CC BY
78
СОСТОЯНИЕ ГЕНОМА ХОЗЯИНА ПРИ МИГРАЦИОННОМ
АСКАРИДОЗЕ
БЕКИШ О.-Я.Л., БЕКИШ В.Я.
УО «Витебский государственный медицинскийуниверситет»
Резюме. Изучены генотоксические и цитотоксические воздействия метаболитов личинок аскарид на клетки костного мозга и семенников инвазированных мышей при применении щелочного гель-электрофореза единичных клеток. Установлено, что метаболиты личинок Ascaris suum во время инвазии вызывают рост одноцепочных разрывов, щелочно-лабильных сайтов ядерной молекулы ДНК, апоптотических клеток в костном мозге и семенниках экспериментальных животных. Генотоксическое воздействие наблюдается в период высокой биологической активности паразитов, а цитотоксическое - на 14 день инвазии.
Г енотоксическое влияние метаболитов личинок аскарид на соматические и генеративные клетки хозяина усиливается при росте интенсивности инвазии.
Ключевые слова: аскаридоз миграционный, мыши самцы, щелочной электрофорез единичных клеток, клетки костного мозга и семенников, генотоксические и цитотоксические эффекты.
Abstact. The genotoxic and cytotoxic influences of ascarides larvae on the cells of bone marrow and testicles of invasive mice were investigated with alkaline single cell gel electrophoresis use. It was determined, that during invasion Ascaris suum larvae metabolites caused increase of single- strand breaks, alkali- labile sites of nucleus molecule of DNA, apoptotic cells in bone marrow and testicles of experimental animals. The genotoxic influence was observed during the period of high biological activity of parasites. The cytotoxic influence was observed on the 14-th day of invasion. The genotoxic influence of ascarides larvae metabolites on somatic and generative cells of the host is increased when the invasion intensity grows.
Адрес для корреспонденции: Республика. Беларусь. 210023. г. Витебск. пр. Фрунзе. 27. Витебский государственный медицинский университет. кафедра
медицинской биологии и общей генетики. тел. 37-00-30. - Бекиш О.-Я.Л.
Геогельминтозами каждый год болеют более 2 миллиардов людей. среди которых наиболее распространенным считается аскаридоз. Ежегодно заболеваемость этой инвазией доходит до 1.2 миллиарда человек [1]. Наиболее частыми осложнениями этого гельминтоза являются диспептические расстройства. аллергические реакции. анемия. которые могут быть причиной заболеваемости во всем мире и возрастания перинатальной смертности [2]. Специфическое лечение геогельминтозов альбендазолом. мебендазолом. ивермектином может сопровождаться эмбриотоксическим. фетотоксическим. мутагенным и тератогенным воздействиями [2].
Метаболиты мигрирующих личинок аскарид обладают кластогенным воздействием на соматические клетки костного мозга белых мышей. индуцируя в них вторичные повреждения ДНК за счет увеличения уровней микроядросодержащих клеток сперматогенеза. поли- и нормохроматофильных эритроцитов. аберрантных клеток [3]. При применении щелочного гель-электрофореза изолированных клеток нами было установлено. что метаболиты мигрирующих личинок аскарид обладают генотоксическим воздействием на соматические и генеративные клетки мышей-самцов линии СВА. вызывая рост одноцепочечных разрывов. щелочно-лабильных сайтов ядерной молекулы ДНК на 0.98-8.08% в костном мозге и на 5.51-14.92% - в семенниках инвазированных животных [4]. В соматических и генеративных клетках животных при миграционном аскаридозе повышается уровень апоптотических клеток. обусловленный цитотоксическим эффектом инвазии [4]. Наибольшая выраженность цитогенетических нарушений приходится на период активной миграции
личинок аскарид по кровяному руслу (3-14 дни инвазии). Эффект зависит от дозы инвазионного материала. введенного в организм хозяина при заражении
[4. 5].
При миграционном аскаридозе в семенниках мышей повышаются уровни микроядросодержащих клеток сперматогенеза. снижается выход сперматозоидов в придатки. что обусловлено кластогенным и цитотоксическим эффектами инвазии [5]. Наиболее выраженные цитогенетические изменения в клетках хозяина отмечаются на 14-28-й дни инвазии [5]. Изучение изменений уровней первичных повреждений ДНК соматических и генеративных клеток хозяина. а также апоптотических клеток ранее не проводились.
