CC BY
18Ветеринарный врач. 2022 . № 4 . С. 41- 48 The veterinarian. 2022; (4): 41- 48
Научная статья
УДК 619: 616. 98: 579
DOI 10.33632/1998-698Х_2022_5_41
Совершенствование способов получения и паспортизации перевиваемых
линий клеток почки теленка
Ирина Николаевна Матвеева1, Анастасия Алексеевна Ночевная4, Вера Михайловна Попова1, Борис Леонидович Манин2, Виктор Тимофеевич Ночевный3
^«Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности», Россия, пос. Биокомбината, vnitibp@mail.ru
2«Федеральный центр охраны здоровья животных», Россия, г. Владимир manin.boria@yandex.ru
3 «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов»
4 Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Автор, ответственный за переписку: Ирина Николаевна Матвеева, vnitibp@mail.ru
Аннотация: В статье представлены данные о возможности и условиях получения, паспортизации перевиваемой линии клеток почки телят с целью применения в производстве противовирусных препаратов. В процессе становления перевиваемой клеточной культуры проведены исследования по сравнению морфогенетических и культуральных свойств клеточных линий, происходящих от крупного рогатого скота (Bos taurus). В результате длительных исследований были определены оптимальные условия по трансформации изолированных клеток почки телят, получению и паспортизации новой линии клеток RBT, которая не уступает по чувствительности к возбудителям вирусных инфекций крупного рогатого скота. Практическое применение новой линии клеток позволит расширить возможности по стандартизации для серийного производства вакцин с целью профилактики вирусных заболеваний крупного рогатого скота.
Ключевые слова: перевиваемые и первичные линии клеток, чувствительность к вирусам, паспортизация, кариотип.
Improving the methods of obtaining and certification of the interwoven linescalf kidney cells
Irina N. Matveeva1, Anastasia A. Nochevnaya4, Vera M. Popova1, Boris L. Manin2, Viktor T. Nochevny3
'"All-Russian Scientific Research and Technological Institute of Biological Industry", Russia, village, Bioplant, vnitibp@mail.ru
2"Federal Center for Animal Health Protection", Russia, Vladimir manin. boria@yandex.ru
3 "All-Russian State Center for Quality and Standardization of Medicines for Animals and Feed"
4 The first St. Petersburg State Medical University named after Academician I.P. Pavlov Corresponding author: Irina Nikolaevna Matveeva, vnitibp@mail.ru
Abstract. The article presents data on the possibility and conditions for obtaining, certification of a transplanted calf kidney cell line for the purpose of using it in the production of antiviral drugs. In the process of establishing a continuous cell culture, studies were carried out to compare the morphogenetic and cultural properties of cell lines originating from cattle (Bos taurus). As a result of long-term studies, optimal conditions were determined for the transformation of isolated calf kidney cells, obtaining and certification of a new RBT cell line, which is not inferior in sensitivity to pathogens of viral infections in cattle. The practical application of the new cell line will expand the possibilities for standardization for the mass production of vaccines to prevent viral diseases in cattle.
Keywords: transplantable and primary cell lines, virus sensitivity, certification, karyotype.
Введение. Разработка и серийное производство более эффективных противовирусных препаратов предполагает применение стандартных по ростовым свойствам и чувствительности к вирусам перевиваемых линий клеток, отвечающих требованиям GMP. Использование паспортизации линий клеток приведет к повышению эффективности и экономичности производства противовирусных препаратов. Обоснование производства и контроля активности вирусных антигенов основано, как правило, на результатах паспортизации культуральных моделей в соответствии с требованиями ВОЗ и РД 42-28-10-89 [1-3].
Широкий размах варьирования числа хромосом, отсутствие выраженной стволовой линии клеток и чувствительности к вирусам обуславливают не только генетическую и функциональную гетерогенность тест - культуры, но и наличие внутри популяции клеток различных контаминантов, отличающихся по биологическим свойствам и уровню чувствительности к вирусам - контаминантам. Указанные данные подтверждены многочисленными исследованиями по клонированию и паспортизации тест - культур [4, 5].
Существенной проблемой применения перевиваемых линий клеток в производстве противовирусных вакцин является возможная контаминация тест - культур бактериальными, вирусными и микоплазменными контаминан-тами. Основным источником инфицирования тест - культур являются сыворотки крови животных. Деконтаминация перевиваемых линий клеток от вирусов и микоплазм весьма трудоемкая задача, но в последние годы успешно решается [7-9]. Для стабилизации биологических свойств перевиваемых линий клеток и получения, более стандартных в генетическом отношении тест - культур широко применяют методы очистки, клонирования и оценки чувствительности перевиваемых линий клеток к модельным вирусам с целью получить популяцию вирусных препаратов, отвечающих требованиям GMP. Цель данной работы состояла в совершенствовании способов получения и паспортизации перевиваемой линии клеток почки телят.
