CC BY
32
Микробиология и эпидемиология Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2012, № 2 (3), с. 30-33
УДК 616-036.2:616.36-002
СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ВИРУСОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ В СИСТЕМЕ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА
ЗА ГЕПАТИТОМ А
© 2012 г. Т.Н. Быстрова, К.В. Блохин, А.А. Залесских
Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. И.Н. Блохиной gepatit-bystrova@yandex.ru
Поступила в редакцию 21.03.2012
Усовершенствована методика концентрирования вируса гепатита А, апробированы разные типы ультрафильтрационных мембран. Наиболее эффективными оказались мембраны ММПА+-0.2, обеспечивающие повышение диагностической чувствительности полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией на 2 порядка. Разработан способ определения минимальных количеств вируса гепатита А в воде. Предложенные методики повышают эффективность вирусологического мониторинга водных объектов с целью предупреждения распространения инфекции водным путем.
Ключевые слова: вирус гепатита А, концентрирование вирусов, полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией, ультрафильтрационные мембраны.
Введение
В современный период гепатит А (ГА) по-прежнему представляет собой серьезную проблему для здравоохранения почти всех стран мира, поражая ежегодно до 1.5 млн человек. В России, несмотря на общую тенденцию к снижению, уровень заболеваемости ГА остается значительным, превосходя показатели многих стран Европы. Как и в предыдущие десятилетия, при сохранении периодических колебаний отмечено крайне неравномерное распределение заболеваемости по территории РФ. Поэтому общероссийские показатели не отражают особенностей эпидемического процесса инфекции в отдельных регионах [1]. В какой-то мере контрастное распределение уровня заболеваемости ГА определяется неодинаковой значимостью на территориях разных путей передачи инфекции. В ряде территорий страны ведущим признан водный путь передачи, обусловливающий 60-70% случаев ГА как при спорадической, так и вспышечной заболеваемости [1, 2]. Результативность изучения водного фактора передачи ГА определяется используемыми методическими подходами при мониторинге объектов хозяйственно-питьевого водоснабжения. Исходя из этого, актуальным является совершенствование методической базы эпидемиологического надзора при проведении мониторинга водных объектов контаминации вирусом ГА (ВГА), что определяется применением адекватных эффективных методов детекции и концентрирования вируса.
Этап концентрирования ВГА является основополагающим в ходе санитарно-вирусологических исследований воды при надзоре за этой инфекцией. Это обстоятельство обусловлено порогом чувствительности методов детекции вируса.
Несмотря на большое количество методик, обеспечивающих процесс концентрирования вирусов из воды, предложенных официальным регламентирующим документом МУК 4.2.2029-
05, все они требуют совершенствования в направлении повышения надежности при получении репрезентативных проб [3].
Наиболее полно необходимым требованиям отвечает технология мембранной фильтрации, которая давно используется в санитарнобактериологической практике. Она также может использоваться и для индикации вирусного загрязнения воды при наличии высококачественных мембран отечественного производства.
Цель настоящей работы - совершенствование способа детекции ВГА в воде на основе полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и повышение эффективности предварительного концентрирования вируса с использованием различных видов мик-рофильтрационных мембран.
Экспериментальная часть
С целью совершенствования этапа концентрирования ВГА из воды различной степени загрязнения изучена эффективность различных
отечественных фильтрующих мембран, а также технических средств для осуществления фильтрации. Были апробированы мембраны с положительным потенциалом (ММПА+-0.2), фильтр дисковый ацетатный целлюлозный (ФМАЦ-
0.2), ультрафильтрационная мембрана «Влади-пор» типа УПМ-СВА в сочетании с приборами: вакуумного фильтрования ПВФ-142 ФБ производства ЗАО «БМТ», г. Владимир; напорного фильтрования ПНФ-142 производства ЗАО «Мембраны», г. Владимир; фильтрационного аппарата марки АФ-142 с напорной емкостью на 10 литров производства ЗАО «Владисарт».
При проведении экспериментов использовали ВГА HAS-15, полученный нами в культуре клеток почек эмбриона макаки-резус (FRhk-4). Клетки выращивали в роллерных условиях, используя питательную среду Игла-МЭМ с удвоенным содержанием аминокислот и витаминов. Съем клеток проводили с помощью версена.
Для освобождения вирусной суспензии от клеточного детрита ее подвергали центрифугированию при 4000 об./мин в течение 20 минут. Активность полученного таким образом исходного вируса оценивали тестированием проб в минимальных разведениях с помощью ИФА и ОТ-ПЦР, которые оказались равными 1:8 и 110-5-110-6 соответственно. Детекцию вируса проводили с помощью коммерческой тест-системы «АмплиСенс НАV-430» производства ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора.
Результаты и их обсуждение
В предварительной серии опытов была отработана методика десорбции вируса с мембраны. Испытаны следующие элюирующие растворы: глициновый буфер с различными значениями рН (10, 12 и более 12), а также дистиллированная вода.