Исследование посвящено изучению возможных генотоксических и цитотоксических эффектов в клетках костного мозга и семенников хозяина при экспериментальном миграционном аскаридозе.
Методы
Исследования проведены на 140 мышах-самцах линии СВА массой 1618 г. Животные были разделенных на четыре группы по 35 животных в каждой. Мышам 1-ой группы (негативный контроль) вводили внутрижелудочно 0.2 мл 2% крахмального геля. Животных второй группы заражали инвазионными яйцами Ascaris suum внутрижелудочно в дозе 5. третьей 20 и четвертой - 40 яиц/г массы тела белых мышей [6]. Забой контрольных и зараженных животных (по 5 на срок наблюдения) проводили путем декапитации на 3. 7. 14. 21. 28. 60 и 90-й дни от начала инвазии. Клеточные суспензии костного мозга и клеток сперматогенеза получали из бедренных костей и семенников мышей [7].
Нами применен метод щелочного гель-электрофореза изолированных клеток (метод ДНК-комет). который проводили по N.P. Singh et al. [8] в модификации B. Hellman et al. [9] и нашими изменениями [3]. при использовании камеры с силовой установкой для электрофореза фирмы Sigma. Время электрофореза составляло 20 минут при силе тока 25В и
напряжении 300мА. Микропрепараты окрашивали раствором этидия бромида и анализировали на люминесцентном микроскопе Микмед-2 фирмы ЛОМО при увеличении 600х. Изображения «комет» получали цифровой фотокамерой Nikon Coolpix-4500.
Повреждения молекулы ДНК определяли при помощи автоматической программы «CASP v. 1.2.2» [10]. В микропрепарате подсчитывалось по 50 клеток, в каждой из которых учитывались следующие показатели генотоксичности: «длина хвоста кометы» в пикселях; процент ДНК в «хвосте кометы»; «момент хвоста», вычисленный программой из «длины хвоста», умноженной на процент ДНК в «хвосте кометы». Для оценки цитотоксического воздействия метаболитов личинок аскарид в 100 случайно выбранных клетках определяли процент апоптотических, имеющих минимальные размеры ядра и большой «хвост кометы».
«Момент хвоста» и уровни апоптотических клеток костного мозга и семенников зараженных животных сравнивался с показателем негативного контроля. Для установления дозозависимого эффекта генотоксического и цитотоксического воздействия метаболитов личинок аскарид сопоставляли с данными животных, инвазированных более низкими дозами. Данные дозы 20 яиц/г сравнивались с показателем дозы 5 яиц/г, а показатель дозы 40 яиц/г - с величинами дозы 20 яиц/г.
Результаты обрабатывались статистически с использованием программы Excel 2002. Рассчитывалась средняя арифметическая и ее стандартное отклонение (M+SD). Достоверность выявленных различий определяли по t-критерию Стьюдента.
Результаты
При проведении метода ДНК-комет в клетках костного мозга контрольных животных во время опыта «длина хвостов комет» варьировала от 7,60+ 2,88 до 8,98+2,01, процент ДНК в «хвостах комет» - от 1,31+0,50 до 3,09+1,72, «момент хвоста» - от 0,14+0,03 до 0,32+0,12 (Рис. 1).
3 день 7 день 14 день 21 день 28 день 60 день 90 день
□ Негативный контроль ■ 5 яиц/г И 20 яиц/г ЕЭ 40 яиц/г
Рис. 1 «Момент хвоста» клеток костного мозга мышей-самцов линии СВА при
/>к # миграционном аскаридозе (* - достоверное отличие от негативного контроля. - от
данных дозы 5 яиц/г. @- от данных дозы 20 яиц/г при Р<0,01-0,05).
