CC BY
99
155М 0202-5493. МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научноисследовательского института масличных культур. Вып. 2 (144-145), 2010
ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОМНОЙ ДНК ОДНОЛЕТНИХ ВИДОВ ПОДСОЛНЕЧНИКА
Н.В. Маркин1 , кандидат биологических наук В.Е. Тихобаева1, аспирантка
М.А. Тихонова , кандидат сельскохозяйственных наук В.А. Гаврилова2, доктор биологических наук Т.Т. Трифонова3 , научный сотрудник А.В. Усатов1, доктор биологических наук
'НИИ биологии Южного федерального университета, Россия, 344090, Ростов-на-Дону, пр. Стачки, 194/1 тел. (863) 243-33-94, e-mail: nmarkin@mail.ru.
2ГНУ ГНЦ РФ ВИР им. Н.И. Вавилова,
19000, Санкт-Петербург, ул. Б.Морская, 42.
3ГНУ Кубанская опытная станция ВИР им. Н.И. Вавилова, п. Ботаника, Гулькевический район, Краснодарский край
Ключевые слова: полиморфизм, RAPD-маркеры, SSR-маркеры, SCAR-маркеры, UPGMA-дендрограмма, дикорастущий подсолнечник (Helianthus L.)
УДК 575.12:633.854.78
Введение. Подсолнечник является основной масличной культурой в России. Вектор современной селекции сортов и гибридов направлен на увеличение урожая и пищевых качеств семян. Для повышения адаптивности к факторам внешней среды в селекционный процесс часто включают дикорастущие формы подсолнечника. Кроме того, дикорастущие формы - это ценные источники цитоплазматической мужской стерильности и генов-восстановителей фертильности пыльцы [1, 2].
Анализ организации и изменчивости генома высших растений по-прежнему остается одной из наиболее актуальных проблем в генетике. Важным звеном в работе селекционера является четкая идентификация растений на всех этапах селекционного процесса. Сегодня видовую принадлежность образцов подсолнечника из мировой коллекции ВИР устанавливают только с помощью визуальной оценки их морфологических характеристик на основе классификации Ч. Хейзера [3]. С введением молекулярных маркеров в практику биологических исследований появились новые возможности изучения генетического разнообразия, опреде-
ления родства на внутривидовом и родовом уровнях [4, 5]. За последние два десятилетия использование молекулярно-генетических методов позволило исследовать физическую и функциональную организацию геномов многих сельскохозяйственных культур [6]. Так, для изучения изменчивости генома подсолнечника широко используют метод полимеразной цепной реакции со случайными праймерами (Random Amplified Polymorphic DNA, rApD-PCR), с помощью которого можно быстро обнаружить вариабельность большого числа ло-кусов по всему геному [7, 8, 9, 10, 11]. Для более точного анализа применяют метод SSR или микросателлитного анализа [12].
Кроме того, одним из перспективных подходов в селекции подсолнечника является молекулярно-генетическое маркирование конкретных хозяйственно ценных признаков в генофонде дикорастущих форм рода Helianthus для дальнейшей интрогрессии соответствующих генов в культурные формы методом межвидовой гибридизации. Например, большой интерес представляет поиск новых источников гена Rf1, восстанавливающего широко используемый в гетерозисной селекции источник ЦМС типа РЕТ1.
В связи с этим целью работы является исследование с помощью молекулярных маркеров внутриродового и внутривидового полиморфизма генома однолетних видов подсолнечника из мировой коллекции ВИР им. Н.И. Вавилова, создание на основе SSR-анализа генетических паспортов, а также определение методом ПЦР среди однолетних дикорастущих форм гена Rfl - восстановителя фертильности пыльцы ЦМС РЕТ1.
Материалы и методы. Объектами исследования служили образцы однолетних видов подсолнечника H. annuus, H. argophyllus, H. petiolaris, H. debilis и H. praecox из коллекции ВИР им. Н.И. Вавилова, поддерживаемые в живом виде на карантинном питомнике Кубанской опытной станции. В качестве образца сравнения использовали культурную форму подсолнечника H. annuus L. (линия 3629), которая уже более 50-ти лет поддерживается в строгом инцухте. Все исследуемые образцы были классифицированы В.А. Гавриловой с сотрудниками, руководствуясь определителем
Ч. Хейзера [3].
