CC BY
198
Bengoufa D., Feuillard J., Lavergne A., Gordon J.I., Berche p., Guillevin L., Lortholary o. immunoproliferative small intestinal disease associated with campilobacter jejuni. N. Engl. J. Med. 2004; 350: 239—48.
19. isaacson p.G. Gastrointestical lymphoma. Hum. Patol. 1994; 25: 1020—9.
20. Kassan s.s., Thomas TX., Moutsopoulos H.M., Hoover R., Kimberly R.p., Budman D.R., costa J., decker J.L., chused T.M. increased risk of lymphoma in sicca syndrome. Ann. Intern. Med. 1978; 89: 888—92.
21. Aozasa K. Hashimoto«s thyroiditis as a risk factor of thyroid lymphoma. Acta Pathol. Jpn. 1990; 40: 459—68.
22. Radaszkiewicz T., Dragosics B., Bauer p. Gastrointestical malignant lymphomas of the mucosa-associated lymphoid tissue: factors relevant to prognosis. Ga.strointerology.1992; 102: 1628—38.
23. Thieblemont c., bastion Y., Berger F., Rieux c., salles G., Dumontet c., Felman p., coiffier B. mucosa-associated lymphoid tissue gastrointesti-cal and nongastrointestical lymphoma behavior: analysis 108 patients. Blood. 1997; 95: 802—6.
24. Raderer M., streubel B.,Woehrer s., puespoek a., Jaeger u., Formanek M., chott A. high relapse rate in patients with Malt lymphoma warrants lifelong follow-up. Clin. Cancer Res. 2005; 11: 3349—52.
25. Wohrer s., steubel B., Bartsch R., chott A., Raderer M. Monoclonal
microbiology
immunoglobulin production is a frequent event in patients with muco-sa-associated lymphoid tissue lymphoma. Clin. Cancer Res. 2004; 10: 7179—81.
26. price s.K., Immunoproliferative small intestinal disease: a study of 13 cases with alpha heavy-chain disease. Histopathology. 1990; 17: 7—17.
27. Berger F., Felman p., Thieblemont c., pradier T., Baseggio L., Bryon p. A., salles G., Callet-Bauchu E., coiffier b. Non-MALT marginal zone B-cell lymphomas: a description of clinical presentation and outcome in 124 patients. Blood. 2000; 95: 1950—6.
28. Arcaini L., paulli M., Burcheri S., Rossi A., Spina M., passamonti F., Lu-cioni M., Motta T., Canzonieri V., Montanari M., Bonoldi E., Gallamini A., Uziel L., Crugnola M., Ramponi A., Montanari F., pascutto C., Morra E., Lazzarino M. primary nodal marginal zone B-cell lymphoma: clinical features and prognostic assessment of rare disease. Br. J. Haematol. 2007; 136: 301—4.
29. Taddesse-Heath L., pittaluga S., Sorbara L., Bussey M., Raffeld M., Jaffe E.S. Marginal zone B-cell lymphoma in children and young adults. Am. J. Surg. Pathol. 2003; 27: 522—531.
Поступила 30.03.17 Принята к печати 15.04.17
микробиология
© коллектив авторов, 2017 УДК 579.861.2.083.18
Балбуцкая А.А.1, Дмитренко О.А.2, Скворцов в.Н.1
современные особенности видовой идентификации
коагулазоположительных бактерий рода staphylococcus
1 Белгородский филиал ФГБНУ «всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко», 308002, Белгород, Российская Федерация;
2 ФГБУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.почетного акад. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава РФ, 123098, Москва, Российская Федерация
Развитие молекулярных методов исследований в конце XX века позволило расширить номенклатуру видов, образующих род Staphylococcus, который в настоящее время насчитывает 51 вид и 27 подвидов. Патогенные виды рода обладают способностью коагулировать плазму крови млекопитающих, образуя группу коагулазопозитивных стафилококков (КПС), включающую 7 видов: S. aureus, S. delphini, S. intermedius, S. pseudintermedius, S. lutrae, S. schleiferi ssp. coagulans, S. hyicus. В клинической практике наиболее вирулентным среди стафилококков считается S. aureus. Накопленные данные свидетельствуют о возрастающей этиологической значимости в инфекционной патологии человека и животных других представителей группы КПС. Пристального внимания заслуживают Staphylococcus intermedius группы (SIG), объединяющей три близкородственных вида: S. pseudintermedius, S. intermedius, S. delphini, среди которых наиболее широкое распространение получили метициллинустойчивые клоны S. pseudintermedius, способные вызывать различные гнойно-воспалительные заболевания у человека. Лабораторные методы, основанные на фенотипических тестах, не позволяют дифференцировать КПС из-за значительного сходства фенотипических свойств у некоторых представителей этой группы. Проведён сравнительный анализ эффективности различных методов видовой идентификации КПС: биохимического, молекулярно-генетических (мультипраймерная ПЦР (М-ПЦР) для идентификации различий структуры гена термонуклеазы, анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) гена каталазы и их секвенирование), матрично-активированная лазерная десорбционная/ионизационная времяпролетная масс-спектрометрия (MALDI-ToF MS) с различными способами пробоподготовки. Исследовано 117 изолятов представителей SIG, выделенных от больных и здоровых особей мелких домашних животных, клинические изоляты от пациентов стационаров. М-ПЦР позволила идентифицировать 97% изолятов, ПДРФ-анализ — 100% изолятов, что подтверждает эффективность молекулярно-генетических методов исследования. MALDI-ToF MS требует пополнения базы данных масс-спектрометра и использование способа предварительной белковой экстракции проб для повышения эффективности видовой идентификации КПС.
