CC BY
38УДК 619:616.98:578.824.11 DOI 10.33632/1998-698Х.2020-2-21-26
ВЫДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ИЗОЛЯТА ВИРУСА БОЛЕЗНИ АУЕСКИ
1'2 Лоивская О.Ю. - аспирант, хЛюлькова Л.С. - доктор биологических наук, хМаркова Е.В. - кандидат сельскохозяйственных наук, 1Матвеева И.Н. - доктор биологических наук, профессор, 1Преображенская А.С. - соискатель
:ФГБНУ Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности (141142, Московская область, пос. Биокомбината, ВНИТИБП, е-mail: biolog1967@mail.ru)
2ФКП «Щелковский биокомбинат» (141142, Московская область, пос. Биокомбината, е-mail: LoivskayaOY@biocombinat.ru)
Статья посвящена выделению и идентификации изолята вируса болезни Ауески. Изолят вируса был выделен от кота, павшего на территории г. Москвы, от болезни Ауески в перевиваемой культуре клеток почки телёнка MDBK. В результате установлено, что изолят вируса высоко патогенен для лабораторных животных: кроликов, морских свинок и крыс. К изоляту вируса были чувствительны другие перевиваемые клеточные линии: Таыгш-1 и ВНК-21. Характер ЦПД в разных культурах клеток был одинаковым. Способность к репродукции в культуре клеток изучаемого изолята вируса достигала максимума к 4-6 пассажу и составляла 6,81-7,61 ¡^ТЦД5С/см3. Наличие вируса болезни Ауески подтверждено биопробой и другими лабораторными методами, в том числе ПЦР. Метод ПЦР позволил выявлять геном вируса в вирусосодержащем культуральном и в органно-тканном материале. Неспецифических реакций не наблюдалось. ПЦР-продукты обнаруживали ожидаемого размера. Вирусосодержащий материал изолята вируса болезни Ауески используется при изучении биологических и молекулярно-биологических свойств.
Ключевые слова: изолят вируса, культура клеток, репродукция, болезнь Ауески, цитопатическое действие, инфекционная активность, ПЦР.
Болезнь Ауески — острая вирусная болезнь домашних и некоторых диких животных, в том числе пушных зверей и грызунов, характеризуется лихорадкой, воспалением легких, признаками поражения головного и спинного мозга, что проявляется различными нервными расстройствами (сильное возбуждение, судороги, параличи), сильными зудом и расчесами у всех животных кроме свиней, норок и соболей. Болезнь Ауески распространена практически по всему миру и наносит большой экономический ущерб животноводству развитых стран. Возбудителем болезни является вирус, относящийся к семейству Herpesviridae, подсемейству Alphaherpesvirinae. Свиньи являются естественным хозяином вируса, остаются пожизненными его носителями, причем в любой момент возможна реактивация латентного возбудителя (Mu'ller et al.,2011).
Для культивирования вирусов перспективны перевиваемые линии клеток, так как обеспечивают получение больших объёмов вирусосодержащего материала, который при-
меняется при исследовании биологических, молекулярно-генетических свойств вируса, а также используется в качестве лабораторной модели для изучения эволюции вируса, разработки средств диагностики и специфической профилактики (Fonseca et al., 2010; Steinrigl A. et al.,2012).
Целью настоящей работы было выделение и идентификация изолята вируса болезни Ауески.
Материал и методы. В исследованиях использовали изолят вируса болезни Ауески, который был выделен в г. Москва от кота. В работе использовали перевиваемую линию клеток почки теленка: MDBK. В качестве ростовых и поддерживающих сред применяли среды Игла, МЕМ отечественного и импортного производства. Из органов павшего от болезни Ауески кота (печень, лёгкие, лимфатические узлы, селезёнка) готовили 10 % суспензию в среде Игла (МЕМ; «Sigma», США, «^Clone», США) с добавлением антибиотиков (пенициллин и стрептомицина по 200-1000
ЕД на 1 мл, нистатина 20 ЕД на 1 мл). После осветления центрифугированием при 2000 об/мин суспензию вносили в культуральные флаконы со сформировавшимся монослоем клеток. Через 1 ч после адсорбции суспензию удаляли, вносили поддерживающую среду, содержащую 2% сыворотки крупного рогатого скота, и инкубировали до появления характерных признаков цитопатического действия вируса (ЦПД). Состояние монослоя клеток для определения ЦПД вируса оценивали при просмотре культуральных флаконов под инвертированным микроскопом Olympus CKX31 («Olympus Co.», Япония). Инфекционную активность вируса определяли титрованием в 1-2- суточных культурах перевиваемых линий клеток, выращенных в 96-луночных микропланшетах. Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча и выражали в lg ТЦД50/см3. Нуклеиновые кислоты выделяли с использованием набора «РИБО-сорб» (ООО «ИнтерЛабСервис», Россия). Материалом для
постановки ПЦР служили пробы культураль-ной вируссодержащей жидкости, органов кролика, инфицированного полевым изолятом болезни Ауески, мозга ягнёнка и трупа кота, павшего от штамма вируса псевдобешенства, циркулирующего на территории г. Москвы. Конструирование специфических праймеров проводили с использованием программ Primer Select (DNASTAR). В качестве генетического маркера был выбрана нуклеотидная последовательность гена, кодирующего glycoprotein D. Предварительную оценку специфичности праймеров и ампликонов проводили с использованием «BLAST» (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Синтез праймеров осуществляли в НПФ «Литех». Результаты ПЦР учитывали путём анализа продуктов амплификации методом электрофореза в 1-2% геле агарозы.
