Применение мембран с положительным поверхностным зарядом для санитарно-вирусологического контроля воды Текст научной статьи по специальности «Нанотехнологии»

УДК 678.5:576.858

ПРИМЕНЕНИЕ МЕМБРАН С ПОЛОЖИТЕЛЬНЫМ ПОВЕРХНОСТНЫМ ЗАРЯДОМ ДЛЯ САНИТАРНО-ВИРУСОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ВОДЫ

© 2012 А.В. Тарасов2, Ю.А. Федотов2, С.А. Лепешин2, Ю.Т. Панов1, К.В. Окулов1, А.И. Вдовина1

1 Владимирский государственный университет имени А.Г. и Н.Г. Столетовых

2 ООО НПП «Технофильтр»

Поступила в редакцию 25.04.2012

ООО НПП «Технофильтр» разработал способ концентрирования вирусов из воды с использованием микрофильтрационных полиамидных мембран, обладающих положительным поверхностным зарядом, отвечающий современным требованиям проведения вирусологического контроля воды. В НИИ ЭЧ и ГОС им. Сысина РАМН проведены исследования процесса концентрирования вирусов из вод различного происхождения с положительно заряженной микрофильтрационной мембраны марки ММПА+-0.2 и установлена их высокая эффективность.

Ключевые слова: вирусное загрязнение воды, методы определения, методы очистки, полиамидные микрофильтрационные мембраны

Полиамидные микрофильтрационные мембраны производства НПП «Технофильтр» (г. Владимир) более 15 лет используются в разнообразных процессах осветляющей, тонкой и стерилизующей фильтрации различных водных сред. Мембраны микропористые полиамидные представляют собой пористые пленки, изготовленные из полиамида-6 и смесей с полиамидом-66 по запатентованной технологии [1, 2]. Полиамидные мембраны имеют крупноячеистое строение, причем стенками ячеек являются тонкие микропористые перегородки. Такое строение предопределяет непрерывность структуры мембран и обеспечивает прочность и эластичность в сухом и смоченном виде, что приводит к удобству и простоте в работе с ними. Мембраны не теряют своей прочности и эластичности при многократных сгибаниях, что обеспечивает возможность бездефектного изготовления гофрированных патронных фильтрующих элементов. В связи с высокой гидрофильностью мембранообразу-ющего полимера, полиамидные мембраны быстро смачиваются водой и различными водными растворами. Они устойчивы в водных

Тарасов Александр Валентинович, кандидат химических наук, директор. E-mail: [email protected] Федотов Юрий Александрович, кандидат химических наук, старший научный сотрудник. E-mail: OM. TF@mail. ru

Лепешин Сергей Александрович аспирант Панов Юрий Терентьевич, доктор технических наук, профессор кафедры полимерных материалов. E-mail: [email protected]

Окулов Кирилл Валерьевич, аспирант Вдовина Анастасия Игоревна, аспирантка

средах со значениями рН от 2-13, а также во многих органических растворителях.

Результаты и их обсуждение. Длительное время разделительные возможности мембран объясняли исключительно ситовым эффектом. Позднее, после внедрения в практику фильтрации мембран изготавливаемых из новых полимеров, было установлено, что эффективность задержания различных загрязняющих веществ обеспечивается не только за счет ситового механизма, но также вследствие их адсорбции, которая в свою очередь обеспечивается электростатическими или Ван-дер-вааль-совыми силами взаимодействия. Мембраны, обладающие поверхностным электрическим зарядом (дзета-потенциалом), получили название «заряженные мембраны». Поверхностные свойства мембран оказывают значительное, а иногда решающее влияние на их эксплуатационные свойства. Величина и знак зарядов поверхности мембран и задерживаемых частиц (коллоидов, высокомолекулярных соединений, ионов и т.д.), содержащихся в фильтруемой смеси, определяют интенсивность электростатического взаимодействия между ними, инициирующего процесс адсорбции, результатом которого может быть с одной стороны повышение эффективности задержания, а с другой стороны закупорка пор и падение производительности мембраны. Для уменьшения величины адсорбции необходимо, чтобы мембрана и фильтруемые частицы приобретали в растворе одноименный заряд и наоборот. Вследствие ограниченного набора полимеров, применяемых для

2372

получения мембран, это условие может быть удовлетворено за счет модификации поверхности мембран или объемной модификации.