Ключевые слова: коагулазоположительные стафилококки; Staphylococcus intermedius group (SIG); видовая идентификация, молекулярно-генетические методы; nuc ген; katA ген; времяпролетная MALDI масс-спектрометрия.
Для цитирования: Балбуцкая А.А., Дмитренко О.А., Скворцов В.Н. Современные особенности видовой идентификации коагулазоположительных бактерий рода Staphylococcus. Клиническая лабораторная диагностика. 2017; 62 (8): 497502. DOI: http://dx.doi.org/10.18821m69-2084-2017-62-8-497-502
Для корреспонденции: Балбуцкая Анна Александровна, канд. биол. наук, вед. науч. сотр. Белгородского филиала ФГБНУ «Всероссийский НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко», e-mail: [email protected]
КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА. 2017; 62(8) DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2017-62-8-497-502
МИКРОБИОЛОГИЯ
BalbutskayaA.A.', Dmitrenko O.A.2, Skvortsov V.N.1
THE MODERN CHARACTERISTICS OF SPECIES IDENTIFICATION OF COAGULASE-POSITIVE BACTERIA OF GENUS
1The Belgorodskii branch of the Ya.R. Kovalenko All-Russian research institute of experimental veterinary medicine, 308002 Belgorod, Russia
2the academician N.F. Gamaleia research institute of epidemiology and microbiology of Minzdrav of Russia, 123098 Moscow, Russia
The development of molecular techniques of research in the end of XX century permitted to broaden nomenclature of species forming genus Staphylococcus that nowadays numbers 51 species and 27 sub-species. The pathogenic species of genus have a capacity to coagulate blood plasma of mammals forming group of coagulase-positive staphylococci including 7 species: S. aureus, S. delphini, S. intermedius, S. pseudintermedius, S. lutrae, S. schleiferi ssp. coagulans, S hyicus. In clinical practice, S.aureus is considered as the most virulent among staphylococci. The cumulated data testifies increasing etiologic significance of other representatives of group of coagulase-positive staphylococci in human and animal infection pathology. The keen attention is needed to be paid to Staphylococcus intermedius of group (SIG), uniting three close kindred species: S. pseudintermedius, S. intermedius, S. delphini. Among them the most broadly prevailed are methicillin-resistant clones of S. pseudintermedius, capable to bring on in patient various pyoinflammatory diseases. The laboratory methods based on phenotype tests, provide no opportunity to differentiate coagulase-positive staphylococci because of significant similarity ofphenotype characteristics in certain representatives of this group. Te comparative analysis was implemented concerning efficiency of various methods of species identification of coagulase-positive staphylococci: biochemical, molecular genetic (multi-primer polymerase chain reaction for identifying differences in gene structure of thermonuclease, analysis of polymorphism of lengths of restricting fragments of catalase gene and their sequencing), matrix-activated laser desorptional/ ionizing time-of-flight mass-spectrometry (MALDI-ToF MS) with various modes of probe preparation. The analysis was applied to 117 isolates of representatives of SIG, separated from ill and healthy individuals of small domestic animals, clinical isolates form patients of hospitals. The multi-primer polymerase chain reaction permitted to identify 97% of isolates, analysis ofpolymorphism of lengths of restricting fragments of catalase gene - 100% of isolates that confirms efficiency ofmolecular genetic methods of analysis. The MALDI-ToF MS requires replenishment data base of mass-spectrometer and application of the mode of preliminary protein extraction of samples fo increasing efficiency of species identification of coagulase-positive staphylococci.
Keywords: coagulase-positive staphylococci; Staphylococcus intermedius group; species identification; molecular genetic
methods; nuc gene; katA gene; matrix-activated laser desorptional/ionizing time-of-flight mass-spectrometry For citation: BalbutskayaA.A., Dmitrenko O.A., Skvortsov V.N. The modern characteristics of species identification of coagulase-positive bacteria of Staphylococcus genus. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics) 2017; 62 (8): 497-502. (inRuss.). DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2017-62-8-497-502
For correspondence: BalbutskaiaA.A., candidate of biological sciences, leading researcher. e-mail: [email protected] Conflict of interests. The authors declare absence of conflict of interests. Acknowledgment. The study had no sponsor support.