Результаты исследований. Характер ЦПД выделенного изолята вируса в культуре клеток MDBK представлен на рисунке 1.
А
ШХ-&
SÄ
ШШ
WW-
В
шЛ
о
Рисунок 1 - Цитопатическое действие вируса в перевиваемой линии клеток: А— контрольная культура клеток, В — культура клеток на 3-и сут после заражения (увеличение 'Л150, микроскоп Olympus CKX31, «Olympus Co.», Япония).
В процессе наработки вирусного материала изолята вируса болезни Ауески в моно-слойной перевиваемой культуре клеток МББК установили, что к 4-6 пассажам вирус достигал максимальных титров. Оценивали величину накопления инфекционности вируса по наступлению 70-90% цитопатического эффекта. Репродуктивная способность изучаемого изолята вируса достигала максимума к 46 пассажу и составляла 6,81-7,61 ^ТЦД50/см3. И дальнейшее пассирование не повышало исходной активности. Полученные результаты
свидетельствуют, что динамика адаптации изолята вируса не имела существенных различий, и после адаптации изолят вируса стабильно сохраняли свойственный ему уровень репродуктивной активности в течение всего периода исследований.
Исследования по определению оптимальной заражающей дозы проводились в трех повторностях, с последующим определением биологической активности вируссодержащих суспензий. Результаты проведённых исследований представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Накопление изолята вируса болезни Ауески в культуре клеток MDBK, в
зависимости от инфицирующей дозы и сроков культивирования, (п=3)
Множествен ность заражения ТЦД50/см3 Биологическая активность в ^ ТЦД50/см3 в различные сроки культивирования, час
12 24 36 48 60 72
0,0001 2,30±0,06 3,30±0,21 4,4±0,07 4,7±0,19 4,1±0,08 3,56±0,12
0,001 3,20±0,21 3,6±0,12 4,00±0,09 4,83±0,14 4,5±0,08 4,2±0,15
0,01 4,10±0,07 5,7±0,09 6,75±0,19 7,00±0,13 6,83±0,03 6,55±0,20
0,1 5,20±0,14 5,76,20 6,5±0,18 6,84±0,02 7,05±0,09 6,84±0,15
1,0 5,6±0,03 6,30,15 7,00±0,12 6,75±0,14 6,5±0,12 6,20±0,14
Как следует из данных таблицы 1, уровень накопления вируса в культуре клеток, инфицированной в дозах 0,0001 и 0,001 ТЦД50/мл, достигал максимума через 48 ч и затем снижался. Активность вирусного материала из проб, инфицированных в дозе 1,0 ТЦД50/см3, достигала максимума через 36 ч и затем также отмечалась тенденция к снижению. При инфицировании клеток вирусом в дозе 0,01 -0,1 ТЦД50/см3 максимальный уровень накопления вируса отмечали через 48-60 ч.
Оценку эффективности концентрации сыворотки крови в составе поддерживающей
среды проводили по результатам накопления вируса и состоянию культуры клеток. Результаты исследований представлены в таблице 2. Как следует из данных, представленных в таблице 2, использование в поддерживающей среде 2 и 5% сыворотки крупного рогатого скота существенно не оказывает заметного влияния на активности получаемых вируссодержащих материалов штамма. Титры вируса были в пределах 7,5 ^ ТЦД50/см3. При 1% содержании сыворотки титр вируса был сравнительно ниже и составлял 6,23^ ТЦД50/см3.
