CC BY
66
УДК 616.36-002:616-097
ПРИМЕНЕНИЕ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА И ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ГЕПАТИТ С- ВИРУСНОЙ (HCV-) ИНФЕКЦИИ
В. М. Мицура, О. В. Пантелеева, С. В. Жаворонок, Е. Л. Красавцев, И.Л. Павлович, А.В. Воропаева, Аль-Ханса Аль-Шаби
Гомельский государственный медицинский университет Гомельская областная инфекционная клиническая больница
С целью оценки значения иммуноферментного анализа (ИФА) и полимеразной цепной реакции (ПЦР) для диагностики HCV-инфекции, обследовано 500 больных с острыми и хроническими формами HCV-инфекции. В сыворотках крови этих больных определялись РНК HCV с помощью ПЦР и антитела к HCV (анти-HCV tot и у 35 больных анти-HCV IgM). Положительные результаты ПЦР наблюдались у 83% больных и чаще соответствовали повышенным значениям АЛТ (х2 = 25,01; р = 0,0001). Положительные результаты ПЦР и ИФА наблюдались в 81,8% случаев, отрицательные результаты ПЦР и ИФА наблюдались в 0,4% случаев. В 17,8% случаев результаты ПЦР и ИФА не совпадали. В группе больных с выявленными анти-HCV IgM, РНК HCV выявлялась достоверно чаще (p = 0,009), чем при их отсутствии. Чувствительность теста анти-HCV IgM по сравнению с ПЦР 51,9%, специфичность — 100%. Определение антител к HCV класса IgM может применяться для оценки повышенной репликативной активности HCV. Совместное использование методов ПЦР и ИФА позволяет усовершенствовать лабораторную диагностику HCV-инфекции.
Ключевые слова: хронический гепатит С, РНК HCV, ПЦР, ИФА, антитела к HCV общие и класса IgM.
THE USE OF ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY AND POLYMERASE CHAIN REACTION FOR DIAGNOSTICS OF HEPATITIS C VIRUS (HCV-) INFECTION
V. M. Mitsura, O. V. Panteleeva, S. V. Zhavoronok, E. L. Krasavtsev, I. L. Pavlovich, A. V. Voropaeva, Al-Khansa Al-Shabi A.
Gomel State Medical University Gomel Regional Infectious Clinical Hospital
The aim of this study was to evaluate the significance of enzyme-linked immunosorbent assay (EIA) and polymerase chain reaction (PCR) in diagnostics of hepatitis C virus (HCV-) infection. The sera samples from 500 of patients with acute and chronic forms of HCV-infection were tested by means of PCR and EIA (anti-HCV total and IgM in 35 of patients). PCR positive results were seen in 83% of patients and more often revealed in those patients with elevated ALT levels (х2 = 25.01; р = 0.0001). Both PCR and EIA positive results were in 81.8% of patients, both negative — in 0.4%. In 17.8% of cases results of PCR and EIA didn't agree. In patients with anti-HCV IgM positive, HCV RNA were revealed more often than in those anti-HCV IgM negative (p = 0.009). Sensitivity of the anti-HCV IgM test in comparison with PCR was evaluated 51.9%, specificity - 100%. Detection of antibodies to HCV class IgM can be applied for an estimation of increased replicative activity of HCV. The use of both methods (EIA and PCR) allows improving HCV-infection diagnostics.
Key words: chronic hepatitis C, HCV RNA, PCR, EIA, antibodies to HCV total and IgM.
Введение
Актуальность инфекции вирусом гепатита С (ИСУ-инфекции) в настоящее время не вызывает сомнений. Так, в Республике Бела-
русь насчитывается около 100 000 лиц, инфицированных ИСУ, что составляет 1% населения страны, из которых 10% имеют манифестные формы инфекции [1]. Для ИСУ-
инфекции характерно длительное бессимптомное течение с отсутствием характерных клинических симптомов. При этом заболевание чаще всего выявляется на стадии хронического гепатита или даже цирроза печени. Поэтому лабораторная диагностика ИСУ-инфек-ции имеет очень большое значение [2, 3].
