CC BY
91
Известия ТСХА, выпуск 1, 2007 год
УДК 635.64:631.527.52:632.488.4Ф
СОЗДАНИЕ ДНК-МАРКЕРА ГЕНА УСТОЙЧИВОСТИ ТОМАТА К ФУЗАРИОЗНОМУ УВЯДАНИЮ
И.А. ФЕСЕНКО, М.Ю. КУКЛЕВ, Г.И. КАРЛОВ (Центр молекулярной биотехнологии)
С помощью программы GeneDoc на ' основе известных последовательностей гомологов кластера 12 были определены наиболее полиморфные участки ДНК. Исходя из этой информации были подобраны праймеры для амплификации этих последовательностей. В общей сложности были проанализированы 11 пар прай-меров в комбинации с 20 рестриктазами. В одной из комбинаций праймеров и рестриктазы нами были получены результаты, позволяющие различать не только устойчивые и неустойчивые растения, но и выявлять гетерозиготы. На основе этих результатов был создан ДНК-маркер на ген устойчивости томата к фуза-риозу. Этот маркер может быть использован в селекционной работе для анализа генотипов на устойчивость к фузариозу.
Фузариоз — это заболевание, которому подвержены большинство с.-х. видов растений, наносящее большой экономический ущерб. Устойчивые сорта существуют не для всех культур или устойчивость быстро преодолевается новыми расами патогена.
Fusarium oxysporum f. sp. lycoper-sici — почвенный гриб, который вызывает у томата болезнь увядания [1]. Гриб инфицирует растения через корни посредством прямого внедрения или через раны. После этого происходит заселение ксилемной ткани растения. Это может вызвать гибель растения уже через неделю после инфекции. На томате к настоящему времени идентифицированы 3 расы гриба и соответствующие им гены устойчивости. Локус I, который обеспечивает устойчивость к расе 1, локализован на 11-й хромосоме и был перенесен от Solatium pimpenelli-folium в 1939 г. [2]. Локус 13, перенесенный из хромосомы 7 L.pinnellii, придает устойчивость к расам 1, 2, 3 [3]. В селекции гетерозисных гибридов F1 томата наибольшее значение имеет ло-кус 12, который обеспечивает устойчивость к наиболее распространенным 1-й и 2-й расам. Этот локус был пере-
несен от дикого родственника томата Solarium pimpenellifolium и картирован на длинном плече в хромосоме 11 [4].
Селекция томата на устойчивость к фузариозу является длительным и трудоемким процессом, так как требует создания искусственных инфекционных фонов. В последнее время в связи с развитием методов молекулярной биологии в селекции с.-х. культур все чаще применяются молекулярные маркеры. Это позволяет значительно сократить затраты труда, ускорить и удешевить селекционный процесс. Селекция, основанная на молекулярных маркерах, получила название MAS-marker assisted selection [5]. Маркер должен быть дешевым и легко применимым, тесно сцепленным с маркируемым признаком и ко-доминантным (т.е. способным выявлять скрытые носители рецессивных аллелей). Удовлетворяющими указанным требованиям являются маркеры на основе ПЦР с последующей рестрикцией амплифицированных фрагментов — cleaved amplified polymorphism (CAPS). В этом типе маркеров выявляются различия в нуклеотидных последовательностях, которые затрагивают сайты рестрикции [6].
В конце 90-х гг. были клонированы и охарактеризованы 2 гена I2C-1 и I2C-2, которые относились к кластеру генов 12, обеспечивающему устойчивость к фузариозу [2]. Дальнейшие исследования показали, что клонированные гены не обеспечивают полной устойчивости растений томата. Лишь ген 12С-1 обеспечивал частичную устойчивость. В 1998 г. был клонирован еще 1 ген из этого кластера, обозначенный 12, который обеспечивал полную устойчивость растений. Было показано, что продукт гена 12 был высоко гомологичен клонированным ранее генам. Дальнейшие исследования показали, что локус 12 состоит из 7 генов-гомологов [7]. Этот локус имеет размер примерно 90 т.п.н. Сложность организации кластера локуса устойчивости 12, отсутствие данных о последовательности нук-леотидов всего кластера, наличие большого количества гомологов и отсутствие информации о нуклеотидной последовательности в гомологичных локусах у неустойчивых форм растений сильно затрудняет создание эффективных маркеров гена устойчивости 12.