Таблица 2 - Накопление изолята вируса в культуре клеток с использованием поддерживающей
среды с различным содержанием нативной сыворотки крупного рогатого скота (п=3)
Концентрация Срок появления ЦПД Период Титр инфекционной
сыворотки крови вируса в культуре культивирования активности вируса, ^ ТЦД50/ см3
крупного рогатого клеток, час вируса, час
скота в
поддерживающей
среде, %
1,0 24 48-72 6,23±0,13
2,0 24 48-60 7,6±0,19
5,0 24 48-60 7,5±0,21
Максимальное накопление вируса в вируссодержащем материале происходило на 48-60 час. Очевидно, что этот период культивирования являлся оптимальным. При этом ЦПД составляло более 90% площади инфицированного монослоя. Сравнительная оценка вирулентности вируса, проведённая на лабораторных животных, показала, что изучаемый изолят вируса высокопатогенен для лабораторных животных: кроликов, морских свинок и крыс. Видовую принадлежность вируса, накапливаемого в культурах клеток, подтверждали выявлением генома методом ПЦР (рис. 2). Подобранные праймеры гибризизовались с нуклеиновыми кислотами ЖУРНАЛ ДЛЯ ПРОФЕССИ
всех исследуемых препаратов, в которых содержался вирус болезни Ауески, и ограничивали продукты амплификации размером 194 п.о., что соответствовало рассчитанному значению. ПЦР позволял выявлять нуклеиновую кислоту вируса болезни Ауески в вирусосодержащем культу-ральном и органно-тканном материале павших домашних животных в количестве не менее 22 пг.
Из результатов, приведённых на рисунке 2, следует, что ПЦР позволяет амплифициро-вать фрагмент целевого гена размером 194 пар нуклеотидов (п.о.) в образцах, содержащих ДНК вируса болезни Ауески. 1В ОТ ПРОФЕССИОНАЛОВ
Рисунок 2 - Обнаружение ДНК вируса болезни Ауески методом ПЦР: дорожки 1, 7 - маркер - фрагмент ДНК известной молекулярной массы; 2- ткань мозга ягнёнка,
3 - вируссодержащей культуральной материал
4 - ткань мозга кота;
5,6 - ткань мозга кролика, инфицированного изолятом вируса (биопроба)
Заключение. Изолят вируса был выделен из проб органов погибшего от болезни Ау-ески кота. К изоляту вируса была чувствительна перевиваемая клеточная линия: MDBK. Способность к репродукции в культуре перевиваемых линиях клеток изучаемого изолята вируса достигала максимума к 4-6 пассажу и составляла 6,81-7,61 ^ТЦД50/см3. Видовую принадлежность вируса, накапливаемого в культурах клеток, подтверждали выявлением генома методом ПЦР и биопробой на кроли-
ках. Полученные экспериментальные данные показали, что только в пробах, (содержащих ДНК вируса болезни Ауески выявляли специфические продукты реакции ПЦР размером 194 п.н.
Вирусосодержащий материал изолята вируса болезни Ауески, полученный в различных культурах клеток, планируется использовать в дальнейших исследованиях для изучения его молекулярно-биологических свойств.
Литература
1. Богомолова, О.А. Чувствительность перевиваемых линий культур клеток Магс-145 и МА-104 к изоляту вируса цирковирусной инфекции свиней / О.А. Богомолова, И.Н. Матвеева, В.М. Попова // Научный альманах. - 2018. - № 5-2(43). - С. 166-169.
2. Маркова, Е.В. Изучение инфекционной активности нецитопатогенного цирковируса свиней 2 типа в реакции непрямой иммунофлуоресценции / Е.В. Маркова, И.Н. Матвеева, О.А. Богомолова, О.А. Гаджимурадов, И.В. Иванов, В.М. Попова, Л.А. Скороходова // Научный альманах. - 2018. - №7-1(45) - С.201-205
3. Матвеева, И.Н. Исследование новой питательной среды для культивирования клеток млекопитающих / И.Н. Матвеева, В.М. Попова, А.Я. Самуйленко, А.С. Дяченко, А.С. Преображенская // Технологии живых систем. - 2016. - № 1.- С. 83-86.
4. Преображенская, А.С. Использование ПЦР для выявления генома возбудителя болезни Ауески в биологическом материале / АС. Преображенская, И.Н. Матвеева, А.С. Дяченко, В.М. Попова // Ветеринария и кормление. - 2014. - № 6. - С. 32.
5. Самуйленко, А.Я. Избранные труды. М.-2013.- 541 с.
6. Fonseca Jr. Molecular epidemiology of Brazilian pseudorabies viral isolates / Jr. Fonseca, A.A. Camargos et al. // Vet. Microbiol. - 2010a. - 141 (3-4). - P. 238-245.
