CC BY
54
Патогенез, патология и экономический ущерб
УДК 619:616.995.132.8-092
ЭМБРИОТОКСИЧЕСКОЕ, ГЕНОТОКСИЧЕСКОЕ И ЦИТОТОКСИЧЕСКОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ МИГРИРУЮЩИХ ЛИЧИНОК СВИНОЙ АСКАРИДЫ НА ХОЗЯИНА
В.В. ЗОРИНА ассистент
О.-Я.Л. БЕКИШ доктор биологических наук В.Я. БЕКИШ доктор медицинских наук Витебский государственный медицинский университет, Республика Беларусь
Метаболиты мигрирующих личинок свиной аскариды при заражении на 1 и 10-е сутки после оплодотворения у белых беспородных мышей (14 и 4-е сутки инвазии) обладают эмбриотоксиче-ским действием к 14-м суткам беременности. Эм-бриотоксический эффект обусловлен повышением уровня постимплантационной гибели в 2,66-4,16 раза, уменьшением средней массы эмбрионов и краниокаудального размера в 1,07-1,3 раза. Миграция личинок аскарид при заражении на 10-е сутки после оплодотворения (4-е сутки инвазии) сопровождается генотоксическим и цитотоксиче-ским эффектом в соматических клетках костного мозга самок и клеток их эмбрионов на 14-е сутки беременности. Инвазия сопровождается увеличением количества одноцепочечных разрывов и щелочно-лабильных сайтов ядерной ДНК в клетках костного мозга на 4,52 % и в клетках эмбрионов на 3,77 %, а также ростом числа апоптотических клеток в 7,2-12,3 раза.
Ключевые слова: личинки; свиная аскарида; эм-бриотоксическое, генотоксическое, цитотоксическое воздействие, белые мыши.
Ежегодно 2 млрд людей болеют геогельминтозами [14]. Наиболее распространенным геогельминтозом является аскаридоз, зараженность которым достигает 1,2 млрд людей ежегодно [10]. Наиболее частым осложнением гельминтозов является анемия, которая служит причиной возрастания перинатальной смертности и заболеваемости во всем мире [11]. Лечение гель-минтозов альбендазолом, мебендазолом, ивермектином и празиквантелем может сопровождаться эмбриотоксическим, генотоксическим, мутагенным и тератогенным воздействиями.
Метаболиты мигрирующих личинок аскарид обладают кластогенным воздействием на соматические клетки костного мозга белых мышей, индуцируя в нем вторичные повреждения ДНК за счет увеличения уровней микроядросодержащих клеток сперматогенеза, поли-, нормохроматофильных эритроцитов и аберрантных клеток [3]. При применении щелочного гель-
75
электрофореза изолированных клеток было установлено, что метаболиты мигрирующих личинок аскарид обладают генотоксическим воздействием на соматические и генеративные клетки мышей-самцов линии СВА, вызывая рост одноцепочечных разрывов, щелочно-лабильных сайтов ядерной молекулы ДНК на 0,98-8,08 % в костном мозге и на 5,51-14,92 % в семенниках ин-вазированных животных [8]. В клетках костного мозга и семенников животных при миграционном аскаридозе повышается уровень апоптотических клеток, обусловленный цитотоксическим эффектом инвазии [5]. Наибольшая выраженность цитогенетических нарушений в соматических и генеративных клетках приходится на период активной миграции личинок аскарид по кровеносной системе (3-14-е сутки инвазии). Эффект зависит от дозы заражения [2, 5, 8]. Влияние личинок аскарид на геном инвазированного хозяина при беременности и на наследственный аппарат эмбриональных клеток, а также эмбриотоксические изменения ранее не изучали.
Цель исследования — изучить эмбриотоксические изменения, а также возможные генотоксический и цитотоксический эффекты в клетках костного мозга беременных самок и клетках их эмбрионов при экспериментальном миграционном аскаридозе в зависимости от срока заражения.