При заражении в дозе 5 яиц/г массы тела животных в костном мозге все исследуемые показатели генотоксичности на 3-й день инвазии не отличались от уровня негативного контроля. На 7-й день опыта «длина хвостов комет» в
1,7 раза была выше контрольного уровня. Процент ДНК в «хвостах комет» у зараженных животных превысил в 1,8 раз контрольный показатель. «Момент хвоста» клеток костного мозга инвазированных животных в 1,8 раз был выше контрольного уровня (Рис. 1). К 14-му дню опыта процент ДНК в «хвостах комет» у зараженных животных в 1,5 раз был выше контрольного уровня, тогда как «длина хвостов комет» и «момент хвоста» не отличались от показателей контроля. На 21-й, 28-й, 60-й и 90-й дни опыта все показатели генотоксичности у инвазированных животных не отличались от
контрольных.
У животных, зараженных в дозе 20 яиц/г массы тела в костном мозге все исследуемые показатели генотоксичности на 3-й день инвазии не отличались от уровня негативного контроля. На 7-й день опыта «длина хвостов комет» клеток костного мозга составила 25,60+8,85, что было в 2,9 и в 1,6 раза выше показателей негативного контроля и дозы 5 яиц/г
соответственно. Процент ДНК в «хвостах комет» у зараженных животных) в
2.6 раза превысил контрольный уровень ив 1,5 раза - данные дозы 5 яиц/г. «Момент хвоста» клеток костного мозга был выше контрольного уровня в 3,4 раза, но больше в 1,8 раза, чем при дозе заражения в 5 яиц/г (Рис. 1).
На 14-й день наблюдения «длина хвостов комет» была в 2 раза выше показателя контроля. «Процент ДНК в хвостах комет» составил 5,75+2,54 и в
3.7 раза превысил контрольный показатель, а также в 2,4 раза - данные дозы 5 яиц/г. «Момент хвоста» клеток костного мозга превысил показатели контроля и дозы 5 яиц/г в 6 и 4,6 раз соответственно. В остальные сроки наблюдения все исследуемые показатели генотоксичности не отличались от контроля.При увеличении дозы заражения до 40 яиц/г у животных на 3-й день опыта «длина хвостов комет» клеток костного мозга (12,54+1,93) была выше контрольного уровня в 1,4 раза. Процент ДНК в «хвостах комет» составил 3,26+0,63 и был выше в 1,4 раза, по сравнению с негативным контролем. «Момент хвоста» превысил в 1,8 раза показатель контроля (Рис. 1). На 7-й день инвазии «длина хвостов комет» в 3,9 раза была выше контрольного уровня. Процент ДНК в «хвостах комет» составил 9,81+2,82, что было выше показателей контроля и дозы 20 яиц/г в 4,4 и 1,7 раза соответственно. «Момент хвоста» был выше контроля в 10,8 раза и в 3,2 раза превысил данные дозы 20 яиц/г. На 14-й день наблюдения «длина хвостов комет» составила 30,00+5,39 и была в 3,3 и 1,6 раза выше контроля и показателя дозы 20 яиц/г соответственно.
Процент ДНК в «хвостах комет» превышал контрольный показатель в
6,1 раза. «Момент хвоста» клеток костного мозга был выше контрольного уровня и дозы 20 яиц/г в 14,4 раз и 2,4 раза соответственно. В остальные сроки наблюдения все показатели генотоксичности у инвазированных животных не отличались от контрольных.В клетках семенников контрольных животных во время опыта «длина хвостов комет» варьировала от 11,20+4,44 до 20,40+8,59, процент ДНК в «хвостах комет» был от 2,96+0,86 до 4,93+0,68, «момент хвоста» изменялся в пределах от 0,45+0,27 до 0,80+0,20 (Рис. 2).
6 5 4 3 2 1 0
Рис. 2. «Момент хвоста» клеток семенников мышей-самцов линии СВА при миграционном аскаридозе (*- достоверное отличие от негативного контроля. @- от
данных дозы 20 яиц/г при Р<0,01-0,05).
При дозе заражения 5 яиц/г массы тела животных в семенниках все исследуемые показатели генотоксичности на 3-й, 7-й, 14-й дни инвазии не отличались от данных негативного контроля. На 21-й день опыта процент ДНК в «хвостах комет» превышал контрольный уровень в 3 раза. «Момент хвоста» был в 3 раза выше контрольного показателя (Рис. 2). В последующие дни наблюдения достоверных отличий у зараженных животных по сравнению с контрольными не наблюдалось.