Наиболее оптимальным оказался элюат, имеющий слабощелочную реакцию, на втором месте по эффективности оказалась дистиллированная вода. Глициновый буфер с рН равным 12 и выше оказался непригодным для решения данной задачи. В дальнейшем при проведении работ с мембранами использовали только слабощелочные элюирующие растворы.
В следующей серии опытов оценивали возможность применения испытуемых мембран для концентрирования ВГА в условиях различной концентрации вируса в исходной суспензии. Прежде всего была проведена работа по определению ВГА в суспензиях до концентри-
рования, взятых в разведении 110-4-110-8. Расчетную концентрацию готовили на дистиллированной воде в объеме 3 л. Такой объем определялся конструктивными особенностями использованных технических средств.
При исследовании исходных концентраций суспензий вируса с помощью ОТ-ПЦР ВГА стабильно определялся в разведении и10-5, а в разведении и10-6 - в 80% опытов. В более разведенных суспензиях и10-7, и10-8 ВГА до концентрирования не определялся. В связи с этим для концентрирования использовано исходное разведение вируса и10-7, и10-8.
Сравнительная оценка концентрирующей способности мембран различных типов показала, что наиболее эффективными оказались мембраны ММПА+-0.2 и УПМ-СВА, с помощью которых удалось обнаружить вирус в суспензии, разведенной до 110-7. Мембраны ФМАЦ и МЦМ-П дали положительный результат только в разведении вируса 110-6 и ниже. Увеличение объема исследуемой воды до 10 л при использовании мембран ММПА+-0.2 повысило эффективность выявления вируса еще на один порядок. Использование мембран в сочетании с техническими средствами ПНФ-142, ПВФ-142 ФБ и АФ-142 показало идентичные результаты.
На следующем этапе работы указанные выше технические средства в сочетании с различными мембранами для обеспечения процесса концентрирования были испытаны на скорость фильтрования воды с различной степенью очистки.
Выявлено, что дистиллированная или очищенная вода проходили через мембраны ММПА+-0.2 и ФМАЦ-0.2 практически с одинаковой скоростью (в пределах 5 минут). Речная вода через те же мембраны проходила с разной скоростью. Время прохождения воды колебалось в значительных пределах: минимально от 4 до 12 минут, максимально от 15 до 78 минут.
Мембраны УПМ-СВА оказались непригодными для работы на вакуумном приборе из-за перегрева насоса. С помощью ПНФ-142 через эти мембраны удалось профильтровать все 3 литра воды, но время для этого потребовалось значительно больше: дистиллированная вода -до 27 минут, очищенная - до 58 минут, а речная - до 252 минут.
Таким образом, сравнительные испытания указанных выше мембран по производительности, универсальности и эффективности свидетельствуют о преимуществе ММПА+-0.2, так как она обеспечивает повышение диагностической чувствительности ОТ-ПЦР на 1-2 порядка, а при условии увеличения объема исследуемой
пробы еще на один. Все использованные приборы оказались пригодными для работы с мембранами, методика работы с ними проста и не требует дорогостоящих реактивов.
Следующим направлением наших исследований было усовершенствование способа детекции ВГА в концентратах воды.
В ранее проведенных работах на основании экспериментальных исследований нами было показано, что в эпидемиологическом надзоре за ГА для целей вирусологического контроля водных объектов целесообразно использование метода ОТ-ПЦР, который по чувствительности в 1000 раз превосходит ИФА. При этом применение ОТ-ПЦР по сравнению с ИФА повысило выявляе-мость ВГА в воде более чем в 23 раза [4, 5].
С целью повышения порога чувствительности ОТ-ПЦР разработан способ обнаружения минимальных количеств ВГА в водных объектах. Сущность способа заключается в том, что минимальные дозы ВГА, не определяемые с помощью метода ОТ-ПЦР, выявляются на основе «суммарного эффекта» при добавлении в пробу под-пороговых доз (ПК-10-1) лабораторного ВГА с последующим определением РНК ВГ А.
На первом этапе работы при многократных титрованиях вируса методом ОТ-ПЦР были определены пороговая и подпороговая концентрации полученного в лабораторных условиях ВГА, штамм НАS-15 (пул № 22). С вирусными суспензиями в разведении 110-5 все 18 исследованных проб оказались только положительными, а в разведениях 110-6 и 110-7 — только отрицательными (п = 14 и 6 образцов соответственно). На основании этих результатов определили пороговую (ПК) и подпороговую (ПК 1 • 10-1) концентрации вирусного пула, которые использовали в дальнейших исследованиях.
В экспериментах с вирусом гепатита А (штамм HAS-15) показано, что методом ОТ-ПЦР удается обнаружить РНК ВГА в концентратах дистиллированной воды, полученных с помощью любого способа концентрирования, содержащей вирусы в исходном разведении до 110-6 (100%) и 110-7 (около 30%). В более высоких разведениях ВГА никогда не определялся.
Для реализации предлагаемого способа готовили концентраты воды при исходном разведении вируса 110-8 или 110-9. В них вносили расчетные количества заранее оттитрованного ВГА с тем, чтобы в конечном итоге получить разведение его в концентрациях: пороговой (110-5) и подпороговых (110-6, 110-7 и 110-8). Затем воспроизводили метод ОТ-ПЦР (прототип) для обнаружения РНК ВГА.