Материал и методы. В качестве источника получения первично - трипсинизиро-ванных клеток была использована почка, полученная от клинически здорового теленка 2-х месячного возраста. Серийное пассирование
тест - культуры осуществляли стационарным монослойным и роллерным способом в течение 3-5 суток с использованием питательной среды на основе раствора Эрла - 0,4 % ГЛА с добавлением 0,3 г/л глютамина и витаминов, 10 % фетальной сыворотки крови. Отделение клеток от субстрата осуществляли смесью 0,25% раствора трипсина и 0,02% версена, взятых в соотношении 1:1. Подсчет изолированных клеток проводили традиционно в камере Горяева. Предварительно суспензию изолированных клеток окрашивали 0,2% раствором трипанового синего. Посевная концентрация клеток составляла 100-300 млн/мл. Качество тест - культур оценивали микроскопически с использованием инвертированного микроскопа Olimpus (Япония). В качестве криоконсерванта применяли ДМСО или этиленгликоль в концентрации соответственно 7-10% и 7%. Ростовой потенциал и идентификацию образцов первичной тест - культуры и линии клеток RBT (Rene Bos taurus) оценивали с использованием морфологических и карио-логических показателей по Мурхеду [10]. Изофермент (ЛДГ) исследовали методом электрофореза в ПААГ, окраску - согласно общепринятым методикам. Морфология натив-ных клеток оценивалась с помощью фазово-контрастной и люминисцентной микроскопии.
Результаты и обсуждение. В результате исследований из нормальной ткани почки телят с использованием диспергирующего раствора была получена суспензия изолированных клеток. При посевной концентрации 300 тыс. клеток в мл образование монослоя с высоким ростовым потенциалом наблюдали на 5 сутки культивирования. Для выращивания культуры клеток применялась питательная среда. На первом этапе урожай клеток монослойным и роллерным методами достигал соответственно 100-150 млн и 250300 млн/мл на 4-5 сутки культивирования. На 2 пассаже монослой формировался на 3-4 сутки, а урожай клеток резко снижался. Морфология тест-культур отличалась изоморфизмом, а количество полиплоидов (гигантс-ких клеток) не превышало 2%. В стационарной фазе роста мембраны клеток слабо контрасти-ровались и формировался псевдосинцитий. Анализ изоферментов ЛДГ подтвердил видовую идентичность данной тест - культуры перевиваемой линии клеток Bos Taurus L и изолированных клеток почки теленка (рисунок 1).
Рисунок 1 - Схема спектра изоферментов культуры (RBT).
Спектр линий изоферментов ЛДГ, представленный на схеме для первичной культуры клеток ПТ (почка теленка), полностью идентичен таковым для новой перевиваемой культуры клеток из почки теленка - RBT.
При использовании синтетических и полусинтетических сред Игла MEM, ПСП отмечали резкое снижение митотической активности клеток. Это обусловлено тем, что для размножения клеток in vitro требуются низкомолекулярные полипептиды, которых недостаточно в составе синтетических питательных сред. После 3 пассажа клетки выращивали в
ЛДГ первичной культуры (ПТ) и постоянной
течение 10 суток с кратностью пересева 1:1 -1:2. В этот период клетки монослоя резко увеличивались в размерах, митотическая активность существенно снижалась, а пересевы проводились с интервалом 10 суток. В 11 пассажей субкультуры характеризовались полиморфизмом: наблюдались фибробластоподоб-ные, эпителиоподобные, веретенообразные и полигональные клетки. Кариотип сохранялся как и у первичной культуры почки теленка-диплоидный 60 хромосом с отсутствием У хромосомы у 90% клеток (рисунок 2).
ВДВ»
Рисунок 2 - Диплоидный кариотип первичной культуры ПТ (почка телёнка), 1 пассаж. 60 хромосом (до 90%).
С 11 по 25 пассаж фибробластоподобные клетки постепенно элиминируются, а в монослое преобладают крупные эпителиопо-добные и веретенообразные клетки. К 30 пассажу отмечена тенденция к изоморфизму.
Фибробластоподобные клетки укрупняются и элиминируются. Появляются остравки эпите-лиоподобных клеток небольшого (20 мкм) размера, которые активно разрастались в большие колонии и вытесняли фибробластоподоб-
ные клетки. В популяции клеток появляются 12 метацентрические хромосомы.