При дозе заражения 20 яиц/г все исследуемые показатели на 3-й и 7-й дни инвазии достоверно не отличались от данных негативного контроля. На 14-й день процент ДНК в «хвостах комет» был выше в 2,3 раза показателя негативного контроля. «Момент хвоста» превышал контрольный показатель в 3 раза (Рис. 2). На 21-й день наблюдения процент ДНК в «хвостах комет» в
4,6 раза, а «момент хвоста» в 5,3 раза превысили контрольные показатели. Процент ДНК в «хвостах комет» и «момент хвоста» в 1,7 и 1,5 раза соответственно превышали показатели дозы 5 яиц/г. В остальные сроки наблюдения данные зараженных животных не отличались от показателей негативного контроля.
3 день 7 день 14 день 21 день 28 день 60 день 90 день □ Негативный контроль ■ 5 яиц/г □ 20 яиц/г В 40 яиц/г
При увеличении дозы заражения до 40 яиц/г у животных все исследуемые показатели на 3-й и 7-й дни наблюдения не отличались от контрольных. На 14-й день процент ДНК в «хвостах комет» у зараженных животных в 2.5 раза был выше. чем в контроле. «Момент хвоста» был выше в
4.5 и 1.5 раза по сравнению с данными контроля и дозы 20 яиц/г соответственно. На 21-й день «длина хвостов комет» у зараженных мышей в
1.6 раза превышала контрольный уровень. Процент ДНК в «хвостах комет» составил 17.88+2.61. что в 6 раз было больше по сравнению с данными контроля ив 1.3 раза - дозы в 20 яиц/г. «Момент хвоста» превышал в 9.8 и
1.8 раза показатели контроля и дозы 20 яиц/г соответственно. В остальные сроки наблюдения данные зараженных животных не отличались от показателей негативного контроля.
При проведении метода ДНК-комет в клетках костного мозга контрольных животных процент апоптотических клеток варьировал от
0.60+0.55 до 1.60+0.89 (Рис. 3).
7 6
5 4
3 2
1 0
3 день 7 день 14 день 21 день 28 день 60 день 90 день
□ Негативный контроль ■ 5 яиц/г И 20 яиц/г ЕЗ 40 яиц/г
Рис. 3. Проценты апоптотических клеток костного мозга мышей-самцов линии СВА при
/>к # миграционном аскаридозе (*- достоверное отличие от негативного контроля. - от
данных дозы 5 яиц/г. @- от данных дозы 20 яиц/г при Р<0.01-0.05).
У зараженных в дозе 5 яиц/г животных процент апоптотических клеток лишь на 7-й день был в 2.3 раза выше контрольного значения (Рис. 3).
При увеличении дозы заражения до 20 яиц/г у животных на 7-й день наблюдения показатель цитотоксичности в 3.6 раза был выше уровня негативного контроля ив 1.6 раза превышал данные дозы 5 яиц/г (Рис. 3). На 14-й день опыта процент апоптотических клеток был в 2.6 раза выше уровня негативного контроля. В остальные сроки наблюдения достоверных отличий у зараженных животных по сравнению с контрольными не наблюдалось.
При проведении метода ДНК-комет в клетках семенников контрольных животных процент апоптотических клеток варьировал от 3,00+1,22 до
11,00+2,24 (Рис. 4).
12
10
8
6
4
2 0
Рис. 4. Проценты апоптотических клеток семенников мышей-самцов линии СВА при миграционном аскаридозе (* - достоверное отличие от негативного контроля, @- от
данных дозы 20 яиц/г при Р<0,01-0,05).
При увеличении дозы заражения до 40 яиц/г на 3-й день наблюдения процент апоптотических клеток был выше данных негативного контроля в
2,2 раза (Рис. 3). На 7-й день опыта показатель цитотоксичности у зараженных животных превышал в 5,6 и 1,5 раза данные негативного контроля и дозы 20 яиц/г соответственно. На 14-й день наблюдения у зараженных животных апоптотических клеток в 3,4 раза было больше по сравнению с контрольным показателем ив 1,3 раза - с данными дозы 20
3 день 7 день 14 день 21 день 28 день 60 день 90 день □ Негативный контроль ■ 5 яиц/г □ 20 яиц/г б 40 яиц/г
яиц/г. В остальные сроки наблюдения достоверных отличий у зараженных животных по сравнению с контрольными не наблюдалось.
