CC BY
99
© БЕКИШ Вл.Я., 2004
ПОВРЕЖДЕНИЯ ДНК КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА И СЕМЕННИКОВ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ГИМЕНОЛЕПИДОЗЕ
БЕКИШ Вл.Я.
УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет», кафедра медицинской биологии и общей генетики
Резюме. Изучены генотоксическое и цитотоксическое воздействия метаболитов карликовых цепней на клетки костного мозга и семенников инвазированных мышей линии СВА при применении щелочного гель-электрофореза единичных клеток. Установлено, что метаболиты Нутепо1ер1$ папа во время инвазии вызывают рост одноцепочечных разрывов, щелочно-лабильных сайтов ядерной молекулы ДНК, апоптотических клеток в костном мозге и семенниках экспериментальных животных. Эти эффекты зависят от биологии развития паразита в организме хозяина и максимально выражены на личиночной и имагинальной стадиях. Генотоксическое и цитотоксическое воздействия метаболитов карликовых цепней усиливаются при росте интенсивности инвазии.
Ключевые слова: карликовый цепень, щелочной гель-электрофорез единичных клеток, клетки костного мозга и семенников, генотоксичность, цитотоксичность.
Abstract. The genotoxic and cytotoxic influences of dwarf tapeworm metabolites on bone marrow and testicles of invasive mice CBA line were investigated with alkaline single cell gel electrophoresis use. It was established, that Hymenolepis nana metabolites caused increase of single-strand breaks, alkali-labile sites of nucleus molecule DNA, apoptotic cells in bone marrow and testicals of experimental animals. These effects depend on biology of parasite development and are maximally higher in larval and imaginal stages. The genotoxicity and cytotoxicity influences of dwarf tapeworm metabolites increase when invasion intensity grows.
Известно, что метаболиты карликовых цепней способны вызывать рост числа клеток костного мозга с микроядрами и хромосомными аберрациями, индуцировать увеличение уровней микроядросодержащих сперматогони-ев, сперматоцитов и сперматид в семенниках, снижать активность сперматогенеза при экспериментальном гименолепидозе [2, 3, 9]. Цитогенетические изменения в соматических и генеративных клетках хозяина при гименолепи-дозе зависят от дозы инвазионного материала, введенного при заражении, и приходятся на период высокой биологической активности паразитов [3].
Адрес для корреспонденции: 210023, г.Витебск, пр.Фрунзе, 27, Витебский государственный медицинский университет, кафедра медицинской биологии и общей генетики - Бекиш Вл.Я.
Современным, перспективным чувствительным флуоресцентно-микроскопическим методом обнаружения первичных повреждений молекулы ДНК отдельных клеток при воздействии факторов окружающей среды является гель-электрофорез единичных клеток - метод «ДНК-комет» [8]. Метод предложили O.Osting и K.J.Johanson [16], а его детальная разработка была завершена N.P. Singh et al. в 1988 г. [17] и P.L. Olive et al. в 1990 г. [15]. Гель-электрофорез единичных клеток применяется для оценки генотоксических свойств факторов окружающей среды [13]. При проведении метода каждое клеточное ядро имеет кометоподобный вид, в котором имеется «голова» и «хвост» (рис. 1а). Интерпретация результатов основана на гипотезе, что вызванные генотоксическими факторами повреждения ДНК ядра состоят из низкомолекулярных
*• •ф
а б
Рис. 1. «Кометы» клеток костного мозга мышей при проведении щелочного гель-электрофореза единичных клеток: а - клетка с поврежденными участками ДНК в «хвосте кометы»;
б - апоптотическая клетка.