Геномную ДНК выделяли из молодых листьев подсолнечника по методу Р. Бума [13] с нашими модификациями.
КАРБ-анализ проводили с 7 праймерами, синтезированными в ЗАО «Синтол» (г. Москва) (табл. 1). Данные праймеры продемонстрировали выявление максимального внутривидового и внутриродового полиморфизма у подсолнечника [9, 10, 11] и обеспечили хорошую воспроизводимость результатов фингерпринтинга в подобранных нами условиях энзиматической реакции. Проведения ПЦР описаны в работе Маркина с соавторами [14].
Таблица 1 - Праймеры, использованные для
ИАРБ-анализа геномов однолетних дикорастущих видов подсолнечника
Название праймера Последовательность нуклеотидов 5'-3' Уровень межвидового полиморфизма, %
P36 CCGAATTCGC 36,4
P38 GATACGTTGTC 43,0
0PT-08 AACGGCGACA 38,8
0PW-04 CAGAAGCGGA 50,2
0PW-06 AGGCCCGATG 50,9
0PW-09 GTGACCGAGT 41,5
0PW-10 TCGCATCCCT 42,7
Среднее значение 43,4
Для количественной оценки полиморфизма между исследуемыми видами подсолнечника данные RAPD-анализа с помощью компьютерной программы Phoretix ID были представлены в виде матрицы состояний бинарных признаков. По матрице состояний с помощью компьютерной программы WinBoot [15] была составлена матрица различий с использованием коэффициента Жаккарда и, используя метод не взвешенных парно-групповых средних
(UPGMA), построена дендрограмма, отражающая степень различий между RAPD-
спектрами исследуемых видов.
При проведении SSR-анализа использовали десять пар праймеров, отобранных нами в результате предварительных опытов (табл. 2).
Уровень внутриродового полиморфизма (Р) рассчитывали по формуле Р = (число полиморфных фрагментов / общее число фрагментов) х 100 %.
Амплификацию специфических локусов
ядерной ДНК HRG01 и HRG02, маркирующих ген Rf' подсолнечника, проводили с помощью SCAR праймеров - OPK13 и 0PY10, разрабо-
танных Р. Хорн с сотрудниками [16].
Результаты и обсуждение. В результате ИАРБ-анализа 41 образца однолетних дикорастущих форм подсолнечника (Helianthus Ь), включающих 5 видов и один контрольный образец (линия культурного подсолнечника 3629 из коллекции НИИ биологии ЮФУ) получены специфические и воспроизводимые наборы фрагментов ДНК (ампликонов). Для всех видов определены индивидуальные ИАРБ-спектры, различающиеся числом ампликонов, их размерами и степенью выраженности на электрофореграммах. Показано, что количество электрофоретически-подвижных полос (бэндов) зависит от использованного праймера и составляет от 9 до 16, их размеры варьируют в пределах 200-1200 пн. Результаты фингер-принтинга позволили рассчитать уровень внутриродового полиморфизма, который в среднем составил 43,4 % (см. табл. 1).
Построенная ИРОМА-дендрограмма выявила генетические взаимоотношения между исследуемыми образцами пяти видов. Как видно на рисунке 1, все исследованные образцы сгруппировались по трем основным кластерам: первый объединяет образцы вида H. argophyllus; второй - Н. annuus, H. petiolaris, H. debihs и Н. ргаесох; третий представлен культурной формой Н. аппиш (линия 3629). На дендрограмме практически все образцы одного вида группируются с высокой степенью статистической достоверности: образцы вида Н. аг-gophШus - 86-100 %, Н. аппиш - 52-100 %, Н. petiolaris - 38-100 %, Н. debilis - 34-100 % и Н. ргаесох - 59-100 %. Низкие значения бутстрепа (11-34 %) в узлах кластеров межвидовых связей, а также генетические различия (0,25-0,35) указывают на значительный молекулярногенетический полиморфизм однолетних видов подсолнечника. Интересно, что культурная форма вида Н. аппиш (линия 3629) формирует отдельный кластер. Необходимо отметить, что образцы одного вида, интродуцированные в разные годы из географически отдаленных ареалов своего естественного происхождения, характеризуются значительными различиями ИАРБ-спектров. Так, например, полиморфизм ИАРБ-маркеров некоторых образцов в пределах вида Н. petiolaris и Н. debilis составил 29 и 31 %, а их внутривидовые связи поддержаны низкими значениями бутстрепа - 38 и 34 % соответственно (рис. 1).
