CC BY
65
УДК 616.36-002-074
Г.А. ШОПАЕВА, 1И.А. ПЫШНАЯ, 1Е.В. ДМИТРИЕНКО, 1В.Ф. ЗАРЫТОВА, 1Д.В. ПЫШНЫЙ, Ш.А. БЕЙСЕМБАЕВА, 2Д.А. КУШЕНОВА
СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ
1 институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск, Россия
Вирусные гепатиты представляют собой серьезную социально-экономическую проблему здравоохранения ввиду их широкого распространения, преимущественно хронического течения с исходом в цирроз печени и гепатоцеллюлярную карциному. Более 500 млн. человек в мире страдают хронической HCV-инфекцией. Начиная с 1998 г., инфицированность населения вирусом гепатита С (HCV) растет с опережающей по отношению к вирусу гепатита В быстротой. По прогнозам ВОЗ, хронический гепатит С в течение 10-20 лет станет одной из важных проблем национальных органов здравоохранения [1]. Следует отметить, что официальная статистика регистрирует лишь видимую часть «айсберга», так как большинство случаев заболевания протекает легко, без желтушного синдрома, с минимальными клиническими проявлениями и остается вне поля врачебной диагностики. Только у одной трети инфицированных HCV появляются маловыраженные признаки заболевания [2].
Острая форма вирусного гепатита С (ВГС) в подавляющем большинстве (в 70-80 % случаев) заканчивается развитием хронического гепатита. Ситуация осложняется тем, что больные хроническим гепатитом С, являясь мощным источником инфицирования здоровых, длительное время чувствуют себя вполне удовлетворительно, не зная о своем инфицировании и не обращаясь за медицинской помощью.
Учитывая данные обстоятельства, вопросы ранней диагностики HCV-инфекции и связанного с этим своевременного проведения адекватной терапии и профилактических мероприятий способствуют улучшению эпидемиологической ситуации по вирусному гепатиту С. В настоящее время существует настоятельная необходимость разработки новых диагностических средств, медицинских препаратов, а также проведения оперативных исследований в целях профилактики и лечения различных форм ВГС.
Специфическая лабораторная диагностика HCV-инфекции основана на обнаружении специфических антител к основным антигенам вируса и определении РНК вируса, его количества и генотипа.
Основным методом первичной диагностики вирусного гепатита С является выявление антител к антигенам HCV, относящихся к иммуноглобулинам классов G и M (анти-HCV IgG и анти-HCV IgM) с помощью иммуноферментного анализа (ИФА).
Используемые в настоящее время иммуноферментные тест-системы для определения антител к HCV являются достаточно чувствительными и информативными, а их широкое использование повысило процент выявления лиц, инфицированных вирусом гепатита С.
Широко используется определение так называемых общих антител к HCV (anti-HCV total). Однако обнаружение только anti-HCV total имеет скрининговый (ориентировочный) характер и дает основание для дальнейшего специфического лабораторного обследования. Наличие anti-HCV total позволяет лишь констатировать факт контакта пациента с вирусом гепатита С и не позволяет судить ни о давности процесса, ни о его завершенности или прогрессировании. Антитела класса IgM к HCV, определяемые иммуноферментным методом, позволяют не только говорить об инфицировании вирусом гепатита С, но с определенной долей достоверности говорить об острой фазе инфекции или обострении хронического гепатита, несмотря на отсутствие симптомов болезни и гиперферментемии АЛАТ, АСАТ. Установлено также, что корреляция между выявлением РНК вируса и анти-Н^ IgM у больных составляет 80-95 0% [3-5].
Известно, что скорость появления, нарастания до максимальных значений, снижения в последующем уровней антител очень индивидуальна и зависит от многих причин: состояния иммунной системы, иммуногенности возбудителя и др.
Однако для диагностических целей одного ИФА-теста недостаточно, поскольку специфические антитела не выявляются на ранних стадиях после инфицирования вирусом (фаза серонегативного окна продолжительностью в несколько месяцев), а также при иммунодефицитных состояниях [6]. Детекция HCV и мониторинг подтвержденного заболевания требуют определения прямых маркеров HCV: РНК и вирусспецифических белков. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) для выявления РНК HCV в плазме крови обладает высокой чувствительностью и в настоящее время достаточно широко применяется в практическом здравоохранении.
ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА С
Казахский национальный медицинский университет им. С.Д. Асфендиярова, 2 городская инфекционная клиническая больница, г.Алматы, Казахстан,
Медицинский журнал Западного Казахстана №2 (26) 2010 г
Батыс Цазацстан медицина журналы №2 (26) 2010 ж. 95
Использование молекулярно-генетических методов с использованием амплификационных технологий в диагностике вирусных гепатитов позволяет, помимо качественного ответа о наличии фрагмента ДНК/РНК, определять концентрацию возбудителя в исследуемом материале, а также его генотип. В настоящее время для количественного анализа концентрации специфической ДНК/РНК используется ПЦР в режиме реального времени (Real-time PCR), сущность которого заключается в детекции накопления флуоресценции реакционной смеси, при этом интенсивность сигнала пропорциональна концентрации конечного продукта ПЦР Важнейшей особенностью этого метода является синхронизация регистрации и амплификации, что дает возможность оценить кинетику процесса, зависящего от начального количества исследуемого наследственного материала. Таким образом, метод ПЦР имеет большое значение в верификации вирусного гепатита С.
Поиск источника инфекции во время вспышек гепатита С, прогнозирование эффективности применяемой терапии и течение инфекционного процесса, вызванного HCV, зависят от генотипа вируса, что является основанием для необходимой разработки тест-систем не только для рутинного выявления, но и для генотипирования HCV. На территории Казахстана для клинической практики достаточно разграничить три основных генотипа (1, 2 и 3) и соответствующие субтипы HCV (1a, 1b, 2a, 2b, 3a, 3b).
В данном исследовании проведено сравнение результатов генотипирования HCV, полученных с помощью коммерчески доступной тест-системы «Амплисенс HCV-генотип», основанной на ПЦР с типоспецифичными праймерами [7] и нового прототипа тест-системы, разработанного в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (ИХБФМ СО РАН) [8]. Сотрудниками КазНМУ проведена апробация предложенной тест-системы на реамплифицированных образцах согласно авторской методике. Количество ПЦР-образцов составило 65 штук. В качестве исходного материала использована кровь пациентов с хроническим гепатитом С, проживающих на территории Казахстана. Тест-система «Амплисенс HCV-генотип» позволяет выявлять четыре генотипа, а именно: 1а, 1b, 2 и 3а, при этом необходимо проведение предварительного (или сопряжённого) эксперимента, направленного на выявление непосредственно HCV с помощью тест-системы «Амплисенс-HCV 240/ВШ-440». Обе тест-системы представляют собой наборы для постановки реакции амплификации с целью дальнейшего проведения гель-электрофореза. Наличие и принадлежность изолята к HCV, а также к тому или иному генотипу HCV определяется по длине образованного продукта реакции после проведения гель-электрофореза. Таким образом, для выявления и генотипирования HCV тест-системами «Амплисенс» необходима постановка как минимум 5 (пяти) реакций, не принимая в расчёт необходимость постановки положительных и отрицательных контролей.
Принципиально новый подход к диагностике HCV-инфекции, предложенный в ИХБФМ СО РАН, основан на использовании ДНК-чипа, содержащего все HCV-геноспецифичные олигонуклеотидные зонды (1а, 1b, 2а, 2b, 3а и 3b) и специфичные непосредственно на выявление HCV, а также все необходимые контроли. Метод основан на обратной гибридизации иммобилизированных на твердофазный носитель зондов с высококонсервативным участком комплементарной ДНК (кДНК) HCV. Детекция гибридизационного комплекса ДНК-зонда осуществляется колориметрически после ферментативного введения репортерной группы в олигонуклеотидный зонд и амплификации сигнала с помощью биотин-стрептавидиновой системы и хромогенных субстратов. Таким образом, для выявления и генотипирования HCV данным методом необходима постановка только 1 (одной) реакции.
Кроме того, следует отметить, что предложенный способ отличается высокой чувствительностью при выявлении HCV.
Так, приведённые данные позволяют судить о наличии или отсутствии генетического материала после проведения анализа тест-системой «Амплисенс» (1) и с помощью предложенного способа (2) (рисунок 1).
Рисунок 1
Сравнительные результаты генодиагностики HCV-инфекции
1
2
1 - разделение полученных ПЦР-смесей в 1,5 % агарозном геле с окраской бромистым этидием (тест-система «Амплисенс»).