участков, отрывов, репарационно-вырезанных повреждений и щелочно-лабильных участков ДНК [19]. В результате лизиса освобожденные из ядра клеток поврежденные участки ДНК при электрофорезе формируют «хвост кометы», а неповрежденные - «голову кометы». В «хвосте кометы» просчитываются основные показатели повреждения ДНК ядра, обусловленные генотоксическими факторами: «длина хвоста», процент ДНК в «хвосте кометы» и «момент хвоста» (длина «хвоста кометы», умноженная на процент ДНК в нем). Гель-электрофорез единичных клеток позволяет оценить не только генотоксическое, но и цитотоксическое воздействие исследуемых факторов, определяющих рост процента апоптотических клеток [7, 9], изображения которых характеризуют минимальные размеры ядра и большой хвост, разбросанный во все стороны (рис. 1 б).
Возможность метаболитов НутепоІерІБ папа вызывать повреждения молекулы ДНК и апоптоз в соматических, генеративных клетках хозяина ранее не исследовалась. В связи с этим представляет интерес изучить предполагаемые генотоксическое и цитотоксическое воздействия метаболитов карликовых цепней на клетки костного мозга и семенников, инвазирован-ных карликовыми цепнями экспериментальных животных.
Методы
Исследование проведено на 100 мышах-сам-цах линии СВА массой 16-18 г, разделенных на четыре группы по 25 животных в каждой. Мы-
шам 1-ой группы (негативный контроль) вводили per os 0,2 мл 2 % крахмального геля, животных 2ой группы заражали инвазионными яйцами H. nana внутрижелудочно в дозе 5, 3-ей - 20 и 4-ой - 40 яиц/г массы тела [4]. Забой контрольных и зараженных животных (по 5 на срок наблюдения) проводили путем декапитации на 3, 7, 14, 21 и 28-й дни от начала инвазии. У мышей выделяли бедренные кости и семенники. Шприцем с 2 мл среды RPMI-1640 тонкой иглой вымывали костный мозг. С семенников удаляли оболочку и выделяли семенные канальцы, которые промывали в фарфоровой ступке с 5 мл 2,2 % раствора трехзаме-щенного цитрата натрия. После удаления раствора семенные канальцы измельчали изогнутой препаровальной иглой в 3 мл свежего раствора цитрата натрия и переносили в пробирки объемом 15 мл. Пробирки выдерживали 5 мин при комнатной температуре для осаждения крупных фрагментов семенных канальцев, после чего верхний слой жидкости переносили во вторую пробирку. Суспензии клеток костного мозга, семенников дважды отмывали в 3 мл среды RPMI-1640 путем 10 минутного центрифугирования при 1100 об/мин и температуре 8°С. После второй отмывки супернатант удаляли, осадок разводили средой RPMI-1640 до конечной концентрации клеток 1-5 х 106 на 1 мл. Гель-электрофорез единичных клеток проводили в щелочной версии N.P. Singh et al. [17] в модификации B. Hellman et al. [12], которая позволяет определить уровни одноцепочечных разрывов, щелочно-лабильных сайтов молекулы ДНК при воздействии генотоксических факторов. Для проведения метода использовались камера с силовой установкой для электрофореза и все хими-
ческие реактивы фирмы Sigma. Микропрепараты окрашивали раствором этидия бромида и анализировали на люминисцентном микроскопе Мик-мед-2 фирмы ЛОМО при увеличении 600х. Изображения «комет» на микропрепаратах фотографировали цифровой фотокамерой Nikon Coolpix-4500. Учет повреждений молекулы ДНК проводили путем анализа цифровых изображений с помощью автоматической программы «^ASP v. 1.2.2» [14]. С микропрепарата подсчитывалось по 100 клеток, в каждой из которых учитывали «длину хвоста» кометы в пикселях, а также процент ДНК в «хвосте» (рис. 2). В качестве основного международно-принятого показателя генотоксического воздействия факторов среды использовали «момент хвоста», вычисленный из «длины хвоста», умноженной на процент ДНК в «хвосте» [11, 19]. Для оценки цитотоксического воздействия метаболитов карликовых цепней на клетки костного мозга и семенников определяли процент апоптотических в 100 случайно выбранных клетках (рис. 2). Результаты обрабатывались статистически с использованием программы Ехсе1 2002. Рассчитывалась средняя арифметическая и ее стандартное отклонение (M+SD). Достоверность выявляемых различий определяли по t-критерию Стьюдента.
