CC BY
50
сотрудник лаборатории микробиома человека научный сотрудник лаборатории микробиома человека
СОВРЕМЕН В ИЗУЧЕНИИ
DOI: 10.17691/stm2019. УДК 579.841/.842:615
Поступила 23.10 '/// //
И.В. Белова, к м...., .......
^средств его коррекц^и;/^^ А.Г. Точилина, к.б.н., старший нау и средств его коррекции1;
О.В. Ковалишена, д.м.н., профессор, зав. кафедрой эпидемиологии, микробиологии и доказательной медицины2;
И.Ю. Широкова, к.м.н., руководитель отдела лабораторных исследований И профилактической медицины Университетской клиники2;
еляева, к.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории микробиологии1; Л.Ю. Послова, к.м.н., старший преподаватель кафедры эпидемиологии, микробиологии и доказательной медицины2; Г.Б. Ермолина, к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории микробиологии1; И.В. Соловьева, д.б.н., ведущий научный сотрудник, зав. лабораторией микробиома человека и средств его коррекции1
1Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора, ул. Малая Ямская, 71, Н. Новгород, 603950;
2Приволжский исследовательский медицинский университет, пл. Минина и Пожарского, 10/1, Н. Новгород, 603005
Цель исследования — оценить эффективность применения комплекса молекулярно-генетических методов: ПЦР, RAPD и MLST — с использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии в изучении особенностей госпитальных штаммов.
Материалы и методы. Проведена идентификация 23 штаммов K. pneumoniae, выделенных в педиатрическом стационаре, с использованием MALDI-TOF масс-спектрометра Autoflex и программно-аппаратного комплекса MALDI Biotyper (Bruker Daltonics, Германия). Чувствительность к антибиотикам исследовали на автоматическом бактериологическом анализаторе Phoenix-100 (Bec-ton Dickinson, США) с помощью хромогенных питательных сред ф. HiMedia (Индия). Поиск детерминант резистентности и молекулярное типирование штаммов проводили с использованием методов ПЦР, RAPD и MLST.
Результаты. Все исследуемые штаммы были идентифицированы как K. pneumoniae ssp. pneumoniae. Изучение чувствительности к антибиотикам позволило выделить три группы: 1-я группа (n=15) — чувствительные штаммы (wt); 2-я группа (n=7) — потенциальные производители карбапенемазы; 3-я группа (n=1) — производители бета-лактамаз расширенного спектра. У представителей 1-й и 2-й групп детерминант резистентности не выявлено, а у штамма из 3-й группы обнаружены бета-лактамазы blaSHV и blac1x-M. Были установлены RAPD-тип данного штамма, капсульный тип (К-23) и принадлежность его к 17-му сиквенс-типу. Штаммы с данным сиквенс-типом выделяются на территории Российской Федерации крайне редко, однако известны в Европе, США и странах Азии. Они связаны с тяжелыми и летальными патологиями человека и обладают высоким эпидемическим потенциалом.
Заключение. Применение комплекса современных технологий для изучения фенотипических и генотипических свойств микроорганизмов позволило выделить и охарактеризовать госпитальный штамм K. pneumoniae, обладающий антибиотикорезистентно-стью, которая обусловлена наличием бета-лактамаз blac1x-M-15 и blaSHV-11, и представляющий опасность в плане трансмиссивного распространения детерминант резистентности.
Ключевые слова: K. pneumoniae; сиквенс-тип ST-17; антибиотикорезистентность, MLST; RAPD; ПЦР; MALDI-TOF спектроскопия.
Как цитировать: Belova I.V., Tochilina А^., Kovalishena O.V., Shirokova I.Y., Belyaeva E.V., Poslova L.Y., Ermolina G.B., Solovyeva I.V. Current molecular genetic technologies to study hospital strains. Sovremennye tehnologii v medicine 2019; 11(4): 126-134, https://doi.org/10.17691/stm2019.11A15
Для контактов: Точилина Анна Георгиевна, e-mail: lab-lb@yandex.ru
Current Molecular Genetic Technologies to Study Hospital Strains
I.V. Belova, PhD, Leading Researcher, Laboratory of Human Microbiome and Means for Its Correction1;
А.G. Tochilina, PhD, Senior Researcher, Laboratory of Human Microbiome and Means for Its Correction1;
0.V. Kovalishena, DSc, Professor, Head of Department of Epidemiology, Microbiology
and Evidence-Based Medicine2;
1.Y. Shirokova, PhD, Head of Laboratory Research, Research Institute of Preventive Medicine
of University Clinic2;
Е.V. Belyaeva, PhD, Leading Researcher, Laboratory of Microbiology1;
L.Y. Poslova, PhD, Senior Lecturer, Department of Epidemiology, Microbiology and Evidence-Based Medicine2;
G.B. Ermolina, PhD, Senior Researcher, Laboratory of Microbiology1;
I.V. Solovyeva, DSc, Leading Researcher, Head of Laboratory of Human Microbiome and Means for Its Correction1
1Blokhina Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology of Nizhny Novgorod,
Russian Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing (Rospotrebnadzor),
71 Malaya Yamskaya St., Nizhny Novgorod, 603950, Russia;
2Privolozhsky Research Medical University, 10/1 Minin and Pozharsky Square, Nizhny Novgorod, 603005, Russia
The aim of the study was to assess the efficiency of a complex of molecular genetic techniques: PCR, RAPD, and MLST using MALDI-TOF mass-spectrometry to study the characteristics of hospital strains.
Materials and Methods. We identified 23 strains of K. pneumoniae isolated in a pediatric hospital using MALDI-TOF mass-spectrometer Autoflex and MALDI Biotyper software (Bruker Daltonics, Germany). Antibiotic sensitivity was analyzed by means of an automatic bacteriological analyzer Phoenix-100 (Becton Dickinson, USA) using chromogenic culture media (HiMedia, India). The search for resistance determinants and molecular typing were performed using PCR, RAPD, and MLST.