Наши исследования были посвящены разработке эффективных ДНК-маркеров гена устойчивости томата к фузариозу 12 с целью их дальнейшего использования в селекционном процессе.
Материалы и методы
В работе был использован ряд устойчивых и неустойчивых сортов и гибридов томата. В качестве устойчивых форм использовали — Amparo, DRW, Ildico, Мегана, Durasol, неустойчивых — Pitenza, Белый налив, Bruinsma, Г7861, Г10610. Для проверки эффективности созданных маркеров использовали расщепляющиеся популяции* томата по признаку устойчивости к фузариозу, оцениваемые на искусственном инфекционном фоне. Растительный матери-
ал выращивали в пленочной теплице. Семена проращивали в чашках Петри при температуре 24°С.
ДНК выделяли из молодых листьев по методу Bematzky и Tanksley с некоторыми модификациями.
Молодые листья растирали в буфере для экстракции (0,35 М сорбитол, 100 мМ трис-HCl, 5мМ ЭДТА, pH 7) на холоде. Центрифугировали 10 мин со скоростью 14000 об/мин. Сливали надосадочную жидкость, добавляли буфер для экстракции, интенсивно встряхивали. Лизировали при 65"С в буфере для лизиса (1 М трис-HCl pH 7,5; 0,5 ЭДТА; 5 М NaCl, 2% СТАВ) с добавлением 5%-го саркосила. После лизиса производили очистку смесью хлороформ : изоамиловый спирт (24:1) и центрифугировали при 14 000 об/мин в течение 10 мин. Отбирали надосадочную жидкость и осаждали ДНК в одном объеме изопропанола. Центрифугировали со скоростью 14 000 об/мин в течение 10 мин, осадок высушивали и растворяли в MQ-воде. Размер выделенной ДНК и степень загрязненности РНК оценивали методом электрофореза в 1%-м агарозном геле.
В 25 мкл ПЦР смеси содержалось: 70 мМ Трис - НС1, pH 8,6 (25°С), 0,001% Тритон X 100, 16,6 мМ (NH4)2S04, 2,5 мМ Mg Cl2, 0,25 мМ каждого dNTP (Силекс М), 0,5 мкМ каждого прайме-ра, 100-150 нг ДНК и 1 ед. Taq-поли-меразы («Силекс М», Москва). В работе использовали следующие подобранные нами праймеры:
LR1: ACT СТА САА АТС TGG А АТ ТТС СТТ
LR2: ААА ТТС TAG TAG TGG TGT GA
V127: TGG AAC AAT GTC GGC ACT TAT CTT
VU127: CAA CCA CAT TTT CCA ACT TCA CAA
Cl: CCT CCT TTT CTC ACC TCA CTT CGC
* Предоставлены директором Овощной селекционной станции имени Н.Н.Тимофеева канд. с.-х. наук Г.Ф. Монахосом.
С2: ATT TGT GGC CAG TAT TCC
CC
FG1 : 5' ATG GAG ATT GGC TTA GCA GTT GGT 3'
LF127: 5' TCG TTG TAA TTT TCA ТТС С AC АСА 3'
LF79: 5' CAT TTC TCA ATT CAT CCC ACT CGT 3'
LF78: 5' TCA ТТС CAC ACG TCA TCA AGG АСА 3'
F7: 5' CAG TTG TGA AGT TGG AAA ATG TGG 3'
FU7: 5' CAA TTT CAA TTT TGG GCA ACG AGA 3'
L79: 5' ATT TAG GCA ACC AAT TCT TTC TCG 3'
LU79: 5' TGG GCG TAG CTC АТС A AG TAT GTA 3'
M78: 5' TCT TGT TGT CCT TGA TGA CGT GTG 3'
MU78: 5' СТА TTG AAT AGG АСА TGT GCC GAC 3'
U127 5' GTT GAG GAC ATT GCT TCC GAT ACG
UN127 5' AAC AAC TGG АСА АТС ACT AAC TTC
U78 5' ACT CGA TAA AGT ATT GGT TAC CCG
UN78 5' TCA GCT АСА AGT CAA ATT GAA GGC
UP78 5' TGT ATT GAT TAT ATG GTA GGC CCC
Рестрикцию проводили в 1О мкл реакционной смеси, содержащей 4 мкг ПЦР-продукта, 2О ед. рестриктазы и 1 мкл соответствующего буфера. Реакцию останавливали добавлением 2 мкл ЭДТА. Образцы смешивали с краской для нанесения (О,25% бромфеноловой синий — 5О% глицерин). Геномную ДНК разделяли в 1,5%-м агарозном геле при напряжении 5 В/см в ТВЕ-буфере (45 шЫ трис-боратД mM EDTA pH 8).