Таблица 2 - Праймеры, использованные для 88Я-анализа геномов однолетних дикорастущих видов подсолнечника
Название локуса Повтор Последовательность нуклеотидов 5 - 3' Уровень межвидового полиморфизма, %
Ha 432 (GT),q CTT TAT CCC CCA CCC CCT CC GGG TTT AGT GGC CAG TAG TTG TC 45,3
Ha 1442 (ATT)31 GCT TAT GTG CTT ACG TGT TCC TG CTA AAC AGT TCG GCG AGT GTA GG 70,3
Ha 1608 (ATT)25 GAT CTT AGG TCC GCC AC GAT GGC ATT TGG CTA GAC 35,8
IUB 4 (AT)n GGC CAT GAT TTA TTC ACT CAG ACA GAT GAG AGG CGT TCT CAC 59,7
ORS 509 (AT) (GT) CAA CGA AAA GAC AGA ATC GAA A CCG GGA ATT TTA CAA GGT GA 38,8
OSU-1 (AGG) ACA AGT CGG CTG GTG AGC ACA TGA AAC ACG AGC TAA ACC A 51,6
Ha 1287 (GA) 26 GAT ATG AGC CCA TCA CTC ATC GAA GAT ATG TCA GGT CAC ACC C 39,7
HNCA-1 (GT) n TTG GAG ATG TGT TTG TGT TCTGAG ACC TAC ACC TTA GTT AAA CCTTGC 50,0
HNCA-2 (GT) n TGA GAC AAG CAT AAG CAC TAG ACA AGA CAA GGG ACT 39,3
Ha 514 (GA) 13 GGT CAA CGG ATT TAG AGT C GTA TTG ATT CCA ACA TCC AG 30,7
Среднее значение 46,1
98 .
я
100 I
1000 5513 1000 5512 1000 5514 1000 5511 1805 5504 1805 5501 1805 5503 1805 5502
- 3629 Ци. annuus
. 441245 4554
1 441245 4553
- 441245 4551
- 441183 4363
| 441183 4362
1 441183 4361
- 441236 4523
- 441236 4522
- 441236 4521 440560 5254
И. argophylus
440560 5252 440560 5251
100 1
100 I
88 i I
- w/n 5352
- w/n 5351 w /n 5353 503232 5342 503232 5341
| 503232 5333
> 503232 5331 545666 5392 545666 5393 545666 5391
. 560395 5092
1 560395 5091 560395 5093 560388 5081
| 560388 5083
> 560388 5082 560400 5442 560400 5441 560400 5052 560400 5051
И. petiolaris
И. praecox
91
100
94
52
78
100
100
100
20
96
23
66
90
38
22
100
69
И. debilis
100
100
39
34
И. debilis
100
98
53
59
90
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
Примечание: цифрами в узлах кластеров обозначены значения бутстрепа.
Рисунок 1 - Дендрограмма межвидовых и внутривидовых взаимоотношений однолетних дикорастущих видов подсолнечника
Полученные результаты свидетельствуют, что исследованные КАРБ-маркеры наряду с морфологическими признаками могут быть эффективно использованы для идентификации образцов однолетнего дикорастущего подсолнечника.
Результаты амплификации микросателлит-ных последовательностей ДНК 31 генотипа показали, что из ранее отобранных 12 88Я-маркеров только 10 проявили себя как полиал-лельные, хорошо воспроизводимые и информативно значимые. При изучении данной группы генотипов по 10-ти праймерам всего была выявлена 21 аллель. Число аллелей на локус варьировало от 2 до 8, а уровень внутриродового полиморфизма - от 30,7 % по локусу На 514 до 70,3 % по локусу На 1442 (см. табл. 2). В среднем, при сравнении с ИАРБ-маркерами, он оказался выше на 3 % и составил 46,1 %. В результате SSR-анализа для каждого образца на основании полученного набора аллелей микросателлитных локусов были составлены молекулярно-генетические паспорта или генетические формулы генотипов (табл. 3).