Results. All the strains were identified as K. pneumoniae ssp. pneumoniae. According to antibiotic sensitivity, three groups were distinguished: group 1 (n=15) — sensitive strains (wt); group 2 (n=7) — potential carbapenemase-producers; group 3 (n=1) — extended-spectrum beta-lactamase producers. No resistance determinants were found in groups 1 and 2; beta-lactamases blaSHV and biaCTX-M were revealed in group 3 strain. We identified RAPD-type of the strain, a capsule type (K-23), it belonging to the sequence type 17. Strains with this sequence type are rarely isolated in Russia, however, they are known in Europe, USA, and Asian countries, they being associated with lethal human pathologies and a high epidemic potential.
Conclusion. The use of a complex of current techniques to study the phenotypic and genotypic properties of microorganisms enabled to isolate and characterize a hospital strain K. pneumoniae, which is antibiotic-resistant due to the presence of beta-lactamases: blaCTX-M-15 and blaSHV-11, and it being dangerous in terms of resistance determinants transmission.
Key words: K. pneumoniae; sequence-type ST-17; antibiotic resistance; MLST; RAPD; PCR; MALDI-TOF spectroscopy.
English
Введение
Klebsiella pneumoniae — широко распространенный в природе представитель семейства Enterobacteriaceae, встречается в почве, поверхностных водах, на листьях растений, а также колонизирует слизистые оболочки млекопитающих, в том числе человека. В Российской Федерации, как и во всем мире, K. pneumoniae является клинически значимым госпитальным патогеном и вызывает широкий спектр патологий [1, 2].
Вспышечная заболеваемость, обусловленная этим микроорганизмом, регистрируется как в педиатрических стационарах, преимущественно в неонатальной реанимации и неонатологии, так и в стационарах хирургического и ортопедического профиля [3-5].
Выраженный патогенный потенциал K. pneumoniae обусловлен особенностями строения клетки: наличием липополисахаридной капсулы, которая препят-
ствует фагоцитозу и работе системы комплемента макроорганизма, и фимбрий нескольких типов, обеспечивающих успешную инвазию и образование биопленок. Микроорганизм продуцирует энтеротоксины и ряд ферментов — нейраминидазу, ДНК-азу, фос-фатазу и сидерофоры (энтеробактин, аэробактин и др.), которые позволяют бактерии усваивать железо из клеток хозяина, повышая тем самым ее патогенный потенциал [6].
K. pneumoniae входят в группу антибиотико-устойчивых патогенов ESKAPE (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa и Enterobacter spp.). По данным научной литературы, большинство госпитальных штаммов K. pneumoniae являются продуцентами бета-лактамаз расширенного спектра (БЛРС) и часто — карбапенемаз, расположенных на конъюгативных плазмидах, т.е. ферментов, с которыми связывают высокие темпы распространения
антибиотикорезистентности в мире [7]. Данные штаммы зачастую обладают сочетанной устойчивостью к карбапенемам и цефалоспоринам, что в ряде случаев может требовать пересмотра стандартных схем антимикробной терапии и включения в них антибиотиков резерва [8].
Изучение и мониторинг штаммов K. pneumoniae — важные направления исследований и в России, и за рубежом [9-13]. Одним из методов точной видовой идентификации микроорганизмов в последнее время является MALDI-TOF масс-спектрометрия [14], причем некоторые зарубежные исследователи предлагают использовать этот метод и для скрининга штаммов, несущих карбапенемазу blaKPC (K. pneumoniae Carbapenemase — KPC), при наличии которой в масс-спектре регистрируется пик массой 11,109 Да. Данный пик связан с наличием белка p019, ген которого входит в состав транспозона Тп4401а, а он в 97,8% случаев представлен у КРС-положительных K. pneumoniae [15, 16]. Взаимосвязь данного пика с наличием blaKPC признана статистически достоверной и используется в новом программном продукте, предложенном ф. Bruker Daltonics (Германия) — MALDI Biotyper Subtyping Module [17].
Для изучения чувствительности бактерий к антибиотикам используются современные хромогенные среды и автоматические бактериологические анализаторы, а для детекции генетических детерминант применяют тест-системы на основе ПЦР [18, 19]. Наиболее распространенными детерминантами бета-лактамаз K. pneumoniae в России на данный момент являются гены СТХ-М, TEM, SHV, OXA-48 и их сочетания [2, 13, 20-22].
Для типирования клинически значимых штаммов бактерий используют электрофорез в переменном поле (pulsed-field gel electrophoresis — PFGE), анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (restriction fragment length polymorphism — RFLP), а также методы амплификации нуклеиновых кислот: анализ полиморфизма амплифицированных фрагментов ДНК (random amplification of polymorphic DNA — RAPD), ПЦР межгенных повторов (enterobacterial repetitive intergenic consensus — ERIC-PCR) [21].
Для рутинного мониторинга за циркулирующими штаммами используют методы PFGE и RAPD. Метод PFGE признан «золотым стандартом» эпидемиологии, однако он относительно сложен в использовании и трудоемок. Среди преимуществ метода RAPD — доступность, методическая простота и короткий срок получения результата [23]. Этот метод успешно применяется и для типирования клинических штаммов K. pneumoniae [24-27].
Сделать заключительный вывод о патогенном потенциале, оценить клиническую роль и эпидемическую значимость изолята позволяет метод мультило-кусного сиквенс-типирования (MLST), основанный на анализе нуклеотидных последовательностей генов «домашнего хозяйства». Он позволяет определить си-
квенс-тип штамма и его клональную принадлежность, используя глобальные базы данных, сравнить исследуемый изолят со штаммами из различных регионов мира и изучить их взаимосвязь [13, 28, 29].
Цель исследования — выявление особенностей госпитальных штаммов K. pneumoniae с использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии и комплекса моле-кулярно-генетических методов — ПЦР RAPD и MLST.