Для анализа нуклеотидных последовательностей использовали программное обеспечение — GeneDoc, Clone, Oligo 3.1.
Результаты и их обсуждение
Доминантный ген 12 у томата обеспечивает устойчивость против 1-й и 2-й рас патогена. Этот локус локали-
зован на длинном плече 11-й хромосомы и состоит, по меньшей мере, из 7 генов-гомологов, которые относятся к NBS-LRR классу генов устойчивости [7] (рис.1). Задача по поиску ДНК-маркера, _ сцепленного с геном, обеспечивающим устойчивость к фузариозу, осложнялась отсутствием данных о последовательности нуклеотидов всего кластера генов устойчивости 12. Это приводило к сложностям в подборе соответствующих праймеров для анализа только определенных генов кластера и к возможной амплификации не только генов, обеспечивающих устойчивость, но и их гомологов. Затруднение вызывало и отсутствие данных о нуклеотидной последовательности, а также участка ДНК, соответствующего кластеру генов 12 у неустойчивых генотипов. Это, в свою очередь, затрудняло подбор рестрицирующих нук-леаз, которые при анализе обнаруживали бы полиморфизм.
С помощью программы GeneDoc на основе известных последовательностей гомологов кластера 12 были определены наиболее полиморфные участки ДНК. На основе этой информации были подобраны праймеры для амплификации этих последовательностей ДНК (рис 2). В общей сложности проанализированы более 10 пар праймеров в комбинации с 20 рестриктазами. В ре-
Кластер 12
Участок размером 90 т.п.н. ^^^^ ABC /2С-2 12 F /2С-1
^-OD-D-O-e-O-D-
4
Функциональный ген, обеспечивающий устойчивость
Длинное плечо 11-й хромосомы
Рис. 1. Кластер генов устойчивости /2
зультате нашей работы были подобраны праймеры, которые позволяли проанализировать всю последовательность клонированных генов.
Пара праймеров U78-UP78 ампли-фицирует один из гомологов гена 12 — 12С-1, обнаруженный у устойчивых генотипов и обеспечивающий частичную устойчивость к фузариозу.
Было проверено 10 рестриктаз, по трем из них (Яае III, Hind III, Taq I) обнаружен полиморфизм (рис. 3, 4, 5).
Несмотря на то, что наблюдался четкий полиморфизм между устойчивыми и неустойчивыми генотипами, создать ко-доминантный маркер, позволяющий различать гомо- и гетерозиготы с этой парой праймеров не удалось.
Пара праймеров и78-и^8 ампли-фицирует один из гомологов гена 12 — J2C-1, обнаруженный у устойчивых генотипов и обеспечивающий частичную устойчивость к фузариозу. Амп-лифицируемый фрагмент был прове-
1
a fcc t t. fc.
rTGAATGTTCTGTTTGATAGGCTTGCTCCTi TTGAATGTTCTGTTTGATAGGCTTGCTCCT, TTGAATGTTCTGTTTGATAGGCTTGCTCCT.