С этого периода культивируемые клетки стали адаптироваться к средам Игла МЕМ, и ПСП с 10% фетальной сыворотки, а к 50-52 пассажу полностью адаптировались и успешно размножались с использованием данной среды. Популяция клеток состояла преимущественно из эпителиоподобных клеток, а фибробластоподобные клетки почки полностью элиминировались, но появились гигантские клетки, которые сохранялись в пассажах.
В кариотипе клеток появились 6-7 мета - субметацентрических аутосом, а модальный класс сформировался в пределах 50-54
хромосом. Полиплоиды и гигантские клетки составляли 6-8%.
К 65 пассажу ростовой потенциал многократно увеличивался, рассев клеток осуществлялся в соотношении 1:4 - 1:8; а модальный класс стабилизировался на уровне 51 хромосомы в 33% клеток, а также 9-10 мета- и субметацентрических аутосом, которые являются маркерами перевиваемых линий клеток.
Кариологическое изучение клеток на 65 и 81 пассажах показало, что модальный класс стабилизировался на уровне 51 хромосомы, появились 10 мета- и субметацентрические хромосомы, которые являются маркерами новой клеточной культуры (Рис.3 и 4).
Рисунок 3 - Идиограмма кариотипа линии клеток RBT
Рисунок 4
- Метафазная пластинка клеточной линии RBT
- 51 хромосома
Клетки монослоя отличались изоморфизмом эпителиоподобных и веретенообразных клеток, а количество полипептидов уменьшилось до 1%. Ядра клеток были в основном округлой формы и содержали 1 -2 крупных ядрышка (Рис.5). В стационарной фазе роста формируются псевдосинцитии. Анализ изо-ферментов ЛДГ первичных культур клеток почек теленка полностью подтвердил идентичность полученной линии, что подтверждает видовое происхождение тест - культуры RBT из почки теленка (Bos Taurus).
При длительном хранении перевиваемые линии клеток нестабильны по морфологическим и генетическим показателям, а также по чувствительности к модальным вирусам, что приводит к дополнительным затратам и потере особо важных маркированных показателей тест - культур. Для хранения и сохранения основных показателей перевива-
емой линии клеток RBK были созданы эталонный и рабочие банки в жидком азоте. Полученные образцы тест культур сохраняли эпителиальную и полигональную форму с округлыми ядрами и с 3-4 ядрышками.
Образцы линии клеток RBT 67 - 94 пассажа были заложены на длительное хранение в криобанк ФГБУ «ВНИИЗЖ» под названием «Линия клеток почки теленка (Bos Taurus) RBT- Rene Bos Taurus»; и депонированы в коллекции соматических клеток сельскохозяйственных и промысловых животных Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии РККК (П) СХЖ РАСХН) под № 74.
Динамика формирования клеточной линии RBT (Rene Bos Taurus) из первичной культуры ПТ (почки телёнка) представлена в таблице 1.
На заключительном этапе исследований в сравнительном аспекте оценивали пригодность и перспективность аттестованной линии клеток RBT и первичной культуры клеток почки теленка ПТ (контроль) к вирусам инфекционного ринотрахеита (ИРТ), пара-гриппа-3 (ПГ-3) и вирусной диареи (ВД) крупного рогатого скота. Доза заражения, условия и сроки культивирования вирусов были оптимальными (таблица 2).
В результате исследований было достоверно показано, что исследуемые тест -культуры клеток характеризовались высокой чувствительностью и обеспечивали равноценное накопление вирусов инфекционного ринотрахеита, ПГ-3 и вирусной диареи (ВД) крупного рогатого скота, как в первичной
ткани, так и перевиваемой линии клеток RBT. Это свидетельствует о пригодности и перспективности полученной RBT и аттестованной ПТ линии клеток в качестве клеточного субстрата для серийного производства противовирусных препаратов и вирусных антигенов [11].
Заключение. В процессе становления клеточной культуры мы проводили исследования по сравнению морфогенетических и культуральных свойств клеточных линий, происходящих от крупного рогатого скота (Bos taurus). Особенно нас интересовало трансформации кариотипа культуры и связь этих изменений с культуральными свойствами.
Оказалось, что произошедшие изменения кариотипа RBT сравнимы с состоянием этого признака у культур клеток MDBK и FBI.
Таблица 2. Сравнительная оценка чувствительности культуральных моделей к вирусам инфекционного ринотрахеита (ИРТ), парагриппа (ПГ-3) и диареи (ВД).