Материалы и методы
Исследованы 23 штамма K. pneumoniae, выделенные из биологического материала больных инфекциями, связанными с оказанием медицинской помощи, и объектов внешней среды (смывы с оборудования) в период эпидемического неблагополучия в педиатрическом стационаре. Все пробы были получены в августе — сентябре 2015 г
Идентификацию штаммов проводили с помощью времяпролетного MALDI-TOF масс-спектрометра Autoflex и программно-аппаратного комплекса MALDI Biotyper (Bruker Daltonics, Германия). Пробоподготовку суточных культур исследуемых микроорганизмов выполняли методом прямого нанесения культуры по стандартному протоколу, представленному в руководстве пользователя. Идентификацию, запись, обработку и анализ масс-спектров проводили с помощью программно-аппаратного комплекса MALDI Biotyper.
Для выявления штаммов, продуцирующих БЛРС и обладающих сниженной чувствительностью к карба-пенемам, использовали хромогенные среды М1829 HiCrome ESBL Agar Base и M1831 HiCrome KPC Agar Base производства HiMedia (Индия), высевы проводили в трех повторностях.
Чувствительность штаммов к антибиотикам определяли с использованием автоматического бактериологического анализатора Phoenix-100 (Becton Dickinson, США) и комбинированных ID/AST-панелей. При характеристике микроорганизмов применяли общепринятые показатели — «чувствительные», «умеренно резистентные» и «резистентные» штаммы, при учете и интерпретации результатов руководствовались стандартом EUCAST [30].
Выделение суммарной ДНК для последующей детекции генов бета-лактамаз проводили с использованием набора «ДНК-экспресс» («Литех», Россия). Детекцию генов blaTEM и blaSHV осуществляли методом ПЦР со специфичными праймерами [31, 32], а детерминант blacTx-м, blaKpc, blaoxA-48, Ь1аШм, bla^p и blaVIM — с использованием коммерческих тест-систем ф. «Литех». ПЦР выполняли на амплифика-торе «Терцик» («ДНК-технология», Россия). RAPD-типирование проводили с использованием праймеров, указанных в научной литературе [26].
Полногеномное секвенирование осуществляли на платформе MiSeq (Illumina, США), сборку конти-гов проводили с помощью сборщика генома SPAdes v. 3.11.1 (СПбАУ РАН им. Ж.И. Алфёрова, Россия), а
аннотацию полученных контигов — с использованием программного обеспечения Prokka v. 1.12 [33].
С применением данных полногеномного секвениро-вания и биоинформатического сервиса, доступного онлайн на сайте Института Пастера (Франция) — http:// bigsdb.pasteur.fr, были определены геноварианты бе-та-лактамаз и их локализация, капсульный тип штамма (К-тип) и его сиквенс-тип. Для установления К-типа анализировали нуклеотидную последовательность гена wzi, кодирующего белок лектин, ответственный за прикрепление капсулы к внешней мембране клетки. Аллели этого гена строго ассоциированы с капсульны-ми типами штаммов [34].
MLST осуществляли согласно схеме, основанной на анализе последовательности 7 генов «домашнего хозяйства» [28].
Результаты
В ходе работы все штаммы были идентифицированы как K. pneumoniae ssp. pneumoniae, при этом значения коэффициента совпадения Score составили 2,1 и более, что говорит о точной видовой идентифика-
ции. При анализе полученных масс-спектров и масс-листов пиков-маркеров blaKPC, соответствующих размеру 11,109 Да, не выявлено (рис. 1).
При исследовании штаммов на наличие БЛРС и сниженную чувствительность к карбапенемам был отмечен рост одного штамма — K. pneumoniae 1013 на среде М1829 HiCrome ESBL Agar Base. На плотной питательной среде наблюдали крупные слизистые колонии серо-голубого цвета, которые, согласно инструкции, и характерны для штаммов, продуцирующих БЛРС (рис. 2). Штаммов со сниженной чувствительностью к карбапенемам с использованием хромогенных сред не выявлено.
Параллельно проводили изучение профилей анти-биотикочувствительности всех исследуемых штаммов с использованием бактериологического анализатора Phoenix-100. Всего выделено три фенотипические группы.
В 1-ю группу вошли 15 штаммов K. pneumoniae, которые были чувствительны ко всем антибиотикам семейства цефалоспоринов и карбапенемам, устойчивы к ампициллину и умеренно чувствительны к одному из «защищенных» пенициллинов (пиперациллин/
Рис. 1. Масс-спектры исследуемых штаммов K. pneumoniae
На оси абсцисс показано отношение массы иона к его заряду (m/z), на оси ординат — интенсивность сигнала (Intens.)
Рис. 2. Рост штамма K. pneumoniae 1013 на питательной среде HiCrome ESBL Agar Base (М1829; HiMedia, Индия)
5 °
Характеристика госпитальных штаммов К. pneumoniae
«
ä
INJ 2
-
I
g
S
s» 01
i
S >
I
s T
P
P
£ со
I I
i X
su
s
b =
s
I
ЯГ §
p
ra I
s» -
со
„
r—1
Чувствительность к антибиотикам, МПК/интерпретация
Изоляты
Фенотип антибиотико-
Рост
Наличие
Наличие MS-пика
Agar Base
СТХ-М-15