Известно, что алифатические полиамиды, используемые для получения мембран, в отличие от других мембранообразующих полимеров (ацетат целлюлозы, фторопласт, акрилонитрил и т.д.) имеют изоэлектрическую точку, в которой положительные и отрицательные заряды компенсируют друг друга. Для полигексамети-лендиамина (ПА-66) и поликапролактама (ПА-6) изоэлектрическая точка находится в диапазоне рН от 7,6-8,6 в зависимости от соотношения концевых амино- и карбоксильных групп. При рН выше изоэлектрической точки мембрана заряжена отрицательно, а ниже - положительно. В НПП «Технофильтр» разработаны мембраны, характеризующиеся положительным зарядом в более широкой области рН. Это достигнуто за счет объемной модификации путем введения в мембрану полимеров, содержащих аминогруппы.

В последнее время задача повышения эффективности удаления различных отрицательно заряженных частиц из водных растворов связывается с использованием фильтров, изготовленных из материалов, обладающих поверхностным положительным зарядом. Такие фильтры, совмещая процессы адсорбции и фильтрации, позволяют удалять загрязнения с размерами до десятков нанометров. Пористые электроположительные фильтры способны адсорбировать вирусы, эндотоксины, размер которых во много раз меньше среднего размера пор фильтра, обеспечивая при этом высокие скорости потока воды. Кроме удаления загрязнений, электроположительные фильтрующие материалы применяются для сбора микроорганизмов и других микрочастиц из воды и их анализа.

С введением в действие СанПин 2.1.4.559-96 «Вода питьевая», а также СанПин 2.1.5.980-2000 «Гигиенические требования к охране поверхностных вод» возникла потребность в разработке новой нормативной базы, предусматривающей контроль качества воды различного вида водопользования не только по показателям бактериального, но и вирусного загрязнения, в частности по колифагам, а также энтеровирусам. Для наиболее полного контроля питьевой воды необходимо наличие эффективного методического обеспечения, дающего возможность быстрой и точной количественной оценки реального вирусного загрязнения питьевой воды. Размер патогенных микроорганизмов (бактерий и вирусов) составляет от 0,03 до нескольких микрометров, что в несколько раз меньше размера пор мембраны, что предполагает использование мембран с небольшим

размером пор, например, обратноосмотриче-ских или нанофильтрационных. Но с другой стороны, в связи с низкой концентрацией вирусов в воде важным первичным этапом вирусологического исследования является их концентрирование из больших объемов воды (10-100 л и более до 10-50 мл) [3]. На наш взгляд, микрофильтрационные мембраны с положительным дзета-потенциалом являются оптимальным выходом из данной ситуации. Основное преимущество микрофильтрационных мембран перед нано- или обратноосмотическими, является высокая скорость фильтрации, что в позволит проводить экспресс анализ, а также простое и недорогое лабораторное оснащение.

В НИИ ЭЧ и ГОС им. Сысина РАМН были проведены исследования процесса концентрирования вирусов из вод различного происхождения с применением мембранного модуля МФМ-0142 производства НПП «Технофильтр» [4] и специально разработанной мембраны для вирусологического анализа марки ММПА+. Для фильтрации значительных объемов исследуемой воды нами предлагается схема с использованием перистальтического насоса (рис. 1). Исследуемая вода из расходной емкости (1) (рис. 1) перистальтическим насосом (6) подается в мембранный модуль (2). Фильтрат после модуля поступает на слив, а концентрат остается на мембране. Результаты исследований показали, что сорбция фага М5-2 и вируса полиомиелита 1 (штамм ЬБ2аЬ) на мембранах типа ММК-0,2 достигала 96-98%, а на мембранах ММПА+-0,2 - 99-100%. Эффективность исследованного метода колебалась от 73,3-90,0%, при этом длительность фильтрации 10 литров исследуемой воды составляла 45-90 мин.