7. Goldberg, T.L. Comparative utility of restriction fragment length polymorphism analysis and gene sequencing to the molecular epidemiological investigation of a viraloutbreak / T.L. Goldberg, R.M. Weigel, E C. Hahn, G. Scherba // Epidemiol. Infect. - 2001. - 126 (3). - P.415-424.
8. Mu'ller, T. Characterization of pseudorabies virus of wild boar origin from Europe / T. Mu'ller, B.G. Klupp, C. Freuling, B. Hoffmann, M. Mojcicz, I. Capua, V. Palfi, B. Toma, W. Lutz, F. Ruiz-Fon, C. Gortarzar, A. Hlinak, U. Schaarschmidt, K. Zimmer, F.J. Conraths, E.C. Hahn, T.C. Mettenleiter // Epidemiol. Infect. - 2010. - 138 (11). - Р.1590-1600.
9. Mu'ller, T. Pseudorabies virus in wild swine: a global perspective / T. Mu'ller, E.C. Hahn, F. Tottewitz, M. Kramer, B.G. Klupp, T.C. Mettenleiter, C. Freuling // Arch.Virol. - 2011. - 156. - Р.1691-1705.
10. Steinrigl, A. Detection and molecular characterization of Suid herpesvirus type 1 in Austrian wild boar and hunting dogs / A. Steinrigl, S. Revilla-Ferna'ndez, J. Kolodziejek, E. Wodak, Z. Bago, N. Nowotny, F. Schmoll, J. Ko'fer // Vet. Microbiol. - 2012. - 157 (3-4). - Р.276-284.
ISOLATION AND IDENTIFICATION OF ISOLATED AUESCI'S DISEASE VIRUS
12 Loivskaya O.Yu. - Graduate student, :Lyulkova L.S. - Doctor of Biological Sciences, :Markova E.V. - Candidate of Agricultural Sciences, :Matveeva I.N. - Doctor of Biological Sciences,
Professor, :Preobrazhenskaya A.S. - job seeker
'Federal State Budgetary Scientific Institution All-Russian Research
and Institute of Biological Industry (141142, Moscow region, village of Biocombinat, VNITIBP, e-mail: biolog1967@mail.ru)
2FKP "Schelkovo Biocombine" (141142, Moscow region, village of Biocombinat, e-mail: LoivskayaOY@biocombinat.ru)
The article is dedicated to isolation and identification of the Aujeszky's disease virus isolate. The virus isolate was isolated from a cat who died in Moscow from Aujeszky 's disease in an inoculated culture of MDBK calf kidney cells. As a result, it was ^ found that the virus isolate is highly pathogenic ^ for laboratory animals: rabbits, guinea pigs and rats. Other transplantable cell lines were sensitive to the virus isolate: Taurus-1 and BHK-21. The nature of the CPP in different cell cultures was the same. The ability to reproduce in the cell culture of the studied virus isolate reached a maximum at passage 4-6 and amounted to 6.81-7.61 lg TCD50 / cm3. The presence of Aujeszky's disease virus is confirmed by bioassay and other laboratory methods, including PCR. The PCR method made it possible to identify the virus genome in virus-containing culture and in organ-tissue material. Nonspecific reactions were not observed. PCR products showed the expected size. The virus-containing material of the Aujeszky's disease virus isolate is used in the study of biological and molecular biological properties.
Keywords: virus isolate, cell culture, reproduction, Aujeszky's disease, cytopathic effect, infectious activity, PCR.
References
1. Bogomolova, O.A. The sensitivity of transplanted cell culture lines of Marc-145 and MA-104 to the isolate of the circovirus infection of pigs / O.A. Bogomolova, I.N. Matveeva, V.M. Popova // Scientific almanac. - 2018. - No. 5-2 (43). - Р. 166-169.
2. Markova, E.V. The study of the infectious activity of non-cytopathogenic circovirus of pigs of type 2 in the reaction of indirect immunofluorescence / E.V. Markova, I.N. Matveeva, O.A. Bogomolova, O.A. Gadzhimuradov, I.V. Ivanov, V.M. Popova, L.A. Skorokhodova // Scientific almanac. - 2018. - № 7-1 (45) -Р. 201-205.
3. Matveeva, I.N. Research of a new nutrient medium for the cultivation of mammalian cells / I.N. Matveeva, V.M. Popova, A.Ya. Samuilenko, A.S. Dyachenko, A.S. Preobrazhenskaya // Technologies of living systems. - 2016. - No. 1. - P. 83-86.