Материалы и методы
Исследования проведены на 30 самках и 10 самцах белых беспородных мышей массой 16-18 г в возрасте 3-4 мес. Животных помещали в клетки в соотношении 3 самки и 1 самец. Скрещивание проводили в течение 24 ч. Наступление беременности у самок определяли по гиперемии наружных половых органов и наличию сперматозоидов в мазке из влагалища. Беременных самок разделили на 3 группы по 10 животных в каждой. Мышам 1-й группы (интактный контроль) вводили внутрижелудочно 0,2 мл 2%-ного крахмального геля. Мышей второй и третьей группы заражали внутрижелудочно в дозе 20 инвазионных яиц Ascaris suum на 1 г массы тела на 1 и 10-е сутки беременности соответственно [1]. На 14-е сутки беременности всех самок убивали путем декапитации и исследовали бедренные кости и матку с эмбрионами. Эмбриотоксические, генотоксические и цитотоксические изменения у инва-зированных самок и эмбрионов второй и третьей групп учитывали на 14 и 4-е сутки с момента заражения соответственно.
Эмбриотоксические изменения определяли с учетом рекомендаций по экспериментальному (доклиническому) изучению репродуктивной токсичности новых фармакологических веществ [6, 9]. У беременных самок в матке определяли число желтых тел, мест имплантации, общее число эмбрионов, число живых и мертвых эмбрионов, число резорбций, среднюю массу эмбрионов в помете и краниокаудальный размер. Использовали бинокулярную лупу МБС 10 и электронные весы Adventurer Pro AV264. Основными показателями эмбриотоксичности считали предимплантационную смертность (разность между числом желтых тел в яичниках и числом мест имплантации в матке) и постимплантационную гибель (разность между числом мест имплантации и числом живых плодов).
Для изучения возможных генотоксических и цитотоксических нарушений в соматических клетках самок и их эмбрионов применяли щелочной гель-электрофорез изолированных клеток или метод «ДНК-комет» [4, 15, 17]. Клеточные суспензии костного мозга и эмбрионов получали по разработанным нами методам [4, 7]. Использовали метод «ДНК-комет» с применением камеры с силовой установкой для электрофореза фирмы Sigma. Время электрофореза составило 20 мин при силе тока 25В и напряжении 300мА. Микропрепараты окрашивали раствором этидия бромида и анализировали на люминесцентном микроскопе Микмед-2 фирмы ЛОМО при увеличении х 600. Изображения «комет» получали цифровой фотокамерой Nikon Coolpix-4500. Повреждения молекулы ДНК определяли при помощи автоматической про-
76
граммы «СASP v. 1.2.2» [16]. В микропрепарате подсчитывали по 50 клеток, в каждой из которых учитывали следующие показатели генотоксичности: «длина хвоста кометы» в пикселях; процент ДНК в «хвосте кометы»; «момент хвоста», вычисленный программой из «длины хвоста», умноженной на процент ДНК в «хвосте кометы».
Для оценки цитотоксического воздействия метаболитов личинок аскарид в 100 случайно выбранных клетках определяли процент апоптотических, имеющих минимальные размеры ядра и большой разбросанный во все стороны «хвост кометы».
Результаты обрабатывали статистически с использованием программы Ехсєі 2002. Рассчитывали среднюю арифметическую и ее стандартное отклонение. Достоверность выявленных различий определяли по ^критерию Стьюдента. Полученные данные у инвазированных самок и их эмбрионов сравнивали с показателями интактного контроля.
Результаты и обсуждение В группе интактного контроля предимплантационная гибель составила 1,24, а постимплантационная - 7,5 % (табл. 1).
У мышей, зараженных в 1-е сутки беременности Л8еагі8 suum в дозе 20 яиц на 1 г массы тела, на 14-е сутки инвазии число желтых тел, мест имплантаций, общего числа эмбрионов достоверно не отличались от контрольных показателей (табл. 1). Число живых эмбрионов достоверно снизилось в 1,34 раза по отношению к интактному контролю. У инвазированных самок наблюдали рост числа резорбций, который составил 0,40+0,52. Количество мертвых эмбрионов увеличилось в 5,75 раз в сравнении с интактным контролем. Средняя масса эмбрионов достоверно снизилась в 1,3 раза, а средний краниокаудальный размер уменьшился в 1,1 раза по сравнению с контролем. У зараженных самок предимплантационная гибель эмбрионов достоверно не изменилась, а постимплантационная гибель в 4,16 раза превышала контрольный показатель.