Таблица 3 - Генетические формулы однолетних дикорастущих видов подсолнечника на основе ББЯ-анализа их генотипов
Форма Формула*
Helianthus annuus L. (441183) A2BзC2D2ElF4GзHlJ2Kl
Helianthus annuus L. (441236) A2BзClD2ElF2G2HlJ2Kl
Helianthus annuus L. (441245) AlA2B2ClDlElF2GзHlJlKl
H. praecox Englem. & Gray (560400) AlA2BlClD1ElE2FзF4G2GзG5HlJlJ2Kl
H. debilis Nutt. (560388) A1B2C1D1E2F4G1H1J1K1
H. debilis Nutt. (560395) A2B1C1D1E2F4G1H1J1K2
H. debilis Nutt. (545666) A1B2C1C2DGE1F4G1H1J1K1
H. petiolaris Nutt. (440560) AlBзC2DlElF7GзHlJlKl
H. petiolaris Nutt. (503232) AlB2C2DlElF4GlGзHlJlKl
H. petiolaris Nutt. (без номера) A1B2C2D1E1F7G1G4H1J1K1
H. argophyllus T. & G. (1805) AgB^DiE^G^HiJiK,
H. argophyllus T. & G. (1000) AoBзC2DlElFзGlG2HlJlKo
H. annuus L. (линия 3629) A^C^E^GlHJlKl
*Примечание: код локуса - A-Ha 4з2; B-Ha 1442; C-Ha 16GS; D-IUB 4; E-ORS 509, F-OSU-1, G-Ha 12S7, H- HNCA-1, J- HNCA-2, K-Ha 514
С целью определения наличия доминантного гена-восстановителя фертильности пыльцы ЦМС РЕТ1 - Л/1 у однолетних видов подсолнечника был проведен молекулярно-генетический анализ их ДНК на присутствие двух маркерных участков - ИЯ001 и ИЯ002.
В результате амплификации ДНК с праймерами ОРК13 маркер ИЯ001 был выявлен у всех растений видов Н. йвЫНи, Н. argophyllus и
Н. petiolaris (табл. 4). У вида Н. debilis (560395)
амплификацию маркерного фрагмента размером 426 п.н. (характерным для культурных и многолетних дикорастущих форм) удалось провести только при снижении температуры отжига праймера с 58 до 54 °С. У видов Н. ргаесох и Н. аппиш выявлена гетерогенность по наличию данного маркера как среди образцов разных лет интродукции, так и внутри одного образца. В частности, маркер был обнаружен у 75 % исследованных растений вида Н. ргаесох (560400) и вида Н. аппиш (441236), а также у 50 % растений Н. аппиш (441245).
При использовании праймера ОРУ 10 амплификацию маркерного фрагмента ДНК (размером 738 п.н.) ИЯ002 наблюдали у растений Н. аппиш с наличием внутрипопуляционного полиморфизма: 25 % у образца 441183 и по 50 % у образцов 441236 и 441245. Кроме этого, маркер был определен у 25 % исследованных растений вида Н. petiolaris 440560 (табл. 4).
Таблица 4 - Результаты амплификации
маркеров гена Я/1 ИЯ001 и ИЯ002 у однолетних видов подсолнечника
Вид Номер интро- дукции Наличие маркера HRG01 Наличие маркера HRG02
Helianthus annuus L. 44118з + +/-
4412зб +/- +/-
441245 +/- +/-
H. praecox Englem. й Gray 5б0400 +/- -
H. debilis Nutt. 560з88 + -
5б0з95 + -
545666 + -
H. petiolaris Nutt. 440560 + +/-
50з2з2 + -
Без номера + -
H. argophyllus T. й G. 1SG5 + -
1000 + -
Следовательно, 8СЛЯ-маркеры гена Л/1 в большинстве случаев неоднородно представлены среди различных дикорастущих популяций однолетних видов. В связи с этим на этапе исходных форм для получения новых доноров восстановителей фертильности пыльцы необходимо проведение предварительной оценки растений на наличие этих маркеров.
Таким образом, приведенные результаты молекулярно-генетического полиморфизма однолетних видов подсолнечника свидетельствуют, что исследованные ИЛРБ-, 88Я- и 8СЛЯ-маркеры, наряду с классическим фенологическим описанием растений, удобно использовать для генетического контроля «чис-
тоты» и целостности коллекционных образцов подсолнечника, а также для идентификации генотипов с хозяйственно ценными признаками.
Исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (грант «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010)» № 2.1.1/4947).