У зараженных в дозе 5 яиц/г животных только на 21-й день наблюдения процент апоптотических клеток семенников был выше в 1,7 раза по сравнению с негативным контролем (Рис. 4).
При увеличении дозы заражения до 20 яиц/г на 14-й день уровень апоптотических клеток в 1,4 раза и на 21-й день - в 1,7 раза были выше контрольного показателя (Рис. 4). В остальные сроки наблюдения
достоверных изменений не наблюдалось.
При дозе заражения 40 яиц/г на 14-й день показатель цитотоксичности был в 2,2 и 1,5 раза выше по сравнению с уровнями негативного контроля и дозы заражения 20 яиц/г соответственно (Рис. 4). На 21-й день процент апоптотических клеток был выше негативного контроля и дозы заражения 20 яиц/г в 2,2 и 1,3 раза соответственно. На 3-й, 28-й, 60-й и 90-й дни опыта показатель цитотоксичности у зараженных животных не отличались от данных контроля.
Обсуждение
Таким образом, миграция личинок аскарид сопровождается генотоксическим эффектом как в соматических, так и в генеративных клетках инвазированного хозяина, который характеризуется увеличением количества одноцепочечных разрывов и щелочно-лабильных сайтов ядерной ДНК в клетках костного мозга и семенников in vivo. Рост уровня первичных повреждений ДНК в клетках хозяина был обусловлен повышением числа мелких разрывов ДНК (рост «длины хвостов комет»), процента поврежденной ДНК и основного показателя генотоксичности - «момента хвоста». «Длина хвостов комет» при инвазии повышалась в 1,4-3,3 раза в костном мозге, в семенниках - только в 1,6 раза по сравнению с контролем на 21-й день наблюдения при дозе заражения 40 яиц/г.
Уровень поврежденной ДНК у инвазированных животных возрастал на
0,98-8,08% в костном мозге и на 5,51-14,92% в семенниках по сравнению с
интактными животными. В костном мозге инвазированных животных «момент хвоста» был повышен в 1.8-14.4 раз и в семенниках в 3-9.8 раз по отношению к данным негативного контроля. Наиболее выраженные генотоксические эффекты в клетках костного мозга наблюдались в период активной миграции личинок аскарид в тканях хозяина (3-14 дни инвазии). В семенниках инвазированных животных рост генотоксических повреждений наблюдался с 14-го по 21-й дни опыта.
Это можно связать с тем. что жизненный цикл клеток сперматогенеза длительный и время развития от стволовых сперматогоний до сперматозоидов составляет более 42-х дней [11]. Поэтому рост повреждений ДНК клеток семенников наблюдается с некоторым опозданием по отношению к изменениям в костном мозге.
Генотоксическое влияние аскаридозной инвазии на клетки хозяина зависит от дозы введенного инвазионного материала при заражении и кратно достоверно возрастает при ее увеличении. Дозозависимое воздействие четко прослеживалось на росте “момента хвоста” клеток костного мозга в 1.8 - 4.6 раза при увеличении дозы заражения с 5 до 20 идо 40 яиц/г на 7-й и 14-й дни наблюдения. При увеличении дозы заражения повышение «момента хвоста» наблюдалось также в семенниках инвазированных мышей в 1.6-1.8 раза на 14-й и 21-й дни опыта.
Личинки аскарид во время миграции обладают цитотоксическим воздействием. которое характеризовалось ростом процента апоптотических соматических и генеративных клеток инвазированных животных. Цитотоксический эффект в костном мозге инвазированных животных наблюдался с 3-го по 14-й день и в семенниках - с 14-го по 21-й дни инвазии.
Цитотоксическое воздействие метаболитов личинок аскарид во время инвазии зависело от дозы заражения. При ее увеличении дозы заражения с 5 до 20 яиц аскарид на 1 г массы тела животного на 7-й день в костном мозге отмечался рост апоптоза в 1.6 раза. Дозозависимый цитотоксический эффект метаболитов личинок аскарид (рост процента апоптотических клеток в 1.311
I,5 раза) был установлен также при увеличении дозы заражения с 20 до 40 яиц/г в костном мозге на 7-й, 14-й дни и в семенниках - на 14-й, 21-й дни инвазии.