Наименование вируса и его штамма Накопление вируса (lg ТЦД50/мл)
Культуральная модель
RBT ПТ (контроль)
ИРТ (штамм «ТК-А (ВИЭВ) В2») 7,6 ±0,04 7,33± 0,0,10
ПГ-3 (штамм «3КСМ (ВГНКИ)») 7,47±0,06 7,10 ± 0,10
ВД (штамма «Oregon C24V») 6,5 ±0,17 6,3± 0,13
Таблица 1 - Динамика формирования клеточной линии RBT (Rene Bos Taurus) из первичной культуры ПТ (почки телёнка)
Пассаж Урожайность клеток (млн) с площади 300см2 Посевная концентрация с площади 300 см2 Длительность культивирования сутки Ростовая питательная среда Кариотип. Модальный класс Морфология клеток
1 50 100 тыс/мл 5-7 0,4 ГЛА на Эрла 10% фе-тальной сыворотки 60 Полиморфные с преобладанием веретено-
образных клеток
0,4 ГЛА на Эр- Полиморфные с преоблада-
11 15-20 50 тыс/мл 5 ла 10% фе-тальной сыворотки 59-60 нием веретенообразных клеток и фиб-робластов
31 25 50 тыс/мл 4 МЕМ+0,4 ГЛА 10% фетальной 58-60 Полиморфные с преобладанием веретенообразных и фиброблас-тов, появление эпителиоподоб ных клеток
сыворотки
52 50-100 100 тыс/мл 2-3 МЕМ 10% фетальной сыворотки 53-54 Полиморфные с преобладание эпителиоподоб ных клеток
МЕМ 10% Преобладание
65 100-200 50-100 тыс/мл 2-3 фетальной сыворотки 51 эпителиоподоб ных клеток
У этих культур также в кариотипе до 10 мета- и субметацентрических хромосом и модальный класс колеблется от 50 до 54 хромосом [6]. По нашему мнению, в культурах коровьего происхождения в определенных условиях запускается механизм центрических соединений между акроцентрическими хромосомами. Эти изменения стабилизируются, когда в культуре образуются 4-5 пар таких соединений. По нашим наблюдениям, этот факт коррелируется с повышением продуктивности клеточных культур коровьего происхождения и стабилизацией культуральных
свойств. У клеточной линии проявляется чёткая «тропность» к вирусам крупного рогатого скота. По литературным данным, формирование неограниченного роста клеток формируется на эпигенетическом уровне механизмом возобновляемого метилирования гетеро-хроматина в центромерах хромосом. По нашему предположению, образование центрических соединений акроцентрических хромосом увеличивает зону метилирования центро-мерного гетерохроматина аутосом, которые имеют стабильный воспроизводимый в пассажах генетический статус.
Таким образом, в результате длительных исследований были определены оптимальные условия по трансформации изолированных клеток почки телят, получению и паспортизации новой линии клеток ЯВТ, которая не уступает по чувствительности к возбудителям вирусных инфекций крупного рогатого скота. Кроме того, определены оригинальные закономерности по трансформации первичных клеток почки теленка и становлению пере-
виваемой линии клеток ЯВТ, а также ее паспортизации в соответствии с требованиями международных стандартов. Практическое применение новой линии клеток позволит расширить возможности по стандартизации и повышению востребовательности тест -культур для серийного производства вакцин и профилактики вирусных заболеваний крупного рогатого скота.
Список источников
1. Методические указания (РД 42-28-10-89) по аттестации перевиваемых клеточных линий субстратов производства и контроля медицинских иммунологических препаратов. - М., 1989.
2. Требования к перевиваемым линиям клеток, используемым для производства биологических препаратов //Комитет экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов. Серия технических докладов ВОЗ № 745. - М., 1988. - С. 85-89.
3. Методические рекомендации о порядке аттестации и поддержания перевиваемых линий клеток, используемых для культивирования вирусов, производства иммунологических препаратов ветеринарного назначения. //Новые методы исследований по проблемам ветеринарной медицины (РАСХН). - М., 2008. Ч. 4. С.422-438.
4.Сравнительная оценка эффективности методов паспортизации перевиваемых линий клеток / Е. В. Маркова, В. Т. Ночевный, Б. Л. Манин, И. Н. Матвеева // Ветеринария и кормление. - 2021. -№ 1. - С. 31-34. - DOI 10.30917/ATT-VK-1814-9588-2021-1-9. - EDN XTFSFX.
5. Манин Б.Л., Михалишин В.В., Ночевный В.Т., Белик Е.В. Паспортизация и стандартизация сублинии клеток ВНК-21 методом проточной цитометрии / Вопросы биотехнологии. 2011.- Т. 9. 270-281с.
