than 200,000 deaths a year.
Currently, the greatest threat is posed by novel pandemic variants of the influenza A virus, which may arise as a result of the recombination of genes of human, animal and avian influenza viruses, as well as the return of old highly pathogenic influenza variants to which the population is no longer immunity [1, 2 3].
The spectrum of epidemic strains of the influenza virus and their characteristics change depending on the seasons of the year. Recently worldwide, including in various regions of Kazakhstan, there has been a simultaneous circulation of influenza viruses of subtypes A (H1N1), A (H3N2) and type B [4]. Besides, the extraordinary complexity of the epidemic situation is associated with the emergence of reassortant viruses. Therefore, influenza, despite the advances made in the field of treatment and prevention, is one of the few infections that cause unpredictable and emergency epidemic situations [5].
In recent years, the PCR method based on the amplification of DNA copies of a specific region of the viral genome has become widespread in the world for the detection and identification of viruses [6]. Despite the widespread use of PCR in the diagnosis of diseases, it can detect only one infectious agent. At the same time, the multiplex PCR allows the detection of several pathogens simultaneously in one reaction, which significantly reduces the cost of diagnostic procedures with a combination of high sensitivity and reaction rate.
In this regard, the development of our proposed multiplex PCR test system is an urgent task aimed at the timely differential diagnosis of influenza viruses to optimize measures to control the spread of viral pathogens in Kazakhstan.
Materials and methods
Collection of field materials. For virological and molecular biological research, collection of biological materials from patients with signs of influenza was carried out from October 2019 to March 2020.
Isolation of viral RNA from clinical samples was performed using a commercial QIAamp RNA Mini kit (Qiagen, Hilden, Germany) according to the manufacturer's recommendations.
Segment-specific primer design.
Primers were designed using the OligoExplorer computer program. Primers were selected using the following parameters:
- length of primers 18-22 bp;
- percentage of G + C pairs - 40-60;
- lack of sticking of primers to themselves;
- lack of dimer formation;
- the melting point in the range of 50-56 ° C;
Multiplex polymerase chain reaction.
The optimal mode of compatibility of primers for influenza and ARVI viruses was established at the same concentrations and thermal cycling conditions in multiplex-PCR. The selection of the optimal mode for setting up multiplex-PCR was carried out by varying the parameters of temperature and time. The reaction was run in an Applied Biosystems thermal cycler (USA).
Samples of RNA were simultaneously introduced into the reaction mixture by 2 pi each.
Electrophoretic analysis of PCR products. Electrophoresis was carried out in a 2% agarose (Sigma, United States) in a tris-acetate buffer at a voltage of 88 V (8 volts/cm) on a Biostep apparatus (UK).
Results and discussion
Taking into account the epidemiological data obtained, from 285 biomaterials positive for influenza A (nasopharyngeal swabs from patients with signs of infection), a set of pools was formed for molecular analysis of the composition of RNA and DNA-containing viral metapopulations of the causative agent of influenza A.
Additionally, the set included 13 Kazakh strains of influenza pathogens and reference variants of influenza viruses intended for testing the sensitivity of the test system.
To develop a technology for the production of a PCR test system for differential diagnosis of hemagglutinin subtypes of influenza A virus, a set of primers was designed for amplifying a cDNA fragment. As a result of the analysis of the main parameters, 3 forward and 3 reverse primers were selected and synthesized for specific PCR diagnostics of influenza A virus subtypes.
Further, the optimal conditions for setting up the reaction were worked out. Reverse transcription was carried out at +48°C for 45 min. Denaturation of cDNA in the test sample was carried out at a temperature of + 95°C. Hybridization (annealing) of specific oligonucleotide primers (primers) with the studied DNA was carried out at a temperature of +52°C. Complementary DNA strands were synthesized using thermostable DNA polymerase at +72°C. As a result of 35 amplification cycles, the concentration of the synthesized fragment in the test sample increased exponentially, which made it possible to take into account the analysis results using electrophoresis in agarose gel.
The next stage of the study was to test the sensitivity and specificity of the test system, which was carried out using prepared and characterized test panels of clinical samples collected in the epidemiological season of 2019-2020, as well as Kazakhstani isolates and reference strains of influenza virus of various subtypes. Research data are displayed in the table. Based on the results of the testing carried out, high specificity and sensitivity of the developed test system are shown.