Предложенный способ был апробирован на образцах сточной воды, полученной с очистных сооружений. При исследовании концентрата сточной воды с входного коллектора биологических очистных сооружений г. Балахны Нижегородской области с помощью метода ОТ-ПЦР был получен «отрицательный» результат. Использование предлагаемого способа обеспечило обнаружение в этой пробе РНК ВГА. После добавления в этот концентрат подпороговой концентрации (110-6) вируса (штамм HAS-15) с помощью метода ОТ-ПЦР удалось получить положительный эффект. Минимальные количества вируса в основе и добавке в результате эффекта сложения дали положительный результат.
В общей сложности были исследованы 16 проб сточной воды, отобранных с помощью флизелиновых пакетов с макропористым стеклом из входного коллектора различных очистных сооружений до обработки. Методом ОТ-ПЦР в пяти из них была обнаружена РНК ВГА. Остальные пробы оказались отрицательными. Дополнительные исследования «негативных» образцов с помощью предлагаемого способа еще в пяти из них позволили обнаружить РНК ВГА, тем самым увеличив число положительных находок вируса в 2 раза.
При исследовании методом ОТ-ПЦР (прототип) ни одна из 18 проб сточной воды, прошедшей обработку на биологических очистных сооружениях и отобранной перед выпуском в поверхностные водоемы, не содержала РНК ВГА. Во все эти пробы был внесен вирус гепатита А (штамм HAS-15) в расчете конечного разведения 110-6 (подпороговая доза, не выявляемая с помощью ОТ-ПЦР). Повторная постановка метода прототипа не обнаружила в исследованных пробах РНК ВГА. Во всех случаях феномен сложения не осуществился из-за отсутствия вируса в водных концентратах. После очистки сточная вода не содержала вирус гепатита А.
Таким образом, предложенный способ определения минимальных количеств ВГА в водных концентратах позволил повысить чувствительность метода ОТ -ПЦР и тем самым увеличить эффективность выявления ВГА при расшифровке скрытых процессов распространения возбудителя во внешней среде. Дополнительное исследование «негативных» проб путем использования дабл-системы обеспечивает повышение порога чувствительности ОТ-ПЦР на 2 порядка (с 110-7 до 110-9). По описанной методике получен патент [6].
Заключение
В целом полученные результаты свидетельствуют о возможности совершенствования эпидемиологического надзора за гепатитом А, так как позволяют повысить эффективность санитарно-вирусологического контроля за контаминацией водных объектов ВГА с целью предупреждения распространения инфекции водным путем.
Список литературы
1. Вирусные гепатиты в Российской Федерации / Под ред. В.И. Покровского, А.Б. Жебруна. СПб.: Изд-во НИИЭМ имени Пастера, 2011. Вып. 8. 116 с.
2. Быстрова Т.Н., Блохин К.В., Попкова М.И. и др. Эпидемиологическое значение находок вируса гепатита А в открытых водоемах // Мир вирусных гепатитов. 2006. № 5. С. 2-6.
3. МУК 4.2.2029-05. Санитарно-вирусологический контроль водных объектов. М.: ФГУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора», 2006. 38 с.
4. Блохин К.В., Быстрова Т.Н. Изучение возможности повышения порога чувствительности метода ОТ-ПЦР при исследовании проб воды на наличие в них вируса гепатита А // Сб. матер. юбилейной Все-рос. НПК, посвящ. 90-летию ННИИЭМ им. акад. И.Н. Блохиной и 20-летию Приволжского окружного центра по профилактике и борьбе со СПИД «Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения», Н. Новгород, 2009 г. С. 123-125.
5. Блохин К.В., Быстрова Т.Н., Полянина А.В. и др. Молекулярно-генетические технологии в изучении эпидемического процесса гепатита А // Научно-практ. журн. «Медицинский альманах». 2010. № 2. С. 241-245.
6. Быстрова Т.Н., Блохин К.В. Способ обна-
ружения минимальных количеств вируса гепатита А в водных объектах. Пат. № 2375455 С^1/00; С^1/68 2008125383/13; заявл.
23.06.2008; опубл. 10.12.2009, бюлл. № 34. Заяв.: ФБУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
IMPROVEMENT OF VIROLOGICAL MONITORING OF WATER BODIES AND SOURCES IN THE SYSTEM OF EPIDEMIOLOGICAL SURVEILLANCE FOR HEPATITIS A
T.N. Bystrova, K. V. Blokhin, A.A. Zalesskikh
We report an improvement of the technique for concentrating hepatitis A virus. Different types of ultrafiltration membranes were evaluated. MMPA+-0.2 membranes have demonstrated the best efficiency. This type of membranes increases PCR diagnostic sensitivity by two orders of magnitude. A method for detecting minimal amounts of the virus in the water has been developed. The proposed methods can enhance the efficiency of virological monitoring of water bodies and sources in order to prevent HAV transmission through water.
Keywords: Hepaitis A virus, concentration of viruses, RT-PCR, ultrafiltration membranes.