За последние годы лабораторная диагностика ИСУ-инфекции значительно улучшилась. Для скрининга ИСУ-инфекции применяется, в основном, иммуноферментный анализ (ИФА). На смену иммунофермент-ным тест-системам 1-го и 2-го поколений в практику пришли тест-системы 3-го поколения, позволяющие выявить 97% инфицированных ИСУ [3,4,5]. Однако антитела реже выявляются у больных с иммуноде-фицитами, включая ВИЧ-инфекцию, — лишь у 50-95% [4]. Антитела класса 1§М могут выявляться не только при остром вирусном гепатите С (ОВГС), но и при хроническом гепатите С (ХГС) в период обострения заболевания и свидетельствуют об активной репликации вируса [6].
Выявление РНК ИСУ в сыворотке крови с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) характеризует вирусемию, свидетельствующую о продолжающейся активной репликации ИСУ. Метод ПЦР имеет высокую специфичность и чувствительность, с его помощью можно также определять концентрацию вируса в исследуемом материале. Также ПЦР используется для мониторинга терапии, поскольку исчезновение вирусемии — один из критериев эффективности терапии. Однако полностью не исключается возможность получения как лож-ноотрицательных, так и ложноположитель-ных результатов [4]. Уровень виремии, выявляемый с помощью ПЦР, не всегда коррелирует с активностью процесса и значениями аланинаминотрансферазы (АЛТ) [7].
Цель исследования: оценить значение иммуноферментного анализа (ИФА) и полимеразной цепной реакции (ПЦР) для диагностики ИСУ-инфекции.
Материалы и методы
Обследовано 500 больных с острыми и хроническими формами ИСУ-инфекции, находившихся на лечении и консультации в Гомельской областной инфекционной клинической больнице в 2003-2005 годах. Среди обследованных 500 больных — 180
(36%) женщин и 320 (64%) мужчин, средний возраст — 35,4±1,8 лет. В возрасте до 20 лет было 73 больных (14,6%), 21-40 лет — 262 (52,4%), старше 40 лет — 165 (33%).
Из 500 обследованных у 15 человек (3,0%) был выставлен клинический диагноз «Острый вирусный гепатит С». У 485 из 500 человек (97%) диагностированы хронические формы HCV-инфекции: ХГС — у 373 больных (76,9%), ХГС в стадии цирроза печени — у 112 человек (23,1%).
Биохимическая активность ХГС (оценивалась у 470 чел.) на момент обследования в стационаре отсутствовала у 97 больных (20,6%), была минимальной (повышение АЛТ от 1 до 3 норм) — у 179 (37,7%), умеренной (повышение АЛТ от 3 до 10 норм) — у 154 (33,2%), высокой (АЛТ свыше 10 норм) — у 40 человек (8,5%).
Сыворотки крови этих больных исследовались методом ИФА на обнаружение общих (total, IgM+IgG) антител к HCV (ан-ти-HCV tot) с использованием тест-систем фирмы НПО «Диагностические системы» (Н.Новгород). Общие антитела к HCV определялись у 494 человек (98,8%). Сыворотки крови 35 пациентов тестировались на обнаружение антител к HCV класса IgM (анти-HCV IgM) с помощью тест-систем фирмы «ИмБио» (Н.Новгород). Из них у 14 (40,0%) выявлялись анти-HCV IgM. Сыворотки крови данных больных одновременно исследовались методом ПЦР на наличие РНК HCV с использованием тест-систем фирмы «АмплиСенс» (Россия). Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием программы «STATISTICA v.6.0». Оценка значимости различия частот наблюдений в четырехпольных таблицах проводилась с помощью Х2-критерия Пирсона и точного критерия Фишера. Статистически значимой считалась 95% вероятность различий (а = 0,05).
Результаты и обсуждение
Из 500 обследованных больных положительные результаты ПЦР наблюдались у 415 (83%), отрицательные — у 85 (17%).
Проведено сравнение частоты выявления РНК HCV в зависимости от биохимической активности: у больных с нормальными значениями АЛТ (до 0,20 мккат/л) и повышенным уровнем АЛТ (более 0,20 мккат/л) (табл. 1).