Received 28.03.2017 Accepted 03.04.2017
Введение. В зависимости от способности коагулировать плазму крови млекопитающих бактерии рода Staphylococcus делят на 2 кластера: коагулазоположительные (КПС) и коа-гулазоотрицательные (КОС). На протяжении десятилетий наиболее вирулентными для человека в клинической практике считали единственный коагулазоположительный вид S. aureus и ограниченное число видов КОС, в том числе S. epidermidis, S. haemolyticus, S. warneri, S. capitis, S. lugdunensis и некоторые др. Согласно данным многочисленных исследований, S. aureus является одним из ведущих этиологических агентов, вызывающих развитие инфекций кожи и мягких тканей, пневмонии, септицемии, эндокардита, токсического шока, девайс-ассоциированных инфекций и многих других заболеваний человека и животных [1]. Появление и последующее широкое распространение эпидемических штаммов, устойчивых к метициллину/оксациллину и другим антимикробным агентам (MRSA), существенно осложняет лечение стафилококковой инфекции, требует строгого соблюдения мер инфекционного контроля и делает неотложной необходимость правильной видовой идентификации и определения чувствительности возбудителя к антимикробным препаратам [2]. Интенсивное изучение экологии S. aureus, предпринятое с конца 70-х годов прошлого века, и применение в дальнейшем молекулярных методов исследований позволило выделить в самостоятельные таксоны: S. intermedius, S. delphini, S. pseudintermedius, S. schleiferi ssp. coagulans, S. lutrae, S. hyicus, естественными хозяевами которых являются животные [3—8]. Из-за сходства биохимических свойств в отдельную группу — Staphylococcus intermedius group (SIG)
— объединены три близкородственных вида: S. intermedius, S. delphini, S. pseudintermedius [9]. Накапливается всё больше данных, согласно которым неуклонно растёт этиологическая значимость микроорганизмов SIG в инфекционной патологии человека, в частности у людей со сниженным иммунитетом [10, 11]. Зарегистрированы гнойно-воспалительные заболевания, связанные с укусами животных, случаи бакте-риемий, инфекционного эндокардита, остеомиелита, инфекции мочевыделительной системы, синусита, отита, мастоидита, случаи инфекций кожи и мягких тканей. Для человека источником возбудителей служат животные, находящиеся с ним в тесном контакте, в том числе животные-компаньоны [12—14]. Доказано, что представители SIG могут передаваться и от человека человеку [15]. S. (pseud) intermedius может быть этиологическим агентом пищевых отравлений. Представители вида вызвали вспышку стафилококковой ток-сикоинфекции в США, охватившую более 250 человек. Все изоляты продуцировали энтеротоксин А, в отличие от типовых штаммов S. intermedius [16]. Опубликован случай выделения мультирезистентных изолятов S. intermedius, в том числе устойчивых к ванкомицину, из охлаждённого мяса кур. Выделенные изоляты содержали не менее одного гена энте-ротоксинов S. aureus [17]. Известен случай выделения MRSP из мяса верблюда [18].
Имеются лишь единичные сообщения о выделении представителей группы SIG от человека в России. При изучении этиологической структуры гнойно-септических осложнений в условиях ожогового стационара из патологического материала выделен S. intermedius у 9,09% больных в каче-
стве моновозбудителя, у 3,76% он обнаружен в составе ассоциаций. Данный микроорганизм был вторым по частоте выделения среди КПС после S. aureus, и, более того, от ожоговых больных S. intermedius изолировали чаще, чем КОС. Для идентификации возбудителей применяли общепринятые бактериологические методы [19]. S. intermedius обнаружены на предметах больничной обстановки хирургического отделения стационара и родильного дома [20], при обследовании птицефабрики — в патологическом материале птиц, у здоровых носителей из числа сотрудников птицефабрики и студентов, проходивших там практику [21]. В обоих исследованиях идентификацию проводили на основании биохимических тестов.
В отличие от КОС представители SIG, как правило, обладают большим набором факторов патогенности, включая специфические токсины (гемолизины, лейкоцидин, эксфоли-ативные и энтеротоксины), наличие таких ферментов, как ко-агулаза, протеаза, ДНК-аза, термонуклеаза, липаза и некоторых других, не позволяет отличить эту группу микроорганизмов от S. aureus при использовании рутинных лабораторных тестов [10, 22]. Представители SIG, в частности эпидемические клоны S. pseudintermedius, способны быстро приобретать гены резистентности ко многим антимикробным средствам различных классов, используемых в медицинской практике [23]. Их устойчивость к р-лактамным антибиотикам, как и у других представителей рода, обусловлена наличием стафилококковых хромосомных кассет mec, однако критерии оценки чувствительности к оксациллину/метициллину у S. aureus и представителей SIG различны [24]. Дифференциация КПС невозможна с помощью коммерческих биохимических тест-систем и автоматических бактериологических анализаторов, так как их базы данных не содержат всего спектра представителей SIG. Из-за отсутствия характерного пигмента бактериологи ошибочно идентифицируют микроорганизмы SIG как непигментированный S. aureus. Сложности возникают и при идентификации нетипичных представителей SIG и S. au-reus, обладающих замедленной реакцией плазмокоагуляции, в результате чего они могут быть отнесены к КОС.