Результаты
При проведении метода ДНК-комет в клетках костного мозга контроля во время опыта «момент хвоста» варьировал от 0,14+0,05 до
0,23+0,07, а процент апоптотических клеток -от 2,00+0,67 до 3,60+0,65.
У мышей 2-ой группы (доза заражения 5 яиц/г) на 3-й день наблюдения «момент хвоста» в клетках костного мозга был выше в 2,26 раза (рис. 3), а процент апоптотических клеток - в 1,3 раза, чем у животных негативного контроля (рис. 4). На 7, 14, 21 и 28-й дни опыта исследуемые показатели у зараженных животных достоверно не отличались от данных незаражен-ных животных.
При увеличении дозы заражения до 20 яиц/г «момент хвоста» клеток костного мозга ин-вазированных гименолеписами животных на 3й день наблюдения были выше в 4,43 и 1,96 раза соответственно показателей негативного контроля и данных инвазированных животных 2-ой группы. Процент апоптотических клеток в 2,3 раза превышал уровень негативного контроля и в 1,76 раза был больше, чем при дозе 5 яиц/г. На 7-й и 14-й дни наблюдения «момент хвоста» был выше в 4,2 и 3,57 раза соответственно показателям негативного контроля. На 21-й день наблюдения «момент хвоста» в 3,8 раза превышал уровень незараженных животных. На 28-й день опыта «момент хвоста» и процент апоптотических клеток у зараженных животных не отличались от показателей негативного контроля.
У зараженных в дозе 40 яиц/г массы тела мышей «момент хвоста» клеток костного мозга к 3-му дню инвазии был выше в 7,74 раза по сравнению с негативным контролем и в 1,7 раза превышал этот показатель при дозе 20 яиц/г. Про-
3 1« • # #
1 , 1 3
. • 1 • з 2*
•4 •• 2
. 2 а . • б
Рис. 2. Клетки костного мозга (а) и семенников (б) мыши при проведении щелочного гель-электрофореза единичных клеток (инвазия Н. папа, 3 день наблюдения, доза 40 яиц/г): 1 - клетки в норме; 2 - клетки с поврежденной ДНК в «хвосте кометы»; 3 - апоптотические клетки.
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Рис. 3. «Момент хвоста» в клетках костного мозга при экспериментальном гименолепидозе (достоверное отличие при Р<0,01-0,05: *- от негативного контроля; # - от данных дозы 5 яиц/г;
@ - от данных дозы 20 яиц/г).
/—71
* *
3 день 7 день
□ Негативный контроль
14 день I 5 яиц/г
Л7777;
21 день 120 яиц/г
28 день □ 40 яиц/г
12
10
8
6
4
2
0
3 день
7 день
□ Негативный контроль
14 день I 5 яиц/г
21 день 20 яиц/г
28 день □ 40 яиц/г
Рис. 4. Проценты апоптотических клеток костного мозга при экспериментальном гименолепидозе (достоверное отличие при Р<0,01-0,05: * - от негативного контроля; # - от данных дозы 5 яиц/г;
@ - от данных дозы 20 яиц/г).
цент апоптотических клеток в 3,54 и 1,5 раза был больше соответственно уровней негативного контроля и животных 3-ей группы. На 7-й день наблюдения «момент хвоста» был выше в 8 раз по сравнению с негативным контролем и в 1,9 раза - с показателем 3-ей группы. К 14-му дню опыта «момент хвоста» и процент апоптотичес-ких клеток были больше в 3,64 и 2 раза соответственно, чем у негативного контроля. «Момент хвоста» на 21-й день наблюдения был больше в
7,8 раза по сравнению с интактным контролем и более чем в 2 раза - с данными 3-ей группы (20 яиц/г). На 28-й день опыта исследуемые показатели у зараженных животных не отличались от данных негативного контроля.