Рис. 1. Схема установки концентрирования вирусов с использованием перистальтического насоса:

1 - расходная емкость; 2 - мембранный модуль; 3 -шланг; 4,5 - узлы стыковки; 6 - перистальтический насос; 7 - предфильтр

2373

При концентрировании вирусов применяется тупиковый режим фильтрации, при котором поток жидкости в напорной части между тарелкой и мембраной движется по спиральному каналу, проходит через мембрану, где задерживаются частицы, имеющие отрицательный заряд, такие как вирусы и пирогенны, а также все частицы больше среднего размера пор мембраны. В случае исследования сильно загрязненной жидкости во всасывающую или нагнетательную линию необходимо вмонтировать предфильтр капсульного типа (4, рис. 1), разработанный в ООО НПП «Технофильтр», в котором используются материалы, не сорбирующие вирусы. Также допускается использование дискового предфильтра, устанавливаемого прямо на мембрану в фильтрующем модуле. Использование этого варианта фильтрации позволяет увеличить объем фильтруемой жидкости с 10 до 50 и более литров. Согласно [5], требуемый объем пробы планового и производственного вирусологического анализа 10 и 50 литров. Фильтровальный модуль МФМ-0142 в исполнении с предфильтром позволяет решить данную задачу.

Используемый ранее способ элюции предусматривал изъятие мембраны из модуля и механический смыв вирусов с мембраны струей элюента из пипетки, что представляло определенную опасность инфицирования работающего персонала. Исключение риска инфицирования возможно было только при выполнении данной процедуры в условиях ламинарного бокса, что сопряжено с существенными сложностями и значительными финансовыми затратами. В новом варианте фильтрационного модуля элюция вирусов с мембраны осуществляется без извлечения мембраны, то есть в закрытом режиме. Элюцию вирусов с мембраны (рис. 2) осуществляют путем про-давливания через нее элюента (3% бифэкс-тракта на трисбуфере с рН 9,1-9,5) в три приема по 20 мл двумя одноразовыми шприцами. Шприцы, один из которых содержит элюент, присоединяются к стыковочным устройствам на линии входа воды (2) и на линии выхода фильтрата (4). Узел стыковки (3) заглушен. В каждый прием элюент продавливается через мембрану с помощью этих шприцов не менее 8-10 раз. Основными достоинствами фильтрующего модуля являются:

- возможность совмещения процессов концентрирования и элюции в одном аппарате;

- высокая эффективность концентрирования и элюции, достигаемая за счет оригинальной

конструкции, обеспечивающей массоперенос жидкости над мембраной и через неё;

- возможность осуществления щадящих условий концентрирования и десорбции вирусов, т.к. фильтрация проводится при средах близких к нейтральным без использования каких-либо реагентов;

- снижение количества элюанта до 60 мл;

- обеспечение безопасности обслуживающего персонала (элюция проводится с помощью шприцев без разборки аппарата);

- простота и удобство при эксплуатации.

Рис. 2. Элюция вирусов без разборки модуля: 1 - МФМ; 2, 3, 4 - узлы стыковки; 5 - шприц с элюентом

Многочисленные эксперименты по изучению эффективности выделения вирусов проводили с использованием искусственно зараженной водопроводной воды и нативной воды из поверхностных источников. Воду заражали РНК-содержащим колифагом (МS-2) или вакцинным штаммом полиовируса 1 типа (LSc 2аЬ).На наличие колифагов и полиовируса исследовали исходную воду и элюат. Полученные результаты представлены в таблицах 1-2.