Таблица 1
Результаты ПЦР-анализа в зависимости от биохимической активности HCV-инфекции
Биохимическая активность РНК+ РНК-
Вне активности (n=97) 64 (66%) 33 (34%)
Повышенная (n=373) 326 (87,4%) 47 (12,6%)
X2 = 25,01; р = 0,0001
В группе больных с повышенной биохимической активностью (АЛТ более 0,20 мккат/л) РНК HCV выявлялась достоверно чаще (по критерию х2 Р = 0,0001), чем при нормальной активности. Однако повышенная биохимическая активность не всегда соответствует вирусологической репликации. Поэтому для более точной оценки активности процесса при HCV-инфекции необходимо использовать совместно определение АЛТ и ПЦР на обнаружение РНК HCV в сыворотке крови.
Сопоставлены результаты, полученные с помощью методов ИФА (анти-HCV tot) и ПЦР (РНК HCV) у 484 больных. Положительные результаты ПЦР и ИФА наблюдались в 396 случаях (81,8%), отрицательные результаты ПЦР и ИФА наблюдались в 2 случаях (0,4%). В 86 (17,8%) случаев результаты ПЦР и ИФА не совпадают.
Отрицательные результаты ПЦР и положительные результаты ИФА наблюдались в 83 случаях (17,2%). Такая картина характерна для ОВГС после прекращения вирусемии (8 случаев), после перенесенного ОВГС (1 случай), после успешной ин-терферонотерапии ХГС (18 случаев). В остальных 56 случаях из 83 (67,5%) такое сочетание отмечалось у больных латентными формами ХГС и у пациентов в стадии цир-
роза печени, когда репликация ИСУ невысока и концентрации РНК вируса в крови ниже порога определения ПЦР. При этом в 38 случаях отсутствие РНК ИСУ сочеталось с наличием повышенного уровня АЛТ. Повышение АЛТ, по нашему мнению, могло не являться следствием активации ИСУ, а возникать в результате потребления алкоголя, обострения сопутствующих хронических заболеваний (холецистит, панкреатит, и др.).
Положительные результаты ПЦР и отрицательные результаты ИФА встречались в 3 случаях (0,6%). Эти эпизоды расценивались как серонегативный период ОВГС (2 случая), а при ХГС (в 1 случае) также, возможно, говорит о слабом антительном ответе вследствие иммунодефицита либо индивидуальных особенностей антителообразования.
Следует учитывать, что несоответствие результатов ИФА и ПЦР могут быть также следствием ложной негативности или ложной позитивности этих лабораторных тестов.
Известно, что обнаружение анти-ИСУ 1§М, как и РНК ИСУ, свидетельствует об активной репликации вируса. Проведено сравнение частоты выявления РНК ИСУ в зависимости от наличия анти-ИСУ 1§М у больных ХГС (табл. 2).
Таблица 2
Выявление РНК HCV в зависимости от наличия анти-HCV IgM
Выявление анти-HCV IgM РНК+ РНК-
Анти-HCV IgM+ (n=14) 14 (100%) 0
Анти-HCV IgM- (n=21) 13 (62%) 8 (38%)
р = 0,009 (по точному критерию Фишера)
В группе больных с выявленными сутствии. Выявление анти-ИСУ 1§М в анти-ИСУ 1§М, РНК ИСУ выявлялась дос- 100% случаев соответствует вирусемии. В товерно чаще (р = 0,009), чем при их от- то же время анти-ИСУ 1§М не выявлялись
при обнаружении РНК вируса в крови в 62% случаев, что отражает более высокую чувствительность метода ПЦР по сравнению с обнаружением a-HCV IgM. В 8 случаях отсутствие анти-HCV IgM наблюдалось при отсутствии РНК в крови, что говорит о ремиссии заболевания.
Оценена чувствительность теста на ан-ти-HCV IgM в сравнении с ПЦР. Истинно положительных результатов (ИП) — 14, ложно отрицательных (ЛО) — 13. По формуле [5] чувствительность теста = (ИП/(ИП+ЛО)) х 100% = 51,9%. Специфичность теста на анти-HCV IgM в сравнении с ПЦР также оценивалась по формуле [5]. Истинно отрицательных (ИО) результатов — 8, ложно положительных (ЛП) — 0. Специфичность теста = (ИО/(ИО+ЛП))хЮО% = 100%. Таким образом, при отсутствии возможности выполнения ПЦР-анализа, определение антител к HCV класса IgM может применяться для оценки повышенной реп-ликативной активности HCV.