Таблица 1
Показатели эмбриотоксичности при миграционном аскаридозе у белых
беспородных мышей-самок
Показатель Группа
контроль- ная 14-е сутки инвазии (заражение на 1е сутки беременности) 4-е сутки инвазии (заражение на 10-е сутки беременности)
Количество желтых тел Количество мест имплантации Общее количество эмбрионов Количество живых эмбрионов Количество резорбций Количество мертвых эмбрионов Средняя масса эмбрионов в помете Средний краниокаудальный размер Предимплантационная гибель, % Постимплантационная гибель, % 8,10+1,79 8,00+2,00 7,80+2,04 7,40+1,58 0,40+0,70 0,30+0,08 9,98+0,64 1,24 7,5 8,20+1,32 8,00+1,60 7,80+1,62 5,50+1,08* 0,40+0,52* 2,30+1,16* 0,23+0,03* 9,05+0,75* 2,44 31,25* 8,40+0,97 8,00+1,60 8,00+1,56 6,50+1,84 1,50+0,85* 0,24+0,02* 9,32+0,36* 4,76 20,00*
Примечание. * - достоверное отличие от данных контрольной группы при Р<0,01-0,05.
При заражении на 10-е сутки беременности к 4-м суткам миграции личинок аскарид число желтых тел, мест имплантации, общее число эмбрионов, число живых эмбрионов и резорбций у мышей достоверно не отличались от
77
контрольных значений (табл. 1). Число мертвых эмбрионов достоверно увеличилось по сравнению с контролем в 3,75 раза. Средняя масса эмбрионов и краниокаудальный размер были соответственно в 1,25 и 1,07 раза меньше, чем в группе контроля. У инвазированных животных предимплантационная гибель достоверно не изменилась по отношению к контролю. Постимплантационная гибель увеличилась в 2,66 раза по сравнению с контрольным показателем.
При заражении Л. suum на 1-е сутки беременности в костном мозге самок на 14-е сутки беременности все исследуемые показатели генотоксичности, кроме процента ДНК в «хвостах комет», не отличались от уровня контроля (табл. 2). Последний в 1,7 раза был выше контрольного уровня. Показатель цитотоксичности достоверно не отличался от уровня контроля. В клетках эмбрионов все исследуемые показатели генотоксичности и цитотоксичности не отличались от контрольных значений.
При заражении на 10-е сутки беременности все исследуемые показатели генотоксичности в клетках костного мозга самок достоверно превышали контрольные величины (табл. 2). Так, длина «хвостов комет» составила 10,02+2,81 пикселей и была в 2,7 раза выше контроля. Процент ДНК в «хвостах комет» был выше контрольного показателя в 7,3 раза. «Момент хвоста» был в 13,8 раз выше контрольного уровня. Число апоптотических клеток было выше в 12,3 раза, чем в группе интактного контроля. В клетках эмбрионов длина «хвостов комет» и процент ДНК в «хвостах комет» в 2,3 и 3,6 раза соответственно были выше контрольных показателей. «Момент хвоста» также изменялся и превышал контрольный уровень в 8,2 раза. Число апоптотических эмбриональных клеток было достоверно выше в 7,2 раза контрольного уровня.