RAPD-
Am Azt Aug Cf Cpe Cfx Caz Cax Crm Imp Etp резистентности средах резистентности 11,109 Да тип
K. pneumoniae 828 >16/R <2/S <4/2/S 8/S <1/S <4/S <1/S <1/S <4/S <1/S <0,25/S wt Нет Нет Нет I
K. pneumoniae 829 >16/R <2/S <4/2/S 8/S <1/S <4/S <1/S <1/S <4/S <1/S <0,25/S wt Нет Нет Нет I
K. pneumoniae 830 >16/R <2/S <4/2/S 8/S <1/S <4/S <1/S <1/S <4/S <1/S <0,25/S wt Нет Нет Нет I
K. pneumoniae 832 >16/R <2/S <4/2/S 8/S <1/S <4/S <1/S <1/S <4/S <1/S <0,25/S wt Нет Нет Нет I
K. pneumoniae 833 >16/R <2/S <4/2/S 8/S <1/S <4/S <1/S <1/S <4/S <1/S <0,25/S wt Нет Нет Нет I
K. pneumoniae 834 >16/R <2/S <4/2/S 8/S <1/S <4/S <1/S <1/S <4/S <1/S <0,25/S wt Нет Нет Нет I
K. pneumoniae 835 >16/R <2/S <4/2/S 8/S <1/S <4/S <1/S <1/S <4/S <1/S <0,25/S wt Нет Нет Нет I
K. pneumoniae 836 >16/R <2/S <4/2/S 8/S <1/S <4/S <1/S <1/S <4/S <1/S <0,25/S wt Нет Нет Нет I
K. pneumoniae 837 >16/R <2/S <4/2/S 8/S <1/S <4/S <1/S <1/S <4/S <1/S <0,25/S wt Нет Нет Нет I
K. pneumoniae 838 >16/R <2/S <4/2/S 8/S <1/S <4/S <1/S <1/S <4/S <1/S <0,25/S wt Нет Нет Нет I
K. pneumoniae 841 >16/R <2/S <4/2/S 8/S <1/S <4/S <1/S <1/S <4/S <1/S <0,25/S wt Нет Нет Нет I
K. pneumoniae 842 >16/R <2/S <4/2/S 8/S <1/S <4/S <1/S <1/S <4/S <1/S <0,25/S wt Нет Нет Нет I
K. pneumoniae 843 >16/R <2/S <4/2/S 8/S <1/S <4/S <1/S <1/S <4/S <1/S <0,25/S wt Нет Нет Нет I
K. pneumoniae 844 >16/R <2/S <4/2/S 8/S <1/S <4/S <1/S <1/S <4/S <1/S <0,25/S wt Нет Нет Нет I
K. pneumoniae 846 >16/R <2/S <4/2/S 8/S <1/S <4/S <1/S <1/S <4/S <1/S <0,25/S wt Нет Нет Нет I
K. pneumoniae 840 >16/R <2/S <4/2/S 8/S <1/S <4/S <1/S <1/S <4/S 2/I <0,25/S carb Нет Нет Нет II
K. pneumoniae 845 >16/R <2/S <4/2/S 8/S <1/S <4/S <1/S <1/S <4/S 2/I <0,25/S carb Нет Нет Нет II
K. pneumoniae 850 >16/R <2/S <4/2/S 8/S <1/S <4/S <1/S <1/S <4/S 2/I <0,25/S carb Нет Нет Нет II
K. pneumoniae 852 >16/R <2/S <4/2/S 8/S <1/S <4/S <1/S <1/S <4/S 2/I <0,25/S carb Нет Нет Нет II
K. pneumoniae 853 >16/R <2/S <4/2/S 8/S <1/S <4/S <1/S <1/S <4/S 2/I <0,25/S carb Нет Нет Нет II
K. pneumoniae 863 >16/R <2/S <4/2/S 8/S <1/S <4/S <1/S <1/S <4/S 2/I <0,25/S carb Нет Нет Нет II
K. pneumoniae 893 >16/R <2/S <4/2/S 8/S <1/S <4/S <1/S <1/S <4/S 2/I <0,25/S carb Нет Нет Нет II
K. pneumoniae 1013 >16/R >16/R 20/8/R >16/R >16/R <4/S >16/R >32/R >16/R <1/S <0,25/S ESBL ESBL SHV-11 Нет III
£ S Œ S X. H
n T.
s
H
я -s
s
>
о
*
H ΠS se
Здесь: МПК — минимальная подавляющая концентрация. Am — ампициллин; Azt — азтреонам; Aug — амоксиклав; Cf — цефалотин; Сре — цефепим; Cfx — це-фокситин; Caz — цефтазидим; Сах — цефтриаксон; Crm — цефуроксим; Imp — имипенем; Etp — эртапенем. wt — «дикий тип» по фенотипу антибиотикорезистент-ности; carb — потенциальные производители карбапенемазы; ESBL — продуцент БЛРС. S — чувствительный; I — частично резистентный; R — резистентный.
тазобактам). Штаммы, входящие в эту группу, были отнесены к «дикому типу» — wt (см. таблицу).
Ко 2-й группе — потенциальные производители карбапенемазы — отнесено 7 штаммов, устойчивых к ампициллину и обладающих умеренной резистентностью к имипенему.
В 3-ю группу вошел один штамм — K. pneumoniae 1013, отличающийся устойчивостью ко всем антибиотикам цефалоспоринового ряда, за исключением це-фокситина, и сульфаниламидам (триметоприм/суль-фометаксазол), т.е. может быть отнесен к штаммам, обладающим БЛРС.
У представителей 1-й и 2-й групп детерминант резистентности с использованием ПЦР не выявлено, а у штамма K. pneumoniae ssp. pneumoniae 23 обнаружены бета-лактамазы двух классов — blaSHV и ЫаСТХ-м.
Генотипирование исследуемой выборки штаммов с использованием метода RAPD позволило объединить анализируемые изоляты в три типа в соответствии с присущими штаммам электрофоретическими паттернами и фенотипом антибиотикорезистентности (рис. 3).
Анализ данных полногеномного секвенирования штамма K. pneumoniae ssp. pneumoniae 1013 позволил идентифицировать выявленные ранее бета-лакта-мазы как blaSHv-n и Ь1аСТХ-М-15; установить, что первая имеет хромосомную локализацию, а ЫаСТХМ-15 расположена на плазмиде; определить принадлежность штамма к капсульному типу К-23 и провести MLST-анализ. В ходе проведения MLST-анализа штамма были определены аллельные профили 7 генов «домашнего хозяйства»: глицеральдегид-3-фосфатде-гидрогеназы (gapA), фактора инициации трансляции IF-2 (infB), малат дегидрогеназы (mdh), глюкозо-6-фос-фатизомеразы (pgi), фосфорина Е (phoE), бета-субъе-диницы РНК полимеразы (rpoB), периплазматического трансдуктора энергии (tonB) — и определена принадлежность штамма к 17-му сиквенс-типу.
Таким образом, госпитальный штамм, обладающий широким спектром антибиотикорезистентности, был идентифицирован как K. pneumoniae ssp. pneumoniae 1013 ST-17K-23.