Table - Results of testing the sensitivity of the kit for differential diagnosis of hemagglutinin subtypes of influenza A (H1, H3, H5, H7) virus on clinical samples, Kazakhstani and reference strains
Clinical trials and The number of clinical specimens positive for influenza A identified using the differential diagnosis kit for influenza A virus subtypes:
strains HI H3 Mixed infection (HI &H3) H5 H7
Clinical trials 173 94 (32,9%) 18 (6,3%) - -
(n=285) (60,7%)
Reference strains of
influenza A viruses 3 2 - 2 1
(n=8)
Kazakhstan strains
of influenza A 7 - - 5 1
viruses (n=13)
As can be seen from the table, using the developed kit, the subtype structure of the influenza A virus infection was determined, where 60.7% of the studied samples were attributed to the influenza A virus with the H1 hemagglutinin subtype and 32.9% were identified as the influenza A/H3 virus; 6.3% were identified as mixed infections. Influenza A virus with H5, H7 hemagglutinin subtypes were not identified in the etiological structure of influenza infection in the 2019-2020 epidemiological season.
Primers for the identification of influenza A/H5 and H7 subtypes amplified the expected products of only the corresponding subtypes of the reference strains and Kazakh isolates of avian origin.
Thus, the developed technology for the preparation of a PCR test system for the differential diagnosis of hemagglutinin subtypes of influenza A / H1, H3, H5, H7 virus in PCR provides high specificity and sensitivity of the kit, which makes it possible to use it as a tool for identifying epidemically relevant subtypes of influenza viruses.
At the next stage, an experimental kit was made for the simultaneous differential diagnosis in PCR of influenza A pathogens H1, H3, H5, H7., Including PCR buffer (a universal mixture containing PCR buffer for Taq polymerase, MgCl2, and dNTP); a mixture of reverse transcriptase and polymerase enzymes, short nucleotide primers (primers). The developed test system is designed to carry out 50 reactions.
Conclusion
Thus, during the research, the following tasks were solved:
- developed sets of primers for the simultaneous detection of influenza A subtypes H1, H3, H5, H7 by multiplex PCR;
- PCR conditions are optimized to achieve its high sensitivity and specificity;
- the analytical characteristics of PCR have been established - sensitivity and specificity.
A temporary instruction on the use of the M-PCR test system for the differential
diagnosis of influenza pathogens A H1, H3, H5, H7 was compiled.
An instruction has been drawn up for the manufacture and control of the M-PCR test system for the differential diagnosis of influenza pathogens A H1, H3, H5, H7, in which the analysis of the current regulatory documentation related to this document is carried out, technical requirements for products and specific indicators of these requirements are determined, test methods were established for all specified indicators and requirements for the safety of production of products, requirements for labeling, packaging, transportation and storage of products were determined.
References:
1 Rambaut A., Pybus O.G., Nelson M.I., Viboud C., Taubenberger J.K., Holmes E.C. The genomic and epidemiological dynamics of human influenza A virus // Nature. - 2008. - Vol. 453. - P. 615-619.
2 Memoli M.J., Athota R., Reed S., et al. The natural history of influenza infection in the severely immunocompromised vs nonimmunocompromised hosts // Clin Infect Dis. - 2014. - Vol. 58. - P. 214224.
3 Saltykova T.S. Otsrochennaja smertnost' pri grippe sredi lic pozhilogo vozrasta // ZhMJeI. -2010. - №4. -S. 8-13.
4 Glebova T.I., Ishmuhametova N.G., Bajmahanova B.B., Kuznecova T.V., Shamenova M.G., Ikranbegijn R. Cirkuljacija virusa grippa cheloveka v Almaty i Almatinskoj oblasti v 2008-2011 gg. // Mat-ly Mezhd. nauch.-praktich. konf. «Aktual'nye problemy virusologii, mikrobiologii, gigieny, jepidemiologii immunobiologii», Almaty. - 2012. - S. 89-92.
5 Social'noe znachenie jepidemij grippa [Jelektronnyj resurs]. Data obnovlenija: 16.11.15. — URL: http://www.vitaminov.net/rus-gripp-epydem-0-20371.html (data obrashhenija: 6.10.18).
6 Vemula S.V., Zhao J., Liu J., Wang X., Biswas S., Hewlett I. Current approaches for diagnosis of influenza virus infections in humans // Viruses. - 2016. - Vol. 8. - P. 96.