Таблица 2
Показатели щелочного гель-электрофореза изолированных клеток при миграционном аскаридозе в костном мозге белых беспородных мышей-
самок и их эмбрионов
Группа Показатель
длина «хвостов комет» (в пикселях) процент ДНК в «хвостах комет» «момент хвоста комет» процент апоптотических клеток
Контрольная Костный мозг самок 3,71+0,39 0,71 0,05+0,03 0,30
Клетки эмбрионов 4,71+0,60 1,43 0,10+0,06 0,90
14-е сутки инвазии (заражение на 1-е сутки беременности) Костный мозг самок 4,25+1,04 1,24* 0,06+0,03 0,70
Клетки эмбрионов 5,01+1,68 1,72 0,09+0,03 0,40
4-е сутки инвазии (заражение на 10-е сутки беременности) Костный мозг самок 10,02+2,81* 5,23* 0,69+0,30* 3,70*
Клетки эмбрионов 11,06+1,70* 5,20* 0,82+0,28* 6,50*
Примечание. * - достоверное отличие от данных контрольной группы при Р<0,01-0,05.
Миграция личинок аскарид сопровождается эмбриотоксическим эффектом на 14 и 4-е сутки инвазии, который характеризуется ростом постимплан-тационной гибели в 2,66 и 4,16 раза соответственно. Постимлантационная
78
гибель возрастала за счет увеличения числа мертвых эмбрионов в 3,75 и 5,75 раза соответственно. Эмбриотоксический эффект миграции личинок аскарид также характеризовался уменьшением средней массы эмбрионов и краниокау-дального размера в 1,07-1,3 раза по отношению к контрольным показателям.
Полученные нами результаты согласуются с данными I. Blaszkowska [12], которая установила, что ингибиторы из тканей Ascaris lumbricoides и А. suum обладают эмбритоксическим и тератогенным действиями, достоверно повышая число погибших эмбрионов и увеличивая у них аномалии развития. Было показано, что внутрибрюшинное введение пепсинового ингибитора из тканей свиной аскариды самкам мышей линии ВЛЬВ/с с 6 по 15-е сутки беременности сопровождается увеличением постимплантационной гибели за счет роста внутриматочных резорбций, гибели эмбрионов, а также характеризуется снижением массы эмбрионов и оссификации их скелетов [13].
При моделировании миграционного аскаридоза с 1 -х суток беременности не наблюдают генотоксических и цитотоксических изменений как в клетках костного мозга хозяина, так и в клетках эмбрионов на 14-е сутки инвазии. Однако отмечается повышение процента ДНК в «хвостах комет» в клетках костного мозга беременных самок в 1,75 раза по сравнению с показателем контроля. Эти результаты не согласуются с полученными нами ранее данными у мышей-самцов при миграционном аскаридозе с применением микро-ядерного теста [2, 3]. При дозе заражения 20 яиц/г было установлено, что метаболиты мигрирующих личинок аскарид вызывают рост одноцепочечных разрывов, щелочно-лабильных сайтов ядерной молекулы ДНК и числа апоп-тотических клеток в костном мозге и семенниках инвазированных животных [5, 8]. Это несоответствие можно объяснить увеличением защиты генома самок мышей и их эмбрионов от мутагенных факторов во время беременности.
При заражении на 10-е сутки беременности к 14-м суткам инвазии миграция личинок аскарид сопровождалась синхронным повреждением наследственного аппарата соматических клеток костного мозга самок и эмбриональных клеток зародышей. Эти изменения характеризовались повышением «момента хвоста» за счет увеличения процента ДНК в «хвостах комет» и «длины хвостов комет», а также увеличением процента апоптотических клеток.
Заключение
Метаболиты мигрирующих личинок свиной аскариды при заражении на 1 и 10-е сутки после оплодотворения у белых беспородных мышей (14 и 4-е сутки инвазии) обладают эмбриотоксическим воздействием к 14-м суткам беременности. Эмбриотоксический эффект обусловлен повышением уровня постимплантационной гибели в 2,66-4,16 раза, уменьшением средней массы эмбрионов и краниокаудального размера в 1,07-1,3 раза.