I тип wt Потенциальные производители карбапенемазы БЛРС
II тип III тип
SiS S!9 837 863 840 845 ИБО 852 S93 SS3 1013
Рис. 3. Электрофореграмма паттернов RAPD-типи-рования госпитальных культур K. pneumoniae ssp. pneumoniae
Обсуждение
Анализ масс-спектров всех исследуемых штаммов позволил идентифицировать их как K. pneumoniae ssp. pneumoniae и не выявил наличия пика, связанного с присутствием Ь1аКРС. Отсутствие карбапене-мазной активности и этой детерминанты у штаммов в дальнейшем подтвердили данные, полученные с использованием хромогенных сред и ПЦР
Изучение профилей антибиотикорезистентности показало, что все K. pneumoniae ssp. pneumoniae устойчивы к ампициллину, что объясняется природной устойчивостью микроорганизма [8, 35]. К антибиотикам других групп большая часть штаммов устойчивости не проявляют и не несут в геноме соответствующих детерминант. В геномах штаммов 2-й группы, проявляющих промежуточную устойчивость к карбапенемам (имипенему), также не обнаружено детерминант резистентности. Это свидетельствует о том, что в данном случае устойчивость может быть результатом реализации других механизмов, например молекулярного эффлюкса.
Штамм K. pneumoniae ssp. pneumoniae 1013, обладающий устойчивостью к цефалоспоринам и феноти-пически характеризуемый как продуцент БЛРС, несет в геноме детерминанты blaSHV-11 и Ь1аСТХМ-15. Согласно классификации K. Bush [36], обе детерминанты относятся к сериновым бета-лактамазам молекулярного класса А, группе 2be. Их наличие и обусловливает устойчивость штамма к защищенным пенициллинам (Амоксиклаву), цефалоспоринам III, IV поколений и монобактамам (азтреонаму).
В научной литературе указано, что ген Ь1аСТХ-М-15 зачастую ассоциирован с плазмидами группы несовместимости IncF, IncL/M и IncA/C и мобильным генетическим элементом ISEcp1 [37]. Это приводит к активному горизонтальному переносу гена в популяции и его распространению. Ген Ь1аСТХ-М-15 изучаемого нами штамма также имеет плазмидную локализацию и опасен в плане трансмиссивного переноса. Обращает на себя внимание отсутствие у изученного штамма бета-лактамаз типа ТЕМ-1, обычно входящих в комплекс с b^SHV-11 и Ь1аСТХ-М-15 [20].
В ходе работы была показана возможность использования метода RAPD при изучении госпитальных штаммов. В нашем случае выделено три RAPD-типа, объединяющих культуры со схожим фенотипом. Поскольку в научной литературе есть данные, указывающие на то, что штаммы, принадлежащие к разным RAPD-типам, имеют и разные сиквенс-типы [26], можно предположить, что в данном случае в стационаре циркулируют три эпидемических клона K. pneumoniae ssp. pneumoniae, один из которых обладает комплексом БЛРС и опасен в плане их трансмиссивного распространения. Это позволило более углубленно изучить свойства данного штамма с использованием полногеномного секвенирования.
Определенный в ходе данной работы капсульный
тип K. pneumoniae ssp. pneumoniae 1013 — К-23 — не характерен для высоковирулентных штаммов и штаммов с гипермукоидным фенотипом [1]. Однако MLST-анализ показал принадлежность штамма к 17-му сиквенс-типу, с которым связывают целый ряд инфекционных патологий человека: бактериемию, инфекции мочевыводящих путей, пневмонию, сепсис. Выявление такого штамма от пациентов с инфекциями, связанными с оказанием медицинской помощи, в условиях эпидемического неблагополучия в педиатрическом стационаре можно рассматривать с эпидемиологической точки зрения как прогностически неблагоприятный признак. В базе данных Института Пастера (Institut Pasteur MLST and whole genome MLST databases, http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html) на момент обращения (25.07.2018) имеется информация о 25 изолятах K. pneumoniae ST-17, выделенных в Eвропе, США и странах Азии, связанных с тяжелыми и летальными патологиями человека и обладающих комплексом БЛРС. K. pneumoniae с данным ^квенс-типом на территории Российской Федерации встречается редко. По данным базы Института Пастера, штамм K. pneumoniae ST-17 был выделен лишь один раз в Mоскве из крови больного с сепсисом и зарегистрирован в базе в 2015 г.
Заключение
Применение современных технологий для изучения фенотипических и генотипических свойств штаммов K. pneumoniae позволило не только выделить, но и наиболее полно охарактеризовать госпитальный штамм, обладающий антибиотикорезистентностью, обусловленной наличием бета-лактамаз — blaСТХ-М-15 и blaSHV-11, который представляет опасность в плане трансмиссивного распространения детерминант резистентности и обусловливает возникновение эпидемического неблагополучия по инфекциям, связанным с оказанием медицинской помощи.
Финансирование исследования. Работа выполнена по государственному заданию №АААА-А16-116040810137-8.
Конфликта интересов нет.
Литература/References
1. Lev A.I., Astashkin E.I., Kislichkina A.A., Solovieva E.V., Kombarova T.I., Korobova O.V., Ershova O.N., Alexandrova I.A., Malikov V.E., Bogun A.G., Borzilov A.I., Volozhantsev N.V., Svetoch E.A., Fursova N.K. Comparative analysis of Klebsiella pneumoniae strains isolated in 2012— 2016 that differ by antibiotic resistance genes and virulence genes profiles. Pathog Glob Health 2018; 112(3): 142-151, https://doi.org/10.1080/20477724.2018.1460949.
2. Бисекенова А.Л., Рамазанова Б.А., Mусаева А.А., Нурмолдин lll.M., Алибаева Ж.С., Угышова lll.E. Анти-биотикорезистентность штаммов Enterobacteriaceae, выделенных от пациентов многопрофильных стациона-
ров. Вестник Казахского Национального медицинского университета 2016; 4: 50-54. Bisekenova A.L., Ramazanova B.A., Musayeva A.A., Nurmoldin Sh.M., Alibaeva Zh.S., Ugushova Sh.E. Antibiotic resistance of strains of Enterobacteriaceae isolated from patients in multidisciplinary hospitals. Vestnik Kazakhskogo Natsional'nogo meditsinskogo universiteta 2016; 4: 50-54.