В семенниках животных негативного контроля в течение опыта «момент хвоста» варьировал от 0,55+0,18 до 0,75+0,35, а процент апоптотических клеток - от 6,10+0,74 до 7,30+1,83.
У зараженных мышей в дозе 5 яиц/г массы тела «момент хвоста» был выше в 1,56 раза только на 3-й день наблюдения при сравнении с данными негативного контроля (рис. 5).
При увеличении дозы заражения до 20 яиц/г в клетках семенников мышей на 3-й день опыта наблюдалось повышение «момента хвоста» в 2,1 раза по сравнению с негативным конт-
ние “момента хвоста» в З,З раза по сравнению с негативным контролем и в 2,ЗЗ раза - с аналогичным показателем при дозе 20 яиц/г. Процент апоптотических клеток был выше более чем в 2 раза по отношению к интактному контролю и в 1,6 раза - к данным 3-ей группы. К 7му дню у животных, зараженных в дозе 40 яиц/ г, «момент хвоста» был выше в З раза по отно-
З день 7 день 14 день 21 день 28 день
□ Негативный контроль □ З яиц/г Щ 20 яиц/г □ 40 яиц/г
Рис. З. «Момент хвоста» в клетках семенников при экспериментальном гименолепидозе (достоверное отличие при Р<0,01-0,0З: *- от негативного контроля; # - от данных дозы З яиц/г;
@ - от данных дозы 20 яиц/г).
ролем и в 1,3 раза - с показателем дозы З яиц/г. Процент апоптотических клеток был выше в 1,3 раза по отношению к интактному контролю (рис. 6). К 7-му дню «момент хвоста» клеток семенников животных 3-ей группы был выше в 1,38 раза, чем у негативного контроля. Процент апоптотических клеток оказался повышенным в 1^ раза по сравнению с данными негативного контроля. На 14-й день в клетках животных 3-ей группы «момент хвоста» и процент апоптотических клеток были выше в 1,З и 1,2 раза соответственно, чем в интактном контроле. На 21 и 28-й дни опыта исследуемые показатели у зараженных животных не отличались от данных негативного контроля.
У мышей 4-ой группы (доза заражения 40 яиц/г) на 3-й день опыта наблюдалось повыше-
шению к негативному контролю, превышал в 2,1З раза данные при дозе 20 яиц/г, а процент апоптотических клеток превосходил в 1,7 раза показателя интактного контроля. К 14-му дню «момент хвоста» у животных 4-ой группы был выше в 3,62 раза величин негативного контроля и в 2,4 раза превышал аналогичный показатель мышей 3-ей группы. Процент апоптотичес-ких клеток был выше в 2 раза по отношению к интакному контролю и в 1,6 раза превышал данные животных, зараженных дозой 20 яиц/г. «Момент хвоста» клеток семенников на 21-й день наблюдения был больше в 1,7 раза по сравнению с негативным контролем. На 28-й день опыта исследуемые показатели у зараженных животных не отличались от данных негативного контроля.
□ Негативный контроль ■ 5 яиц/г Щ 20 яиц/г □ 40 яиц/г
Рис. 6. Проценты апоптотических клеток семенников при экспериментальном гименолепидозе (достоверное отличие при Р<0,01-0,05: * - от негативного контроля; @ - от данных дозы заражения 20
яиц/г).