Ведётся активный поиск генетических мишеней, позволяющих дифференцировать представителей вышеназванной группы, но исследователи так и не пришли к единому мнению об их эффективности из-за значительной степени гомологии отдельных генов у SIG и некоторых других видов стафилококка или ограниченности выборки изолятов КПС, использованных в исследованиях. Для идентификации бактерий рода Staphylococcus, в том числе КПС, в качестве быстрой, точной и экономически выгодной альтернативы перечисленным выше способам диагностики предложен метод матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации с использованием времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-ToF MS).
Цель работы — сравнить дифференцирующие возможности различных молекулярно-генетических методов и MALDI-ToF масс-спектрометрии для видовой идентификации КПС.
Материал и методы. В виду сложностей идентификации в клинических лабораториях представителей SIG — возбудителей заболеваний человека данное исследование выполнили на коллекции SIG, изолированных от животных-компаньонов. 112 изолятов S. intermedius и 5 изолятов S. schleiferi ssp. coagulans, выделенные от мелких домашних животных с различными гнойно-воспалительными заболеваниями, здоровых особей в Центральном регионе России, которые идентифицированы до вида с помощью биохимической тест-системы STApHYtest 24 (pLIVA-Lachema a.s., Чехия); 4 клинических изолята S. intermedius, выделенные от больного гангреной дистальных отделов конечностей и от ожоговых больных в больницах Белгорода; от пациента с остеомиелитом в Центральном институте травматологии и ортопедии им. Приорова (Москва). В качестве контрольных
microbiology
использованы референтные штаммы S. aureus NCTC 8325, S. intermedius DSM 20373Т, S. pseudintermedius LMG 22219T, S. delphini DSM 20771T и S. hyicus DSM 20249T
Дальнейшую идентификацию выполнили с помощью мультипраймерной ПЦР (М-ПЦР) для идентификации различий структуры гена термонуклеазы (nuc) [25], а также метода анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) гена каталазы (katA) [26]. Компьютерное моделирование ПДРФ-анализа выполнили с помощью программы GENtle V1.9.4. Исследование нуклеотидной последовательности katA гена проводили методом секвенирования. Секве-нирование ДНК проводили с помощью набора реактивов ABI pRISM BigDye Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer. Изоляты идентифицированы методом MALDI-ToF MS анализа на масс-спектрометре AutoflexIII (Bruker Daltonics, Германия). Белковые спектры анализировали с помощью MALDI Biotyper (версия 3.0, Bruker Daltonics, Германия).
Экстракцию ДНК бактерий проводили согласно разработанной методике [27]. При постановке ПЦР использовали: Taq-полимеразу «Силекс» (Россия), праймеры синтезированы фирмой «Евроген». Рестрикцию амплифицированно-го фрагмента katA гена осуществляли эндонуклеазой TaqI (Promega, США). Детекцию продуктов амплификации и рестрикции осуществляли методом гель-электрофореза в 1,5% агарозном геле с использованием гель-документирующей системы DNA Analizer (Россия).
Результаты. Молекулярно-генетическая идентификация. По результатам амплификации гена nuc методом М-ПЦР с видоспецифичными праймерами 117 изолятов коллекции разделены на 4 вида КПС: 107 изолятов S. pseudintermedius, 2 — S. delphini, 1 — S. intermedius, 4 — S. schleiferi ssp. coagulans, 3 штамма идентифицировать не удалось (рис. 1).
Для подтверждения достоверности результатов видовой идентификации, полученных при использовании амплификации фрагмента nuc гена, использован метод ПДРФ-анализа гена амплифицированного фрагмента katA. Для оценки дифференцирующей способности этого метода в исследование включены 6 видов КПС, 31 изолят SIG, 4 S. schleiferi ssp. coagulans, рефрентные штаммы S. aureus и S. hyicus, 3 изолята неидентифицированные с помощью М-ПЦР.
Использование эндонуклеазы TaqI позволило дифференцировать изоляты SIG и другие КПС. Все типовые культуры SIG и взятые в качестве контрольных ДНК изолятов S. aureus, S. schleiferi ssp. coagulans и S. hyicus имели специфические сайты рестрикции, которые показаны на рис. 2. Сравнивая полученные результаты с данными компьютерного моделирования рестрикции фрагмента katA гена с помощью эндонуклеазы TaqI, обнаружили соответствие в количестве и длине фрагментов рестрикции во всех секвенированных последовательностях, за исключением ДНК изолятов S. hyicus, которые в позиции 895 содержали одну нуклеотидную замену A на G, что вело к появлению нового дополнительного сайта рестрикции. Метод ПДРФ гена katA подтвердил результаты М-ПЦР, за исключением одного изолята. Изолят, идентифицированный в М-ПЦР как S. intermedius, отнесён к виду S. schleiferi ssp. coag-ulans. С помощью ПДРФ-анализа удалось идентифицировать изоляты, которые не образовали ампликоны в М-ПЦР. Два из трёх имели сайты рестрикции, специфичные для S. pseudinter-medius, третий не имел сайтов рестрикции. Результаты секве-нирования показали, что все участки katA гена КПС гомологичны соответствующему виду на 98—99%, а изолят, который не имел сайтов рестрикции, на 100% гомологичен katA гену S. warneri. Нуклеотидные последовательности участков гена katA исследованных изолятов добавлены в генный банк международной базы данных NCBI (KU641394—KU641400).