3. Эйдельштейн М.В., Журавлев В.С., Шек Е.А. Распространенность карбапенемаз среди нозокомиальных штаммов Enterobacteriaceae в России. Известия Саратовского университета. Новая серия. Серия: Химия. Биология. Экология 2017; 17(1): 36-41. Edelstein M.V., Zhuravlev V.S., Shek E.A. Prevalence of carbapenemases among the nosocomial strains of Enterobacteriaceae in Russia. Izvestiya Saratovskogo universiteta. Novaya seriya. Seriya: Khimiya. Biologiya. Ekologiya 2017; 17(1): 36-41.
4. Angeletti S., Dicuonzo G., Lo Presti A., Cella E., Crea F., Avola A., Vitali M.A., Fagioni M., De Florio L. MALDI-TOF mass spectrometry and blakpc gene phylogenetic analysis of an outbreak of carbapenem-resistant K. pneumoniae strains. New Microbiol 2015; 38(4): 541-550.
5. Шипицына И.В., Розова Л.В. Оценка патогенного потенциала штаммов Klebsiella pneumoniae, выделенных из ран больных хроническим остеомиелитом. Успехи современного естествознания 2015; 4: 93-96. Shipitsyna I.V., Rozova L.V. Evaluation of pathogenic potential of Klebsiella pneumoniae strains isolated from the wounds of patients with chronic osteomyelitis. Uspekhi sovremennogo estestvoznaniya 2015; 4: 93-96.
6. Piperaki E.T., Syrogiannopoulos G.A., Tzouvelekis L.S., Daikos G.L. Klebsiella pneumoniae: virulence, biofilm and antimicrobial resistance. Pediatr Infect Dis J 2017; 36(10): 1002-1005, https://doi.org/10.1097/inf.0000000000001675.
7. Сухорукова М.В., Эйдельштейн М.В., Склеено-ва Е.Ю., Иванчик Н.В., Тимохова А.В., Дехнич А.В., Козлов Р.С., Попов Д.А., Астанина М.А., Жданова О.А., Болышева Г.С., Новикова Р.И., Валиуллина И.Р., Кока-рева Т.С., Частоедова А.Н., Рог А.А., Поликарпова С.В., Гординская Н.А., Некаева Е.С., Абрамова Н.В., Доманская О.В., Землянская О.А., Горюнова Л.А., Скальский С.В., Елохина Е.В., Попова Л.Д., Божкова С.А., Гомон Ю.М., Кречикова О.И., Мищенко В.М., Рачина С.А., Стреж Ю.А., Гудкова Л.В., Колосова И.П., Вунукайнен Т.М., Ортенберг Э.А., Хохлявина Р.М., Портнягина У.С., Ша-маева С.Х., Матвеев А.С., Палютин Ш.Х., Власова А.В., Ершова М.Г., Лебедева М.С., Феоктистова Л.В., Гор-деева С.А., Долинина В.В., Чернявская Ю.Л., Ба-гин В.А., Розанова С.М., Перевалова Е.Ю. Анти-биотикорезистентность нозокомиальных штаммов Enterobacteriaceae в стационарах России: результаты многоцентрового эпидемиологического исследования МАРАФОН в 2011-2012 гг. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия 2014; 16(4): 254-265. Sukhorukova M.V., Edelstein M.V., Skleenova E.Yu., Ivanchik N.V., Timokhova A.V., Dekhnich A.V., Kozlov R.S., Popov D.A., Astanina M.A., Zhdanova O.A., Bolysheva G.S., Novikova R.I., Valiullina I.R., Kokareva T.S., Chastoedova A.N., Rog A.A., Polikarpova S.V., Gordinskaya N.A., Nekaeva E.S., Abramova N.V., Domanskaya O.V., Zemlyanskaya O.A., Goryunova L.A., Skal'skiy S.V., Elokhina E.V., Popova L.D., Bozhkova S.A., Gomon Yu.M., Krechikova O.I., Mishchenko V.M., Rachina S.A., Strezh Yu.A., Gudkova L.V., Kolosova I.P., Vunukaynen T.M., Ortenberg E.A.,
Khokhlyavina R.M., Portnyagina U.S., Shamaeva S.Kh., Matveev A.S., Palyutin Sh.Kh., Vlasova A.V., Ershova M.G., Lebedeva M.S., Feoktistova L.V., Gordeeva S.A., Dolinina V.V., Chernyavskaya Yu.L., Bagin V.A., Rozanova S.M., Perevalova E.Yu. Antimicrobial resistance of nosocomial Enterobacteriaceae isolates in Russia: results of national multicenter surveillance study "MARATHON" 2011-2012. Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya khimioterapiya 2014; 16(4): 254-265.
8. Крыжановская О.А., Лазарева А.В., Алябьева Н.М., Тепаев РФ., Карасева О.В., Чеботарь И.В., Маянский Н.А. Устойчивость к антибиотикам и молекулярные механизмы резистентности у карбапенем-нечувствительных изолятов Klebsiella pneumoniae, выделенных в педиатрических ОРИТ г. Москвы. Антибиотики и химиотерапия 2016; 61(7-8): 22-26. Kryzhanovskaya O.A., Lazareva A.V., Alyabieva N.M., Tepaev R.F., Karaseva O.V., Chebotar I.V., Mayanskiy N.A. Antibiotic resistance and its molecular mechanisms in carbapenem-nonsusceptible Klebsiella pneumoniae isolated in pediatric ICUs in Moscow. Antibiotiki i khimioterapiya 2016; 61(7-8): 22-26.
9. Dubodelov D.V., Lubasovskaya L.A., Shubina E.S., Mukosey I.S., Korostin D.O., Kochetkova T.O., Bogacheva N.A., Bistritskiy A.A., Gordeev A.B., Trofimov D.Y., Priputnevich T.V., Zubkov V.V. Genetic determinants of resistance of hospital-associated strains of Klebsiella pneumoniae to ß-lactam antibiotics isolated in neonates. Russian Journal of Genetics 2016; 52(9): 993-998, https://doi. org/10.1134/s1022795416090040.