Список литературы
1. Пустовойт, Г.В. Селекция подсолнечника на групповой иммунитет методом межвидовой гибридизации / Г.В. Пустовойт // Подсолнечник. - М.: Колос, 1975. - С. 164-209.
2. Горбачева, Р.Г. Жирнокислотный состав масла семян дикорастущих видов Helianthus L. / Р.Г. Горбачева // Труды по прикл. бот., ген., и сел. - 1986. - Т. 107. - С. 10-15.
3. Heiser, C.B. The North American sunflowers (Helianthus) / C.B. Heiser, D.M. Smith, S.B. Clevenger, W.C. Martin // Memoirs of the Torrey Botanical Club. - 1969. - V. 22. - № 3. - 218 p.
4. Гостимский, С.А. Изучение организации и изменчивости генома растений с помощью молекулярных маркеров / С.А. Гостимский, З.Г. Кокаева, Ф.А. Коновалов // Генетика. -2005. - Т. 41. - № 4. - С. 480-492.
5. Dong, G.J Studying genetic diversity in the core germplasm of confectionary sunflower (Helianthus annuus L.) in China based on AFLP and morphological analysis / G.J. Dong, G.S. Liu, K.F. Li // Genetica. - 2007. - V. 43. - № 6. - Р. 627-635.
6.Gebhardt, C. Plant genome analysis: the state of the art / C. Gebhardt, R. Schmidt, K. Schneider // Int Rev Cytol. - 2005. - V. 247. - P. 223-84.
7. Sossey-Alaoui, K. Evidence for several genomes in Helianthus / K. Sossey-Alaoui, H. Serieys, M. Tersac, P. Lambert, E. Schilling, Y. Griveau, F. Kaan, A. Berville // Theor. Appl. Genet. - 1998. - V. 97. - P. 422-430.
S. Sossey-Alaoui, K. Molecular relationships of Helianthus based on RAPD markers / K. Sossey-Alaoui, H. Serieys, M. Tersac, P. Lambert, E. Schilling, Y. Griveau, F. Kaan and A. Berville // Helia. - 1999. - V. 22. - № 30. - Р.І-IS.
9. Sivolap, Yu.M. Inter- and intraspecies differentiation in the genus helianthus by RAPD analysis / Yu.M. Sivolap, A.E. Solodenko // Helia. -199S. - V. 21. - № 29. - Р. 9-1S.
10. Сиволап, Ю.М. RAPD-анализ молекулярно-генетического полиморфизма подсолнечника (Helianthus annuus) / Ю.М. Сиволап,
A.Е. Солоденко, В.В. Бурлов // Генетика. -199S. - Т. 34. - № 2. - С. 266-271.
11. Попов, В.Н. Исследование генетического разнообразия инбредных линий подсолнечника методами RAPD- и изоферментного анализов /
B.Н. Попов, О.Ю. Урбанович, В.В. Кириченко // Генетика. - 2002. - Т. 38. - № 7. - С. 937-943.
12. Solodenko, A. Genotyping of Helianthus based on microsatellite sequences / A. Solodenko, Yu. Sivolap // Helia. - 2005. - V. 2S. - I. 42. -P. 19-26.
13. Boom, R. Rapid and simple method for purification of nucleic acids / R. Boom, C.J.A. Sol, M.M.M. Salimans, C.L. Jansen, P.M.E. Wertheim-Van Dillen, J. Van Der Noordaa // J. Clin. Microb. - 1990. - V. 2S. - № 3. - P. 495503.
14. Маркин, Н.В. RAPD-анализ генотипов солеустойчивых форм горчицы (Brassica juncea L.) / Н.В. Маркин, А.В. Усатов, М. Федоренко // Экологический вестник научных центров Черноморского экономического сотрудничества. - 2006. - № 2. - С. 78-S1.
15. Yap, I.V. WinBoot: A program for performing bootstrap analysis of binary data to determine the confidence limits of UPGMA-based dendrograms / I.V. Yap, R.J. Nelson // International Rice Research Institute Fhilippines. - 1996. - 22 p.
16. Horn, R. Molecular mapping of the Rfl gene restoring pollen fertility in PETl-based F1 hybrids in sunflower (Helianthus annuus L.) / R. Horn, B. Kusterer, E. Lazarescu, M. Prufe, W. Friedt // Theor Appl Genet. - 2003. - V.106. - № 4. - P. 599-606.