Изоляты S. intermedius, выделенные от людей, исследованы молекулярно-генетическими методами. 2 из 4 изолятов сфор-
КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА. 2017; 62(8) DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2017-62-8-497-502
МИКРОБИОЛОГИЯ
Score
Рис. 1. Электрофореграмма М-ПЦР продуктов амплификации фрагментов nuc генов различных видов коагулазополо-жительных стафилококков в агарозном геле. Здесь и на рис. 2: М — ДНК-маркер (пар нуклеотидов); (K-) — отрицательный контроль.
1) S. delphini; 2) S. intermedius DSM 20373Т; 3) S. pseudintermedius; 4) S. pseudintermedius LMG 22219Т; 5) S. schleiferi ssp. coagulans; 6) S. pseudintermedius; 7) S. intermedius; 8) S. schleiferi ssp. coagulans; 9) S. delphini DSM 20771T.
мировали ампликоны с видоспецифическими праймерами для S. aureus в М-ПЦР, другие 2 не идентифицированы. Анализ katA гена этих изолятов методом секвенирования показал го-мологичность нуклеотидных последовательностей видам S. pseudintermedius на 99% и S. simulans на 95% соответственно.
MALDI-ToF MS анализ. Тестирование 117 изолятов коллекции методом MALDI-ToF масс-спектрометрии с использованием оригинальной базы данных прибора не позволило достоверно идентифицировать до вида ни один из микроорганизмов с критерием достоверности (score) от 2 до 2,3. Способом прямого нанесения образца на пластину до ро-
Рис. 2. TaqI ПДРФ-анализ гена katA коагулазоположитель-ных видов стафилококка. М — 1) S. aureus; 2) S. hyicus; 3) S. intermedius DSM 20373Т; 4) S. delphini DSM 20771T; 5) S. pseudintermedius LMG 22219T; 6) S. pseudintermedius; 7) S. schleiferi ssp. coagulans.
Метод прямого нанесения образца на мишень
Метод предварительной экстракции белков
Рис. 3. Идентификация изучаемых стафилококков методом MALDI—TOF-MS.
Здесь и на рис. 4: значения score соответствуют: 2,3—3 — высокой достоверности идентификации вида; 2—2,299 — достоверной идентификации рода микроорганизма и вероятной идентификации вида; 1,999— 1,7 — вероятной идентификации вида; <1,7 — отсутствие достоверной идентификации.
да идентифицировано 20% изолятов, из них только 5% до уровня вида с низкой степенью достоверности (score от 2 до 2,299). Способ предварительной экстракции белков позволил идентифицировать до рода 55% изолятов, но только 25% из них до вида со значением score от 2 до 2,299 (рис. 3). Большинство изолятов идентифицированы как S. intermedius, 2 изолята идентифицированы как S. schleiferi ssp. coagulans со score 2,003 и 2,293. 2 изолята — S. delphini со score 2,106 и 1,967. При анализе двух образцов одного изолята, включая референтные штаммы, микроорганизм мог быть отнесён с наибольшей вероятностью и к S. pseudintermedius, и к S. intermedius со score от 1,8 до 2,299.
Дифференцирующие возможности метода MALDI-ToF MS определены для 24 случайно выбранных изолятов в лаборатории микробиологии Центральной ветеринарной лаборатории земли Гессен, г Гиссен, Германия. Идентификацию проводили с использованием внутрилабораторной базы данных прибора, которая, в отличие от оригинальной, содержала дополнительные масс-спектры генетически охарактеризованных изолятов SIG. Способом прямого нанесения образца на мишень удалось идентифицировать до рода 87,5% изолятов, из них только 2 изолята (8,3%) идентифицированы до вида с высоким критерием достоверности, один из которых идентифицирован как S. schleiferi ssp. coagulans, другой отнесён к S. lugdunensis. Метод предварительной экстракции белков позволил идентифицировать до рода 100% образцов, при этом 50% идентифицированы до вида с низкой степенью достоверности со score от 2 до 2,29. Видовая принадлежность остальных 50% образцов определена с высокой степенью достоверности — значения score составляли 2,3—3 (рис. 4). Большинство изолятов (33,3%) идентифицированы как S. pseudintermedius, 8,3% — S. schleiferi ssp. coagulans, 4,2 — S. intermedius, 4,2% — S. lugdunensis. Результаты идентификации, полученные способом предварительной белковой экстракции, соответствовали данным молекулярной идентификации за исключением одного изолята. Изолят S. pseudintermedius ошибочно идентифицирован как S. lugdunensis при использовании обоих способов подготовки проб.
Сравнительная оценка двух способов пробоподготовки выявила необходимость использования метода предварительной экстракции белков с добавлением муравьиной кислоты и ацетонитрила. Даже применение этого способа подготовки проб может привести не только к ошибочной дифференциации внутри группы КПС, но к идентификации некоторых коагулазоположительных видов, как КОС.