10. Тапальский Д.В., Петренев Д.Р Распространенность Klebsiella pneumoniae — продуцентов карбапенемаз в Беларуси и их конкурентоспособность. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия 2017; 19(2): 139-144. Tapalskiy D.V., Petrenyov D.R. Prevalence of carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae isolates in Belarus and their competitive ability. Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya khimioterapiya 2017; 19(2): 139-144.
11. Gu D., Dong N., Zheng Z., Lin D., Huang M., Wang L., Chan E.W., Shu L., Yu J., Zhang R., Chen S. A fatal outbreak of ST11 carbapenem-resistant hypervirulent Klebsiella pneumoniae in a Chinese hospital: a molecular epidemiological study. Lancet Infect Dis 2018; 18(1): 37-46, https://doi. org/10.1016/s1473-3099(17)30489-9.
12. Zheng X., Wang J.F., Xu W.L., Xu J., Hu J. Clinical and molecular characteristics, risk factors and outcomes of Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae bloodstream infections in the intensive care unit. Antimicrob Resist Infect Control 2017; 6: 102, https://doi.org/10.1186/s13756-017-0256-2.
13. Лазарева И.В., Агеевец В.А., Ершова Т.А., Зуева Л.П., Гончаров А.Е., Дарьина М.Г., Светличная Ю.С., Усков А.Н., Сидоренко С.В. Распространение и антибактериальная резистентность грамотрицательных бактерий, продуцентов карбапенемаз в Санкт-Петербурге и некоторых других регионов Российской Федерации. Антибиотики и химиотерапия 2016; 61(11-12): 28-38. Lazareva I.V., Ageevets V.A., Ershova T.A., Zueva L.P., Goncharov A.E., Darina M.G., Svetlichnaya Yu.S., Uskov A.N., Sidorenko S.V. Prevalence and antibiotic resistance of carbapenemase-producing gram-negative bacteria in Saint Petersburg and some other regions of the Russian Federation. Antibiotiki i khimioterapiya 2016; 61(11-12): 28-38.
14. Berrazeg M., Diene S.M., Drissi M., Kempf M., Richet H., Landraud L., Rolain J.M. Biotyping of multidrug-resistant Klebsiella pneumoniae clinical isolates from France and Algeria using MALDI-TOF MS. PLoS One 2013; 8(4): e61428, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0061428.
15. Lau A.F., Wang H., Weingarten R.A., Drake S.K., Suffredini A.F., Garfield M.K., Chen Y., Gucek M., Youn J.H., Stock F., Tso H., DeLeo J., Cimino J.J., Frank K.M., Dekker J.P. A rapid matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry-based method for single-plasmid tracking in an outbreak of carbapenem-resistant Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol 2014; 52(8): 2804-2812, https://doi. org/10.1128/jcm.00694-14.
16. Gaibani P., Galea A., Fagioni M., Ambretti S., Sambri V., Landini M.P. Evaluation of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for identification of KPC-producing Klebsiella pneumoniae. J Clin Microbiol 2016; 54(10): 2609-2613, https://doi.org/10.1128/jcm.01242-16.
17. Gaibani P., Ambretti S., Tamburini M.V., Vecchio Nepita E., Re M.C. Clinical application of Bruker Biotyper MALDI-TOF/MS system for real-time identification of KPC production in Klebsiella pneumoniae clinical isolates. J Glob Antimicrob Resist 2018; 12: 169-170, https://doi. org/10.1016/j.jgar.2018.01.016.
18. Тапальский Д.В., Осипов В.А., Жаворонок С.В. Карбапенемазы грамотрицательных бактерий: распространение и методы детекции. Медицинский журнал 2012; 2(40): 10-15. Tapalski D.V., Osipov V.A., Zhavoronok S.V. Сarbapenemases of gram-negative pathogens: spread and methods of detection. Meditsinskiy zhurnal 2012; 2(40): 10-15.
19. Afzali H., Firoozeh F., Amiri A., Moniri R., Zibaei M. Characterization of CTX-M-type extend-spectrum ß-lactamase producing Klebsiella spp. in Kashan, Iran. Jundishapur J Microbiol 2015; 8(10): e27967, https://doi.org/10.5812/ jjm.27967.
20. Алексеева А.Е., Бруснигина Н.Ф., Солнцев Л.А., Гординская Н.А. Молекулярное типирование клинических изолятов Klebsiella pneumoniae, продуцирующих бета-лактамазы расширенного спектра действия. Клиническая лабораторная диагностика 2017; 62(11): 699704. Alekseeva A.E., Brusnigina N.F., Solntsev L.A., Gordinskaya N.A. The molecular typing of clinical isolates klebsiella pneumoniae producing beta-lactamases of extended specter of action. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika 2017; 62(11): 699-704.
21. Коробова А.Г. Мониторинг энтеробактерий с продукцией бета-лактамаз расширенного спектра, выделенных у больных гемобластозами при химиотерапии. Дис. ... канд мед наук. М; 2018. Korobova A.G. Monitoring enterobakteriy s produktsiey beta-laktamaz rasshirennogo spektra, vydelennykh u bol'nykh gemoblastozami pri khimioterapii. Dis. ... kand med nauk [Monitoring of enterobacteria with the production of extended-spectrum beta-lactamases isolated in patients with hemoblastosis during chemotherapy. PhD Dissertation]. Moscow; 2018.
22. Ильина В.Н., Субботовская А.И., Козырева В.С., Сергеевичев Д.С., Шилова А.Н. Характеристика штаммов, продуцирующих БЛРС СТХ-М типа, выделенных в кардио-хирургическом стационаре. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия 2013; 15(4): 309314. Ilyina V.N., Subbotovskaya A.I., Kozyreva V.S., Sergeevitchev D.S., Shilova A.N. Characteristics of Enterobacteriaceae strains producing CTX-M type ESBL in
a Cardiac Surgery Hospital. Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya khimioterapiya 2013; 15(4): 309-314.