Миграция личинок аскарид при заражении на 10-е сутки после оплодотворения (4-е сутки инвазии) сопровождается генотоксическим и цитотокси-ческим эффектом в соматических клетках костного мозга самок и клеток их эмбрионов на 14-е сутки беременности. Инвазия сопровождается увеличением числа одноцепочечных разрывов и щелочно-лабильных сайтов ядерной ДНК в клетках костного мозга на 4,52 % и в клетках эмбрионов на 3,77 %, а также ростом числа апоптотических клеток в 7,2-12,3 раза.
Литература
1. Бекиш В.Я. // Матер. докл. 5-го Республиканского съезда специалистов клинической лабораторной диагностики Беларуси. — 1997. — Мн. — С. 140-141.
2. Бекиш В.Я., Колмогоров В.И., Побяржин В.В. // Вестник ВГМУ. -2003. - Т. 2, № 2. - С. 67—72.
3. Бекиш О.-Я.Л., Бекиш В.Я. // Весщ нацыянальной академп навук Беларус (Серыя б1ялапчных навук). — 2000. — № 2. — С. 109—113.
79
4. Дурнев А.Д., Бекиш В.Я. и др. / Методические рекомендации. Утв. РАМН и РАСН. - М., 2006. - 27 с.
5. Зорина В.В., Бекиш В.Я. // Матер. докл. науч. конф. Всерос. о-ва гель-минтол. «Теория и практика борьбы с паразитарными заболеваниями». - М., 2008. - Вып. 9. - С. 205-208.
6. ЛюбимовБ.И. // Ведомости Фармакологического Комитета. - М., 1998.
- № 1. - 20 с.
7. Пашинская Е.С., Зорина В.В., Бекиш В.Я. // Матер. докл. 62-й науч. сессии УО «ВГМУ» «Достижения фундаментальной, клинической, медицины и фармации». - 2007, Витебск. - С. 163-166.
8. Стуканова Е.Ю., Зорина В.В., Бекиш В.Я. // Матер. докл. 60-й науч.-практ. конф. студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы современной медицины и фармации» (24-25 апреля 2008 г.). - 2008, Витебск. - С. 316-318.
9. Хабриев Р.У. и др. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / 2-е изд., перераб. и доп. - М.: «Медицина», 2005. - 832 с.
10. Bethony J. etal. // Lancet. - 2006. - V. 368. - P. 1521-1532.
11. Bialek R., Knobloch J. // Z. Geburtshilfe Neonatol. - 1999. - V. 203, № 3.
- P.128-133.
12. Blaszkowska J. // Acta Parasitologica. - 1998. - V. 43, № 2. - P. 103-108.
13. Blaszkowska J. // Reprod. Toxicol. - 2008. - V. 25, № 2. - P. 263-270.
14. Crompton D.W.T. // J. Parasitolology. - 1999. - V. 85. - P. 397-403.
15. Hellman B. et al. // Int. Arch. Occup. Environ. Health. - 1997. - V. 69. -P. 185-192.
16. Konca K. et al. // Mutat. Res. (Gen. Toxicol. and Environ. Mutagenesis). -2003. - V. 534. - P. 15-20.
17. Singh N., McCoy M., Tice R., Schneider E. // Exp. Cell Research. - 1988.
- V. 175. - P. 184-191.
The embryotoxic, genotoxic and cytotoxic influences of pig ascaris larva
migration on host
V.V. Zorina, O.-Y.L. Bekish, V.Y. Bekish
The metabolites of pig Ascaris larvas have embryotoxic effect on 1 and 10-th days after fertilization (4 and 14-th days of infection) to 14-th day of pregnancy at white unbread mice. The embryotoxic effect was characterized by increase of postimplantation death in 2,66-4,16 times, decrease of embryo body weight and cra-nyocaudal size in 1,07-1,3 times. The larvas migration of Ascaris by infection on 10-th day after fertilization (4-th day of infection) have genotoxic and cytotoxic effects in somatic cells of mice-female bone marrow and cells of its embryo on 14th day of pregnancy. The infection was characterized by increase of single-strand breaks, alkali-labile sites nucleus molecule DNA on 4,52 % in bone marrow cells, on 3,77 % in embryo cells and number of apoptotic cells in 7,2-12,3 times.