Обсуждение. В последнее десятилетие для дифференциации КПС предложено большое количество генетических мише-
Score
87,5% —/8 3%\ 2,300-3,000
2,000-2,299
4,2% \ 1.999-1,700
/ 12,5% \ <1,700
Метод прямого нанесения Метод предварительной
образца на мишень экстракции белков
Рис. 4. Идентификация изучаемых стафилококков методом MALDI—TOF-MS с использованием внутрилабораторной базы данных масс-спектров.
ней, эффективность которых так и не подтвердилась. Секвени-рование гена 16S рДНК позволяет идентифицировать только 2% представителей рода Staphylococcus из-за высокой степени гомологии нуклеотидных последовательностей этого гена среди различных видов стафилококка [28]. Секвенирование некоторых генов домашнего хозяйства по отдельности (hsp60, tuf, pta и др.) не позволяет установить видовую принадлежность всех видов КПС по той же причине [9; 25]. Исследования по изучению возможности использования других генетических мишеней (gap, nuc, kat и др.) либо выполнены на ограниченной выборке, в том числе изолятов SIG, либо не включали всех видов КПС [26, 29]. По результатам данной работы удалось установить, что оба исследованных гена: nuc и katA являются эффективными мишенями для идентификации КПС и их дифференциации от прочих видов стафилококка. Метод М-ПЦР для идентификации структурных различий nuc гена обладает высокой дифференцирующей способностью (97%), легко воспроизводим, позволяет получать надёжные результаты в короткие сроки. ПДРФ-анализ katA гена с помощью эндонуклеазы TaqI наиболее эффективный для дифференциации представителей группы S. intermedius и других КПС, он позволяет безошибочно идентифицировать 100% изолятов, однако является более трудоёмким по сравнению с М-ПЦР. Оба метода могут быть рекомендованы для использования в клинических и научных лабораториях при диагностике стафилококковой инфекции.
Невысокая результативность способа прямого нанесения на мишень и невозможность использования стандартной базы данных масс-спектрометра MALDI Biotyper (версия 3.0, Bruker Daltonics, Германия) для идентификации микроорганизмов группы SIG подтверждены результатами других учёных, проводивших подобные исследования [30].
Накопленные данные о формировании множественной антибиотикорезистентности и приобретении детерминант па-тогенности представителями sIG, эпидемическое распространение определённых клонов S. pseudintermedius на территории целого ряда европейских государств и стран Северной Америки, способность вызывать заболевания не только у широкого круга млекопитающих, но и человека, делают неотложной необходимость внедрять молекулярно-генетические методы видовой идентификации КПС в работу бактериологических лабораторий. Особенно важно их использовать в случае выделения от пациентов нетипичных S. aureus от больных, страдающих вторичными иммунодефицитами и имеющих в анамнезе контакт с животными-компаньонами.
Выводы. 1. Точная идентификация каогулазоположитель-ных видов стафилококков и их дифференциация от прочих видов возможна только при обязательном использовании молекулярно-генетических методов диагностики. Эффективными генетическими мишенями являются гены термонукле-азы (nuc) и каталазы (kat), которые позволяют дифференцировать 97—100% изолятов.
MICROBIOLOGY
2. Для повышения качества идентификации представителей SIG методом MALDI-ToF MS необходимо пополнение оригинальной базы данных прибора дополнительными масс-спектрами микроорганизмов SIG, выделенных на различных географических территориях и использование при пробопод-готовке способа предварительной белковой экстракции.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА (пп. 1—9, 11—18, 22—26, 28—30 см. REFERENCES)
10. Дмитренко О.А., Балбуцкая А.А., Скворцов В.Н. Особенности экологии, патогенные свойства и роль представителей группы Staphylococcus intermedius в инфекционной патологии животных и человека.
Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2016; 34(3): 4—11.
19. Воробьёва О.Н., Денисенко Л.И., Жилина Н.М. Этиология гнойно-септических процессов у ожоговых больных. Бюллетень СО РАМН. 2010; 30 (6): 57—63.
20. Акопова И.С., Коленчукова О.А. Науки о человеке: Некоторые особенности внутрибольничных штаммов микроорганизмов рода Staphylococcus. Томск: СГМУ; 2002: 4—5.
21. Гордина Е.М., Горовиц Э.С., Поспелова С.В., Афанасьевская Е.В. Видовой спектр и биологические свойства стафилококков, изолированных от птиц, в условиях крупной птицефабрики. Медицинский альманах. 2014; 2(32): 84—7.
27. Дмитренко О.А., Шагинян И.А., Гинцбург А.Л. Исследование полиморфизма mec ДНК у метициллинрезистетных штаммов золотистого стафилококка, выделенных в стационарах разных регионов России. Молекулярная генетика, микробиология, и вирусология. 2005; 3: 11—7.
REFERENCES
1. Lowy F.D. Staphylococcus aureus infections. N. Engl. J. Med. 1998; 339: 520—32.
2. Grundmann H., Aanensen D.M., van den Wijngaard C.C., Spratt B.G., Harmsen D., Friedrich A.W. et al. Geographic distribution of Staphylococcus aureus causing invasive infections in Europe: a molecular-epidemiological analysis. PLoSMed. 2010; 7(1): e1000215.