2 - сканированное изображение ДНК-чипа, несущего специфичный зонд с окрашивания хромогенными субстратами.
1051, 1061 и 1575 - номера исследуемых образцов
96 Батыс Цазацстан медицина журналы №2 (26) 2010 ж.
Медицинский журнал Западного Казахстана №2 (26) 2010 г.
Таким образом, лабораторная диагностика вирусного гепатита С, с учетом особенностей биологии возбудителя, патогенеза и клинического течения инфекции, достаточно сложна. Методы, используемые для диагностики ВГС, имеют свои преимущества и недостатки. В связи с этим необходимо комплексное использование, разумное сочетание и адекватная интерпретация их с учетом фазы патологического процесса.
Внедрение метода генотипирования вируса гепатита С на основе ДНК-биочипов - перспективная задача для улучшения диагностики HCV-инфекции, что определит своевременную лечебную тактику и проведение эффективных профилактических мероприятий. Литература:
1. Онищенко Г.Г. О государственных мерах по предупреждению распространения в Российской Федерации заболеваемости инфекционными гепатитами // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2002. - № 3. - С. 4-8.
2. Hoofnagle J.H. Course and outcome of hepatitis C // Hepatology. - 2002. - 36. - Suppl.1. - P. 21-29.
3. Пименов В.К., Афанасьев А.Ю., Зубов С.В., Зубаров П.Г. и др. Корреляции между выявлением антител к структурным и неструктурным белкам HCV и обнаружением PHK HCV при хроническом гепатите С // В кн.: Гепатит В, С, D - проблемы диагностики, лечения и профилактики. -Москва. - 1999. - С. 191.
4. Martinelli A.L. С, Brown D., Braun H.-B. et al. Quantitative assessment of hepatitis С virus RNA and IgM antibodies to hepatitis С core in chronic hepatitis C // J. Hepatology. - 1996. - V.24. - Р. 21-26.
5. Negro F., Abate M.L., Mondardini A., Baldi M., Leandro G., Lombardi S. et al. The fluctuations of hepatitis C virus RNA and IgM anti-HCV(core) serum levels correlate with those of alanineaminotransferases during the hepatitis relapses of patients treated with interferon // J. Viral. Hepatology. - 1995. - V.2. - № 4. - Р. 171-174.
6. Pawlotsky J.M. Use and interpretation of hepatitis C virus diagnostic assays // Clin. Liver Dis. - 2003. - Vol.7. -P. 27-37.
7. Гущин А.Е., Носкова О.М., Шипулин Г.А. Разработка набора реагентов «Амплисенс HCV-генотип» для определения субтипов 1а, 1b, 2а, 3а вируса гепатита С // Вопросы вирусологии. - 2003. - Т. 48. - №3. - С. 45-48.
8. Зарытова В.Ф., Пышная И.А., Пышный Д.В., Филиппенко М.Л., Иванова Е.М. Уникальные тест системы для выявления и генотипирования вируса гепатита С // III международная конференция «Высокие медицинские технологии в XXI веке», 31 октября - 7 ноября 2004 г. - г. Бенидорм. - Испания. - С. 35-36.
ТYЙIН
Г.А. ШОПАЕВА, 1И.А. ПЫШНАЯ, 1Е.В. ДМИТРИЕНКО, 1В.Ф. ЗАРЫТОВА, 1Д.В. ПЫШНЫЙ, Ш.А.
БЕЙСЕМБАЕВА, 2Д.А. КУШЕНОВА
С ВИРУСТ1 ГЕПАТИТТЩ ДИАГНОСТИКАЛЫК ЗЕРТХАНАЛЫК ЭД1СТЕМЕС1
С.Д. Асфендияров атындагы К,аза^ улттыщ мемлекеглк медицина университету 2 ^алальщ жу^палы аурулар кпиникалыщ ауруханасы Алматы ^аласы, Казахстан, 1РГА СБ химиялыщ биология жэне iргелi медицина институты, Новосiбiр ^аласы, Ресей
Ма^алада Н^ жу^палы непзп зертханалыщ аныщтау эдютемеа келлртген. Генодиагностика -аурудын (РНК-HCV) алгаш^ы маркерш аныщтауга кемектеседк Жана эдютеме HCV жу^палы ауруын ДНК биочиптерi непзшде С вируст гепатитш генотиптеу ма^сатында денсаулыщ са^тау мекемелерi y^1^ перспектива эдю болып табылады.