¡GGTGCATTTCTCTCCTCAGCT rGTGCATTTCTCTCCTCAGCT GTGCATTTCTCTCCTCAGCT
IIIll
T TGAAT GT T CT G TT'ГG AT AO
t.CCTT GGCT T AAAGG AG C. ATTTT
Ш
Г TG G CT T AAAGG AG t:. AT TTT<i aTT С cAC g AAA
~TAGAAeACCTTCAAOTTC
222 :: 1 , 'Щт» -W
Spj >41 SllSS-
- ftAag t:
tgACAATCTT Ж
::т aCAAG T CAAAT T GAAG G
•T GAT GACAAT CT T AAT
Шякрю»д шш ш&шштж
^WTGTCC ri'GATGACG-fg тоеМТО^Т® ; gcjaa ;3 ;ЮЛШ ;ся jef-Л ^
T tCTTaT t:GT t:c;TqGATGAt:.GTG1
aaa att
TTGAGAAAT TTGAGAAAT TTGAGAAAT
TGA AAtTAca.3CGACTi
5AAAT TTTT
Рис. 2. Нуклеотидная последовательность фрагмента амплифицируемого праймерами FG1-LF78. Стрелкой обозначены праймеры
м
ж
т
шт
Рис. 3. Рестрикция Нае III. 1-5 — устойчивые растения, 6-9 — неустойчивые генотипы
123456 7 8 9 10
» *
» «<* «HMf
♦
#
*
Рис. 4. Рестрикция Hind III. 1-5 — устойчивые растения, 6-10 — неустойчивые генотипы
12 345678 9 10
Рис. 5. Рестрикция Taq I. 1-5 — устойчивые растения, 6-10 — неустойчивые генотипы
рен 10 рестриктазами, по двум из которых обнаружен полиморфизм (рис. 6, 7).
Несмотря на то, что, как и в предыдущем случае, наблюдался четкий полиморфизм между устойчивыми и неустойчивыми генотипами, создать ко-доминантный маркер, позволяющий
различать гомо- и гетерозиготы с этими праймерами, также не удалось.
Пара праймеров Ш27-ЦЫ127 позволяет специфично амплифицировать последовательность гена 12, обеспечивающего устойчивость к фузариозу. Эта последовательность была проанализирована 10 различными рестрикта-
Рис. 6. Рестрикция Эта I. 1-5 — устойчивые растения, 6-9 — неустойчивые генотипы 1 23456789 10
Рис. 7. Рестрикция Ша I. 1-5 — устойчивые растения, 6-10 — неустойчивые генотипы
зами, часть из них показала полимор- получены результаты, которые позво-
физм и одна из комбинаций «праймер- лили идентифицировать этот маркер
рестриктаза» позволила выявить гете- как кодоминантный.
розиготы (рис. 8). Результаты оценки генотипов тоВ комбинации праймера Ш27-УШ27 мата, полученные на искусственном и рестриктазы Vha 4641 нами были инфекционном фоне (Овощная селек-
1234 56789 10
Рис. 8. Рестрикция Vha 4641.1-5 — устойчивые растения, 6-10 — неустойчивые генотипы. Образец 3 — гетерозиготный генотип.
ционная станция им. Н.Н.Тимофеева РГАУ - МСХА имени К.А.Тимирязева) и с помощью созданного нами ДНК-маркера, совпадали, хотя в линиях, где наблюдалось расщепление, метод молекулярного маркирования позволил разделить устойчивые генотипы на гомозиготы и гетерозиготы и этим самым сократить селекционную работу на один цикл отбора. Таким образом, этот маркер может быть использован в селекционной работе для анализа генотипов на устойчивость к фузариозу.
ЛИТЕРАТУРА
1. Nelson Р. Е. Edited by Marshall Е. Mace, Alois A. Sell & Carl, and H. Beckman Academic press Inc., 1981. 113. — 2. Ori N., Eshed Y., Pciran I. et al. // Plant Cell 9, 1997. 521-532. — 3. Bournival B.L., Vallejos C.E., Scott JW. // Theoretical-and-Applied-Genetics. 1990. 79(5), 641-645. —
4. Segal G., Sarfatti М., Schaffer M.A. et al. // MOI. Gen. Genet, 1992. 231, 179-185. —
5. Madan Mohan, Suresh Nair A., Bhag-wat T.G. et al. // Molecular Breeding, 1997. 3, 87-103. — 6. Lalitha Sunil Kumar II Biotechnology Advances, 1999. 17, 143-182. — 7. Simons, G. et al. // Plant Cell. 1998. 10, 1055-1068.
SUMMARY
With the help of the programme GeneDoc on the basis of known sequences of homologs cluster 12, most polymorphous loci (parts) of DNA were specified. Due to this primers to amplify those sequences have been sorted out. Eleven primers' pairs in combination with twenty restriction enzymes nave been analysed all in all. The results produced in one combinatien allow to differentiate both stable and unstable plants, they can also reveal heterozyg'otes. The DNA-marker has been created revealing resistance tomato gene to vascular wilt (Fusarium). This very marker can be used in selection work to analyse geno-types to vascular wilt (fusatium) resistance.