Выводы:
1. У больных с повышенной биохимической активностью (АЛТ более 0,20 мккат/л) РНК HCV выявлялась (87,4%) достоверно чаще, чем у больных с нормальными значениями АЛТ (до 0,20 мккат/л) (66,0%; р = 0,0001).
2. Результаты методов ИФА (анти-HCV tot) и ПЦР (РНК HCV) совпадают у 82,2% больных, в 17,8% случаев результаты ПЦР и ИФА не совпадают. Отсутствие РНК HCV на фоне позитивного теста на анти-HCV tot в 67,5% случаев наблюдается при текущей хронической HCV-инфекции и зачастую сочетается с повышением АЛТ.
3. Тест на анти-HCV IgM позволяет оценить вирусную репликацию HCV. Обнаружено, что в группе больных с выявленными анти-HCV IgM в 100% выявлялась РНК HCV, что достоверно чаще (p = 0,009),
чем при отсутствии анти-ИСУ 1§М (62%).
4. Чувствительность теста на анти-ИСУ 1§М по сравнению с ПЦР составляет 51,9%, специфичность — 100%, что позволяет рекомендовать определение анти-ИСУ 1£М для оценки повышенной реплика-тивной активности ИСУ при невозможности определения РНК ИСУ методом ПЦР.
5. Совместное использование методов ПЦР и ИФА позволяет усовершенствовать лабораторную диагностику ИСУ-инфекции.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Жаворонок, С. В. Система диагностики диффузных паренхиматозных поражений печени у различных групп населения с повышенным риском инфицирования вирусными гепатитами В, С, Б, в: Метод. ре-ком. / С. В. Жаворонок [и др.]. — Мн., 1998. — 52 с.
2. Соринсон, С. Н. Вирусные гепатиты / С. Н. Со-ринсон. — Спб.: ТЕЗА, 1998. — 325 с.
3. Балаян, М. С. Энциклопедический словарь -вирусные гепатиты. / М. С. Балаян, М. И. Михайлов. — Изд. 2-е, перераб. и дополн. — М.: Ами-пресс, 1999. — 304 с.
4. Шахгильдян, И. В. Парентеральные вирусные гепатиты (этиология, диагностика, профилактика) / И. В. Шахгильдян, М. И. Михайлов, Г. Г. Они-щенко. — М.: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, 2003. — 384 с.
5. Залеских, Н. В. Система внешнего и внутреннего контроля качества в иммуноферментном анализе: Информ. материалы / Н. В. Залеских, М. Н. Кокорева, Т.В. Сивилева. — Н. Новгород: Диагностические системы, 2003. — 42 с.
6. Радченко, В. Г. Хронические заболевания печени (этиология, клиника, диагностика, лечение, эпидемиология и профилактика) / В. Г. Радченко, А. В. Шаб-ров, В. В. Нечаев.-СПб.: Лань, 2000. — 192 с.
7. Является ли репликация вируса гепатита С маркером степени активности инфекционного процесса? По данным полимеразной цепной реакции и морфологического анализа биопсий печени / Г.И. Непомнящих [и др.] // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. — 2003. — Т. 135. № 3. — С. 343-348.
Поступила 4.12.2006
УДК 616.15:616.61-008.64]-053.2 ИНФОРМАЦИОННАЯ ЗНАЧИМОСТЬ НЕКОТОРЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ КРОВИ У ДЕТЕЙ С ОСТРОЙ ПОЧЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТЬЮ
Л. Л. Миронов
Белорусская медицинская академия последипломного образования, Минск
Острая почечная недостаточность (ОПН) вовлекает в патологический процесс многие органы и системы больного, нарушая многочисленные физиологические контакты организма. Это требует тщательного мониторинга системы гомеостаза для получения своевременной информации о неблагоприятных отклонениях в организме и принятия соответствующих мер по их устранению. Однако при этом число исследований крови у детей с