., , _ Г ,„.. „ „,„, „„.,„ Батыс Казахстан медицина журналы №2 (26) 2010 ж. 97 Медицинский журнал Западного Казахстана №2 (26) 2010 г. N_!_ _;___
SUMMARY
G.A. SHOPAYEVA, 1I.A. PYSHNAYA, 1E.V. DMITRIYENKO, 1V.F. ZARYTOVA, 1D.V. PYSHNYI, SH.A. BEISEMBYAEVA, 2D.A. KUSHENOVA
MODERN APPROACHES TO LABORATORY DIAGNOSTICS OF VIRAL HEPATITIS C
The Kazakh national medical university named after S.D. Asfendiyarov, the 2nd city infectious clinical
hospital, Almaty city, Kazakhstan, the 1st institute of chemical biology and fundamental medicine of SB RAS, Novosibirsk city, Russia
The article presents the main methods of laboratory diagnostics of HCV-infection. Genodiagnostics allows to detect the earliest marker of disease (RNA-HCV). The new approach to diagnostics of HCV-infection on the basis of DNA-biochips for genotyping of hepatitis C virus is perspective for practice of public health services.
Г.А. КАПАШЕВА
ОПЫТ ПРИМЕНЕНИЯ ПРЕПАРАТА «КАВИНТОН» В ЛЕЧЕНИИ ДИСЦИРКУЛЯТОРНОЙ ЭНЦЕФАЛОПАТИИ
Госпиталь департамента внутренних дел, г. Уральск
Актуальность. Функциональная активность головного мозга тесно связана с уровнем кровоснабжения, бесперебойной доставки кислорода и глюкозы. Мозг потребляет около 20 % кислорода и 65 % глюкозы, утилизируемой организмом. Такая большая энергоемкость необходима для обеспечения метаболизма нервной ткани и нормального функционирования головного мозга. Нарушение мозгового кровообращения приводит к ишемии и гипоксии, сопровождающейся глубокими сдвигами биохимических процессов, выявляющимися в клинике определенным патологическим симптомокомплексом. В некоторых случаях мозг временно компенсирует дефицит кровоснабжения ишемического очага путем увеличения коллатерального кровотока в этом регионе, но при исчерпании этих возможностей проявляются симптомы цереброваскулярной недостаточности [1,2].
Ишемические поражения головного мозга занимают в настоящее время доминирующее положение в структуре цереброваскулярной заболеваемости, составляя в поликлиниках и стационарах более 70 % всех сосудистых заболеваний мозга. В связи с наметившейся в последние годы тенденцией увеличения частоты хронических форм церебральной ишемии представляется актуальной разработка эффективных методов лечения дисциркуляторной энцефалопатии, возникающей вследствие медленно прогредиентно нарастающей недостаточности кровоснабжения мозга на фоне атеросклероза, артериальной гипертензии или их сочетания [3,4].
Цель исследования - определение эффективности применения препарата «Кавинтон» для лечения дисциркуляторной энцефалопатии.
Материалы и методы исследования. Нами исследовано 40 больных с дисциркуляторной энцефалопатией, пролеченных вазоактивным препаратом «Кавинтон». Этиологическими факторами ДЭ среди обследованных больных являлись гипертоническая болезнь (32 %), атеросклероз (31 %), сочетание атеросклероза с артериальной гипертензией (37 %), что отражено в таблице 1.
У 33 % больных неврологическая симптоматика указывала на преимущественное вовлечение каротидного бассейна; у 28 % - вертебро- базилярной системы; у остальных симптоматика диффузная. В первые 10 дней пребывания в стационаре пациенты ежедневно получали внутривенные капельные инфузии кавинтона в дозе 20 мг в 200 мл физиологического раствора, а затем 10 мг препарата (по 1 таблетке 3 раза в день) в течение 20-30 дней.
Больным всех групп проведена запись биоэлектрической активности мозга (РЭГ, ЭЭГ), нейропсихологические исследования и биохимия крови.
98 Батыс Казахстан медицина журналы №2 (26) 2010 ж. , _ _ " „ .. _________
_;_ _!___Медицинский журнал Западного Казахстана №2 (26) 2010