3. Hajek V. Staphylococcus intermedius, a new species isolated from animals. Int. J. Syst. Bacteriol. 1976; 26(4): 401—8.
4. Varaldo P.E., Kilpper-Baelz R., Biavasco F., Satta G., Schleifer K. Staphylococcus delphini sp. nov., a coagulase-positive species isolated from dolphins. Int. J. of Syst. Bact. 1988; 38: 436—9.
5. Devriese L.A., HajekV., Oeding P., Meyer S.A., Schleifer K.H. Staphylococcus hyicus comb. nov. and Staphylococcus hyicus subsp. chromogenes subsp. nov. Intern. J. Syst. Bacteriol. 1978; 28: 482—90.
6. Igimi S., Takahashi E., Mitsuoka T. Staphylococcus schleiferi subsp. coagulans subsp. nov., isolated from the external auditory meatus of dogs with external ear otitis. Int. J. Syst. Bacteriol. 1990; 40: 409—11.
7. Devriese L.A., Vancanneyt M., Baele M., Vaneechoutte M., De Graef E., Snauwaert C. et al. Staphylococcus pseudintermedius sp. nov., a coagulase-positive species from animals. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005; 55: 1569—73.
8. Foster G., Ross H.M., Hutson R.A., Collins M.D. Staphylococcus lutrae sp. nov., a new coagulase-positive species isolated from otters. Int. J. Syst. Bacteriol. 1997; 65: 1571—8.
9. Sasaki T., Takahashi N., Kamata S., Hiramatsu K. Reclassification of phenotypically identified Staphylococcus intermedius strains. J. Clin. Microbiol. 2007; 45(9): 2770—8.
10. Dmitrenko O.A., Balbutskaya A.A., Skvortsov V.N. Ecological features, pathogenic properties, and role of Staphylococcus intermedius group representatives in animal and human infectious pathology. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya. 2016; 34(3): 4—11. (in Russian)
11. Starlander G., Börjesson S., Grönlund-Andersson U., Tellgren-Roth C., Melhus A. Cluster of infections caused by methicillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius in humans in a tertiary hospital. J. Clin. Microbiol. 2014; 52(8): 3118—20.
12. Durdik P., Fedor M., Jesenak M., Hamzikova J., Knotkova H., Banovcin P. Staphylococcus intermedius — rare pathogen of acute meningitis. Int. J. Infect. Dis. 2010; 14: 236—8.
13. Kelesidis T., Tsiodras S. Staphylococcus intermedius is not only a zoonot-
100%
КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА. 2017; 62(8) DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2017-63-8-502-506
МИКРОБИОЛОГИЯ
ic pathogen, but may also cause skin abscesses in humans after exposure to saliva. Int. J. Infect. Dis. 2010; 14: 838—41.
14. Somayaji R., Priyantha M.A., Rubin J.E., Church D. Human infections due to Staphylococcus pseudintermedius, an emerging zoonosis of canine origin: report of 24 cases. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2016; 85(4): 471—6.
15. Guardabassi L., Loeber M.E., Jacobson A. Transmission of multiple antimicrobial-resistant Staphylococcus intermedius between dogs affected by deep pyoderma and their owners. Veterinary Microbiology. 2004; 98: 23—7.
16. Khambarty EM., Bennett R.W., Shah D.B. Application of pulsed-gel electrophoresis to the epidemiological characterization of Staphylococ-cus intermedius implicated in a food-related outbreak. Epidemiol. Infect. 1994; 113: 75—81.
17. Martins P.D., de Almeida T.T., Basso A.P., de Moura T.M., Frazzon J., Tondo E.C. et al. Coagulase-positive staphylococci isolated from chicken meat: pathogenic potential and vancomycin resistance. Foodborne Pat-hog. Dis. 2013; 10: 771—6.
18. Al-Tarazi Y.H., Albetar M.A., Alaboudi A.R. Biotyping and enterotoxige-nicity of staphylococci isolated from fresh and frozen meat marketed in Jordan. Food Research International. 2009; 42: 374—9.
19. Vorob'eva O.N., Denisenko L.I., Zhilina N.M. The etiology of septic processes in burn patients. Byulleten' SO RAMN. 2010; 30(6): 57—63. (in Russian)
20. Akopova I.S., Kolenchukova O.A. Science of man: Some features of nosocomial microorganism strains of the Staphylococcus genus [Nauki o cheloveke: Nekotorye osobennosti vnutribol'nichnykh shtammov micro-organizmov roda Staphylococcus]. Tomsk: SGMU; 2002. (in Russian)
21. Gordina E.M., Gorovits E.S., Pospelova S.V., Afanasevskaya E.V. Species spectrum and biological properties of staphylococci isolated from birds in a large poultry farm. Meditsinskiy almanakh. 2014; 2(32): 84—7 (in Russian)
22. Ben Zakour N.L., Beatson S.A., van den Broek A.H., Thoday K.L., Fitzgerald J.R. Comparative genomic study of the Staphylococcus intermedius group of animal pathogens. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2012; 2: 1—15.