23. Шагинян И.А. Роль и место молекулярно-генетических методов в эпидемиологическом анализе внутрибольничных инфекций. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия 2000; 2(3): 82-95. Shaginyan I.A. Role and significance of molecular methods in epidemiological analysis of nosocomial infections. Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya khimioterapiya 2000; 2(3): 82-95.
24. Асташкин Е.И., Лев А.И., Новикова Т.С., Карцев Н.Н., Федюкина Г.Н., Ершова М.Г., Полетаева Е.Д., Фурсова Н.К., Шепелин А.П. Характеристика антибиотикорезистентных клинических изолятов Klebsiella pneumoniae, выделенных в Ярославле в 2016-2017 гг. Бактериология 2017; 2(3): 45. Astashkin E.I., Lev A.I., Novikova T.S., Kartsev N.N., Fedyukina G.N., Ershova M.G., Poletaeva E.D., Fursova N.K., Shepelin A.P. Characterization of the antibiotic-resistant clinical isolates of Klebsiella pneumoniae isolated in Yaroslavl in 2016-2017. Bakteriologiya 2017; 2(3): 45.
25. Deschaght P., Van Simaey L., Decat E., Van Mechelen E., Brisse S., Vaneechoutte M. Rapid genotyping of Achromobacter xylosoxidans, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Stenotrophomonas maltophilia isolates using melting curve analysis of RAPD-generated DNA fragments (McRAPD). Res Microbiol 2011; 162(4): 386-392, https://doi.org/10.1016/j. resmic.2011.02.002.
26. Sachse S., Bresan S., Erhard M., Edel B., Pfister W., Saupe A., Rödel J. Comparison of multilocus sequence typing, RAPD, and MALDI-TOF mass spectrometry for typing of ß-lactam-resistant Klebsiella pneumoniae strains. Diagn Microbiol Infect Dis 2014; 80(4): 267-271, https://doi. org/10.1016/j.diagmicrobio.2014.09.005.
27. Молекулярно-эпидемиологический мониторинг в системе эпидемиологического надзора за инфекциями, связанными с оказанием медицинской помощи. Федеральные клинические рекомендации. М; 2014. Molekulyarno-epidemiologicheskiy monitoring v sisteme epidemiologicheskogo nadzora za infektsiyami, svyazannymi s okazaniem meditsinskoy pomoshchi. Federal'nye klinicheskie rekomendatsii [Molecular epidemiological monitoring in the system of epidemiological surveillance of infections associated
the provision of medical care. Federal clinical guidelines]. 014.
ng X., Wu Y., Yang H., Han Y., Yang R., Hu L., -based inference of genetic diversity and nical Klebsiella pneumoniae, China. ://doi.org/10.1038/srep07612.
Verhoef J., Grimont P.A.,
Brisse S. Multilocus sequence typing of Klebsiella pneumoniae nosocomial isolates. J Clin Microbiol 2005; 43(8): 4178-4182, https://doi.org/10.1128/jcm.43.8.4178-4182.2005.
30. EUCAST guidelines for detection of resistance mechanisms and specific resistances of clinical and/or epidemiological importance. Version 1.0, 2013. URL: http:// www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/ Resistance_mechanisms/EUCAST_detection_of_resistance_ mechanisms_v1.0_20131211.pdf.
31. Ikryannikova L.N., Shitikov E.A., Zhivankova D.G., Il'ina E.N., Edelstein M.V., Govorun V.M. A MALDI TOF MS-based minisequencing method for rapid detection of TEM-type extended-spectrum beta-lactamases in clinical strains of Enterobacteriaceae. J Microbiol Methods 2008; 75(3): 385391, https://doi.org/10.1016/j.mimet.2008.07.005.
32. Eftekhar F., Naseh Z. Extended-spectrum ß-lactamase and carbapenemase production among burn and non-burn clinical isolates of Klebsiella pneumoniae. Iran J Microbiol 2015; 7(3): 144-149.
33. Seemann T. Prokka: rapid prokaryotic genome annotation. Bioinformatics 2014; 30(14): 2068-2069, https:// doi.org/10.1093/bioinformatics/btu153.
34. Brisse S., Passet V., Haugaard A.B., Babosan A., Kassis-Chikhani N., Struve C., Decre D. wzi Gene sequencing, a rapid method for determination of capsular type for Klebsiella strains. J Clin Microbiol 2013; 51(12): 4073-4078, https://doi. org/10.1128/jcm.01924-13.
35. Козлова Н.С., Баранцевич Н.Е., Баранцевич Е.П., Гоик В.Г Устойчивость к антибиотикам клебсиелл различного происхождения. Инфекция и иммунитет 2016; 6(3): 48. Kozlova N.S., Barantsevich N.E., Barantsevich E.P., Goik V.G. Resistance of Klebsiella of various origin to antibiotics. Infektsiya i immunitet 2016; 6(3): 48.
36. Bush K., Jacoby G.A. Updated functional classification of beta-lactamases. Antimicrob Agents Chemother 2010; 54(3): 969-976, https://doi.org/10.1128/aac.01009-09.
37. Фурсова Н.К., Прямчук С.Д., Абаев И.В., Ковалев Ю.Н., Шишкова Н.А., Печерских Э.И., Коробова О.В., Асташкин Е.И., Пачкунов Д.М., Светоч Э.А., Сидоренко С.В. Генетическое окружение генов blaCTX_M, локализованных на конъюгативных плазмидах нозокомиальных изолятов Enterobacteriaceae, выделенных в России в 2003-2007 гг. Антибиотики и химиотерапия 2010; 55(11-12): 3-10. Fursova N.K., Pryamchuk S.D., Abaev I.V., Kovalev Yu.N., Shishkova N.A., Pecherskikh E.I., Korobova O.V., Astashkin E.I., Pachkunov D.M., Svetoch E.A., Sidorenko S.V. Genetic environments of blaCTX_M genes located on conjugative plasmids of Enterobacteriaceae nosocomial isolates collected in Russia within 2003-2007. Antibiotiki i khimioterapiya 2010; 55(11-12): 3-10.
134 СТМ J 2019 J том 11 J №4