Таблица 1. Эффективность выделения колифагов с использованием модуля МФМ 0142

Концентра ция колифага в БОЕх) Эффективность, %

исходная вода (10 л) элюат (60 мл)

2000 1800 90,0

6200 5135,1 82,8

7500 6240 83,2

9900 8420 85,1

40600 30392,7 74,9

320000 300000 93,7

Примечание: х) БОЕ - бляшкообразующая единица колифага

2374

Таблица 2. Эффективность выделения вирусов с использованием модуля МФМ 0142

Представленные в таблицах 1 и 2 данные показали высокую эффективность выделения как колифага, так и полиовируса при использовании разработанного способа элюции. При этом эффективность выделения фагов колебалась в пределах 74,9-90,0%, а полиовируса -75,6-96%. Также установлено, что эффективность индикации изученных вирусов практически не зависит от исходной концентрации как колифага, так и полиовируса в пределах изученных уровней загрязнения питьевой воды.

Высокая эффективность мембран ММПА+-0.2 была подтверждена и при испытаниях, проведенных в 2006 г. в Краснодарском крае при фильтрации речной воды (р. Туапсе, р. Псеузапсе, р. Аше), воды из подземных источников (скважины санаториев Юг и Шап-сучский чай), а также сточных вод этих санаториев. В 2007 г. в Нижегородском НИИ эпидемиологии и микробиологии им. И.Н. Блохи-ной мембраны ММПА+-0.2 были использованы в процессе концентрирования вирусов гепатита А, одного из трудно культивируемых вирусов. Были использованы искусственно приготовленные суспензии ВГА в дистиллированной воде взятые в разведении от 1х10-4 до 1х10-8 ПУЛ. Установлено, что использование мембран ММПА+-0.2 обеспечивает повышение чувствительности метода контролирования ВГА на 2 порядка по сравнению с ранее из-

вестными методами. При этом достигается надежное удержание вируса даже при концентрациях ниже пороговой чувствительности ОТ ПЦР. Было показано, что концентрирование вирусов на мембране ММПА+-0.2 можно проводить при нейтральном рН в отличие от нит-роцеллюлозных мембран фирмы «Сарториус», для которых достаточный уровень выделения достигается при рН ниже 4,0. Поскольку элю-ирование собранных вирусов не всегда удобно проводить сразу же после концентрирования важно, чтобы условия проведения процесса и сам материал фильтра не оказывали влияния на жизнеспособность вируса (экстремальные значения рН могут инактивировать некоторые вирусы). Этим требованиям в наибольшей мере соответствует мембрана ММПА+.

Для получения надежных результатов, свидетельствующих о наличии или отсутствии вирусов в воде, необходимо исследование всего объема элюата, в данном случае 60 мл, т.к. содержание вирусов даже после концентрирования, как правило, может не превышать единичных вирионов в 1 мл этого объема элюата. С целью уменьшения объема получаемого элюата и повышения эффективности анализа проводится этап вторичного концентрирования путем осаждения вирусов полиэтиленгликолем в соответствии с рекомендациями, изложенными в «Инструкции по использованию поли-меразной цепной реакции (ПЦР) для выявления энтеровирусного загрязнения [6]. Введение этапа вторичного концентрирования вирусов при помощи ПЭГ 6000 позволяет уменьшить объем первичного элюата в 10 раз, который в полном объеме может быть использован для выделения вирусов на различных культурах клеток и для определения РНК и ДНК в ОТ-ПЦР (полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией). Полученные результаты показали (табл. 3), что эффективность выделения полиовируса и колифага, с использованием этапа вторичного концентрирования, была высокой и колебалась в пределах 80,3100%.