Заключение
1. Метаболиты мигрирующих личинок аскарид обладают генотоксическим воздействием на соматические и генеративные клетки белых мышей, вызывая рост одноцепочечных разрывов, щелочно-лабильных сайтов ядерной молекулы ДНК на 0,98-8,08 % в костном мозге и на 5,5114,92% в семенниках инвазированных животных.
Генотоксическое воздействие в клетках костного мозга приходится на период миграции паразитов в тканях хозяина на 3-14 дни инвазии, а в семенниках - на 14-й и 21-й дни после заражения и возрастает в 1,6-4,6 раза при увеличении дозы введенного инвазионного материала при заражении.
2. В клетках костного мозга и семенников животных при миграционном аскаридозе повышается уровень апоптотических клеток, обусловленный цитотоксическим эффектом инвазии. Цитотоксическое воздействие миграции личинок аскарид наблюдается на 3-й, 7-й, 14-й дни инвазии в костном мозге и на 14-й, 21-й дни - в семенниках хозяина. Оно возрастает при увеличении дозы введенного инвазионного материала при заражении в 1,3-1,6 раза.
Литература
1. Soil-transmitted helminthes infections: ascariasis, trichuriasis, and hookworm / J. Bethony [et al] // Lancet. - 2006. - Vol. 368. - P. 1521-1532.
2. Bialek, R. Parasitic infections in preganancy and congenital parasiroses.
II. Helminth infections / R. Bialek, J. Knobloch // Z Geburtshilfe Neonatol. -1999. - Vol. 203, N 3. - P. 128-133.
3. Бекиш, О.-Я. Л. Мутагенный эффект метаболитов мигрирующих личинок аскарид (Ascaris suum) / О.-Я. Л. Бекиш, В. Я. Бекиш // Весщ нацыянальнай акадэмп навук Беларус^ Сер. б1ялапч. навук. - 2000. - № 2. -С. 109-113.
4. Бекиш, В. Я. Генотоксическое и цитотоксическое воздействие миграции личинок свиной аскариды на клетки хозяина / В. Я. Бекиш, В. В. Зорина, О.-Я. Л. Бекиш // Рос. паразитол. журнал. - 2008. - № 2 - С. 2028.
5. Бекиш, В. Я. Микроядерный тест в клетках костного мозга и семенников мышей линии СВ А при гельминтозах / В. Я. Бекиш, В. И. Колмогоров, В. В. Побяржин // Вестник ВГМУ. - 2003. - Т. 2, № 2. - С. 67-72.
6. Бекиш, В. Я. Методика получения культуры инвазионных яиц аскарид / В. Я. Бекиш // Пятый Республиканский съезд специалистов клинической лабораторной диагностики Беларуси: материалы съезда. - Мн., 1997. - С. 140-141.
7. Применение метода щелочного гель-электрофореза изолированных клеток для оценки генотоксических свойств природных и синтетических соединений / А. Д. Дурнев [и др.] // Методические рекомендации / Утв. РАМН и РАСН. - М., 2006. - 27 с.
8. A Simple Technique for quantification of low levels of DNA damage in individual cells / N. Singh [et al.] // Exp. Cell Research. - 1988. - Vol. 175. -P.184-191.
9. Alkaline single cell gel electrophoresis of DNA fragments in biomonitoring for genotoxicity: an introductory study on healthy human volunteers / B. Hellman [et al.] // Int. Arch. Occup. Environ. Health. - 1997. - Vol. 69. -P.185-192.
10. Применение щелочного гель-электрофореза изолированных клеток в эмбриональных тканях мышей / Е. С. Пашинская [и др.] // Достижения фундаментальной, клинической, медицины и фармации: матер. 62-й науч. сессии ВГМУ. - 2007, Витебск. - С. 163-165.
11. Adler, I. D. Comparison of the duration of spermatogenesis between male rodents and humans / I. D. Adler // Mutat. Res. Fund. and Mol. Mech. of Mutagen. - 1996. - Vol. 352. - P. 169-172.