23. Perreten V., Kadlec K., Schwarz S., Gronlund Andersson U., Finn M.,
Greko C. et al. Clonal spread of methicillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius in Europe and North America: an international multicentre study. J. Antimicrob. Chemother. 2010; 65(5): 1145—54.
24. Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated From Animals; Approved Standard - Third Edition. CLSI document M31-A3. 2010; 28(8).
25. Sasaki T., Tsubakishita S., Tanaka Y., Sakusabe A., Ohtsuka M., Hirotaki S. Multiplex-PCR method for species identification of coagulase-positive staphylococcoci. J. Clin. Microbiol. 2010; 48(3): 765—9.
26. Blaiotta G., Fusco V., Ercolini D., Pepe O., Coppola S. Diversity of Staphylococcus species strains based on partial kat (catalase) gene sequences and design of a PCR-restriction fragment length polymorphism assay for identification and differentiation of coagulase-positive species (S. aureus, S. delphini, S. hyicus, S. intermedius, S. pseudintermedius, and S. schleiferi subsp. coagulans). J. Clin. Microbiol. 2010; 48(1): 192—201.
27. Dmitrenko O.A., Shaginyan I.A., Gintsburg A.L. Study of mec DNA polymorphism in methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains isolated in hospitals of different Russian regions. Moleculyarnaya Genetika, Mikrobi-ologiya, i Virusologiya. 2005; 3: 11—7. (in Russian)
28. Woo P.C., Teng J.L., Wu J.K., Leung F.P., Tse H., Fung A.M. et al. Guidelines for interpretation of 16S rRNA gene sequence-based results for identification of medically important aerobic Gram-positive bacteria. J. Med. Microbiol. 2009; 58(8): 1030—6.
29. Yugueros J., Temprano A., Berzal B., Sanchez M., Hernanz C., Luengo J.M. et al. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase-encoding gene as a useful taxonomic tool for Staphylococcus spp. J. Clin. Microbiol. 2000; 38(12): 4351—5.
30. Murugaiyan J., Walther B., Stamm I., Abou-Elnaga Y., Brueggemann-Schwarze S., Vincze S. et al. Species differentiation within the Staphylococcus intermedius group using a refined MALDI-ToF MS database. Clin. Microbiol. Infect. 2014; 20(10): 1007—15.
Поступила 28.03.17 Принята к печати 03.04.17
© КОЛЛЕКТИв АвТОРОв, 2017 УДК 615.33:579.871.1].015.8
Харсеева Г.Г.1, Боронина Н.А.1, Гасретова Т.Д.1, Тюкавкина С.Ю.1, Сылка О.И. 1, Миронов А.Ю.2
чувствительность к антибиотикам штаммов corynebacterium non diphtheriae, выделенных в стационарах ростова-на-дону и ростовской области
1 ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет», 344022, Ростов-на-Дону;
2 ФБУН Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, 125212, Москва
Цель работы — изучение чувствительности к антибактериальным препаратам различных видов Corynebacterium non diphtheriae. Штаммы C. non diphtheriae выделены от больных с патологией респираторного и урогенитального тракта, а также люлей, проходивших профилактическое обследование. Чувствительность к антибактериальным препаратам определяли методом серийных разведений в жидкой питательной среде на основании значений минимальной подавляющей концентрации (мг/л). Установлено, что наиболее эффективными антибактериальными препаратами в отношении штаммов C. non diphtheriae, в целом оказались ванкомицин, цефазолин и цефотаксим, а отдельных видов — C. pseudo-diphtheriticum — цефазолин, цефотаксим, гентамицин; C. pseudotuberculosis — ванкомицин, цефазолин, цефотаксим, гентамицин; C. xerosis — цефотаксим; C. .striatum — цефазолин и рифампицин. Наименьшую эффективность проявили для штаммов C. non diphtheriae, в целом бензилпенициллин и линкомицин, а отдельных видов - C. pseudodiphtheriticum и C. pseudotuberculosis — линкомицин и эритромицин; C. xerosis и C. striatum — бензилпенициллин, линкомицин и эритромицин. В качестве препаратов выбора в отношении различных видов C. non diphtheriae можно рекомендовать цефалоспорины (цефотаксим и цефазолин), резервных препаратов — гентамицин и ванкомицин.
Ключевые слова: Corynebacterium non diphtheriae; антибиотикочувствительность; количество чувствительных и резистентных штаммов.
Для цитирования: Харсеева Г.Г., ВоронинаН.А., Гасретова Т.Д., Тюкавкина С.Ю., Сылка О.И., Миронов А.Ю. Чувствительность к антибиотикам штаммов Corynebacterium non diphtheriae, выделенных в стационарах Ростова-на-Дону и Ростовской области. Клиническая лабораторная диагностика. 2017;62 (8): 502-506. DOI: http://dx.doi. org/10.18821/0869-2084-2017-62-8-502-506
Для корреспонденции: Харсеева Галина Георгиевна, д-р мед. наук, проф., зав.каф. микробиологии и вирусологии № 2 ГБОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет»; e-mail: [email protected]