Концентрация фага в БОЕ в объеме: Эффективность, % Концентрация полиовируса в ТЦД50 в объеме: Эффек- тив-ность,%

60 мл 6 мл 60 мл 6 мл

780 626 80,3 2,0х102 1,75х102 87,5

852 694 81,5 3,5х102 3,1х102 88,8

852 710 83,3 3,5х102 3,5х102 100

Концентрация полиовиру-са в ТЦД5ох) Эффективность, %

исходная вода (10 л) элюат (60 мл)

3,84 х 103 3,08 х 103 80,3

1,25 х 102 1,0 х 102 80,0

1,25 х 102 1,2 х102 96,0

1,5 х 102 1,2 х 102 83,3

2,25 х 103 1,7 х 103 75,6

2,25 х 103 2,0 х 103 88,9

Примечание: х) ТЦД50 - тканевая цитопатическая доза

вируса

Таблица 3. Эффективность этапа вторичного концентрирования колифага и полиовируса из элюата

2375

Выводы:

1. Установлена высокая эффективность ис- 1. пользования заряженной полиамидной мембраны в процессах концентрирования вирусов

из вод различного происхождения.

2. Предложена схема проведения контроля 2. вирусов с использованием заряженных мембран и микрофильтрационного модуля МФМ-0142, позволяющая увеличить чувствитель- 3-ность метода, без внесения изменений в суще- 4 ствующее оборудование для определения вирусов в воде.

Работа проводилась при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской 5. Федерации (договор M13.G25.31.0022).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

Леоненкова, Е.Г. Способ получения микрофильтрационных мембран / Е.Г. Леоненкова, А.В. Тарасов, Ю.А. Кирш, Ю.А. Федотов. - Патент Российской Федерации №2161530, 2000 г. Тарасов, А.В. Способ получения микрофильтрационной положительно заряженной мембраны / А.В. Тарасов, Ю.А. Федотов. - Патент Российской Федерации № 2286842 С1, 2006 г. Брок, Т. Мембранная фильтрация / Пер. с англ. под ред. Б.В. Мчедлишвили. - М.: Мир, 1987. 335 с. Ильин, М.И. Мембранный фильтрующий модуль / М.И. Ильин, Ю.А. Федотов, Ю.И. Яманов, А.В. Тарасов. - Патент Российской Федерации № 2194566, 2002 г.

МУК 4.2.2029-05. Санитарно-вирусологический контроль водных объектов. - М., 2006. 10 с. Ребриков, Д.В. ПЦР «в реальном времени». пре-дисл. Остермана Л.А. и акад. РАН и РАСХН Свердлова Е.Д.; 2-е изд., испр. и доп. Лаборатория знаний / Д.В. Ребриков, Г.А. Саматов, Д.Ю. Трофимов и др. - М.: БИНОМ, 2009. 223 с.

APPLICATION OF MEMBRANES WITH POSITIVE SURFACE CHARGE FOR SANITARY AND VIROLOGIC WATER CONTROL

© 2012 A.V. Tarasov2, Yu.A. Fedotov2, S.A. Lepeshin2, Yu.T. Panov1, K.V. Okulov1, A.I. Vdovina1

1 Vladimir State University named after A.G. and N.G. Stoletov 2 JSC "NPP Tekhnofiltr"

JSC NPP "Tekhnofiltr" was developed the method of concentrating the viruses from water with use of microfiltrational polyamide membranes possessing positive surface charge, meeting the modern requirements of carrying out virologic water control. Researches the process of concentrating viruses are carried out to Scientific Research Institute named after Sysin from waters of various origin from positively charged microfiltrational membrane of MMPA +-0.2 type and their high performance is established.

Key words: virus pollution of water, definition methods, cleaning methods, polyamide microfiltrational membranes

Alexander Tarasov, Candidate of Chemistry, Director. E-mail: OM. [email protected]

Yuriy Fedotov, Candidate of Chemistry, Senior Research Fellow.

E-mail: [email protected]

Ergey Lepeshin, Post-graduate Student

Yuriy Panov, Doctor of Technical Sciences, Professor at the

Polymeric Materials Department. E-mail: [email protected]

Kirill Okulov, Post-graduate Student

Anastasiya Vdovina, Post-graduate Student

2376