6. Манин Б.Л., Коропова Н.В., Трофимова Е.А. Получение постоянной клеточной линии RBT из почек теленка/ Труды Федерального центра охраны здоровья животных.2015. Том 13.-№1.-с.164-180
7. Каталог. Российская коллекция клеточных культур (РККК). - СПб, 2004, 315с. 8. Методы культивирования клеток. /Под ред. Г.П. Пинаева, М.С. Богдановой. - СП б.: Изд-во Политехн. ун-та, 2008. - 278 с.
9. Фреши Л. Культура животных клеток. - М: Бином, 2022. - 691с.
10. Chromosome preparations of leucocytes cultured from human peripheral flood /P.S. Moorhead, P.C. Novell, W.J. Melman [et al.] // Exper. Cell. Res/ - 1960. - Vol. 20. - P. 613 - 616.
11. Пат. 2488631 Российская Федерация, МПК (2010.01) С 12N 5/07 (2006/01) A 61K 39/12 K почки телёнка Bos taurus RBT (Rene Bos taurus) для репродукции вируса животных / Б. Л. Манин,
H.В. Коропова, Е.Г. Кузнецова [и др]; ФГБУ «ВНИИЗЖ».-№2012126700/10; заявл. 26.06.12; опубл. 27.07.13.
References
1. Guidelines (RD 42-28-10-89) for the certification of continuous cell lines of substrates for the production and control of medical immunological preparations. - M., 1989.
2. Requirements for transplantable cell lines used for the production of biological products // WHO Expert Committee on Standardization of Biological Products. A series of WHO technical reports No. 745. -M., 1988. - S. 85-89.
3. Guidelines on the procedure for certification and maintenance of transplantable cell lines used for the cultivation of viruses, the production of immunological preparations for veterinary purposes. //New research methods on problems of veterinary medicine (RAAS). - M., 2008. Part 4. S.422-438.
4. Markova E.V., Nochevny V.T., Manin B.L., Matveeva I.N.// Veterinary and feeding. - 2021. - No.
I. - P. 31-34. - DOI 10.30917/ATT-VK-1814-9588-2021-1-9. - EDN XTFSFX.
5. Manin B.L., Mikhalishin V.V., Nochevny V.T., Belik E.V. Certification and standardization of the VH-21 cell subline by flow cytometry / Questions of biotechnology. 2011.- T. 9. 270-281s.
6. Manin B.L., Koropova N.V., Trofimova E.A. Obtaining a permanent RBT cell line from calf kidneys / Proceedings of the Federal Center for Animal Health. 2015. Volume 13.-No. 1.-p.164-180.
7. Catalog. Russian Collection of Cell Cultures (RKKK). -St. Petersburg, 2004, 315s.
8. Cell culture methods. /Ed. G.P. Pinaeva, M.S. Bogdanova. - SP b.: Publishing House of the Polytechnic. un-ta, 2008. - 278 p.
9. Fresh L. Culture of animal cells. - M: Binom, 2022. - 691p.
10. Chromosome preparations of leucocytes cultured from human peripheral flood /P.S. Moorhead, P C. Novell, W.J. Melman [et al.] // Exper. cell. Res/ - 1960. - Vol. 20. - P. 613 - 616.
11. Pat. 2488631 Russian Federation, IPC (2010.01) C 12N 5/07 (2006/01) A 61K 39/12 K calf kidney Bos taurus RBT (Rene Bos taurus) for animal virus reproduction / B.L. Manin, N.V. Koropova, E.G. Kuznetsova [and others]; FGBU "ARRIAH". -No. 2012126700/10; dec. 06/26/12; publ.27.07.13.
Вклад авторов:
А.А. Ночевная, Б.Л. Манин - разработали исследование; Б.Л. Манин, И.Н. Матвеева, В.М. Попова -провели эксперименты; Б.Л. Манин, В.Т. Ночевный, Н.А. Беликова - проанализировали данные и написали рукопись.
Все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов
Contribution of the authors:
A.A. Nochevnaya, B.L. Manin - developed the study; B.L. Manin, I.N. Matveeva, V.M. Popova - conducted experiments; B.L. Manin, V.T. Nochevny, N.A. Belikova - analyzed the data and wrote the manuscript. All authors have made an equivalent contribution to the preparation of the publication. The authors contributed equally to this article. The authors declare no conflicts
© Ночевная А.А., Манин Б.Л., Матвеева И.Н., Попова В.М. Ночевный В.Т., Беликова Н.А., 2022