Обсуждение
На основании полученных данных можно заключить, что метаболиты карликовых цепней обладают генотоксическим воздействием как на соматические, так и на генеративные клетки инвазированного хозяина, вызывая увеличение количества одноцепочечных разрывов и щелочно-лабильных сайтов ядерной ДНК в клетках костного мозга и семенников in vivo. Повреждения ядерной ДНК клеток костного мозга и семенников хозяина при гименолепи-дозе зависят от биологии паразита и максимально выражены на личиночной (3-й день) и има-гинальной стадиях развития (14-й день). Рост повреждений ядерной молекулы ДНК клеток костного мозга и семенников при экспериментальном гименолепидозе зависят от дозы введенного инвазионного материала при заражении и кратно достоверно возрастают при ее увеличении. Дозозависимое воздействие четко прослеживается на росте «момента хвоста» в клетках костного мозга и семенников при увеличении дозы заражения с 5 до 20 и до 40 яиц/г на 3 день наблюдения. Этот эффект наблюдался также при увеличении дозы введенного инвазионного материала при заражении с 20 до 40 яиц/г на 7 и 21 дни в клетках костного мозга и на 7 и
14 дни опыта в клетках семенниках.
Метаболиты карликовых цепней одновременно обладают цитотоксическим воздействием, которое характеризовалось ростом процента апоптотических клеток в костном мозге и семенниках инвазированных животных при высоких дозах заражения (20 и 40 яиц/г). Этот эффект зависел от особенностей биологии развития карликовых цепней и был максимально выражен на стадиях цистицеркоидов (3-й день) и имаго (14-й день). Рост процента апоптотических клеток в костном мозге и семенниках мышей при гименолепидозе зависел от дозы введенного инвазионного материала, взятого при заражении, и кратно достоверно возрастал при ее увеличении. При увеличении дозы с З до 20 и до 40 яиц/г массы тела животного на 3й день в костном мозге наблюдался рост апоптотических клеток в 1,5-1,76 раза. В семенниках рост дозы заражения с 20 до 40 яиц/г массы тела животного на 3-й и 14-й дни инвазии сопровождался увеличением апоптотических клеток в 1,6 раза.
Генотоксические и цитотоксические повреждения клеток костного мозга и семенников мышей, инвазированных карликовыми цепнями, можно связать с развитием оксидатив-ного стресса в инвазированном организме хо-
зяина и со способностью метаболитов карликовых цепней непосредственно повреждать ядерный аппарат клеток хозяина. Нами было показано, что гименолепидозная инвазия сопровождается активацией свободнорадикальных процессов в семенниках мышей, которые характеризуются повышением уровней продуктов пе-рекисного окисления липидов (малоновый диальдегид, диеновые конъюгаты) и снижением активности ферментов - антиоксидантов (супе-роксиддисмутаза, каталаза) [1]. Кроме того, имеются данные о способности карликовых цепней нарушать ход свободнорадикальных процессов в организме хозяина за счет наличия у них NO-синтетазы [10, 18]. У больных ги-менолепидозом установлено повышение интенсивности перекисного окисления липидов в мембранах эритроцитов и уровень малонового диальдегида зависел от тяжести и длительности течения заболевания [5].
Выводы
1. Метаболиты карликовых цепней обладают генотоксическим и цитотоксическим воздействиями на соматические и генеративные ткани хозяина, вызывая рост одноцепочечных разрывов, щелочно-лабильных сайтов ядерной молекулы ДНК, апоптотических клеток в костном мозге и семенниках. Максимум изменений наблюдается в периоды высокой биологической активности паразитов (стадии цистицерко-идов и имаго).
2. Генотоксическое и цитотоксическое влияния метаболитов карликовых цепней на генеративные клетки хозяина возрастают при увеличении дозы введенного инвазионного материала при заражении.
Исследования выполнены по договору №Б04-125 с Белорусским республиканским фондом фундаментальных исследований.
Литература
1. Бекиш Вл.Я., Побяржин В.В. Влияние комбинированной терапии экспериментального гименолепи-доза на состояние генома хозяина и свободнорадикальные процессы в семенниках // Вестник фармации. - 2003. - № 4. - С. 65-74.
2. Побяржин В.В. Метаболиты Hymenolepis nana как мутагены соматических клеток хозяина // Вопросы экспериментальной биологии и медицины: Сб. науч.
трудов ВГМУ - Витебск, 1999. - С. 73-77.
3. Побяржин В.В., Бекиш Вл.Я. Нарушения в геноме хозяина при экспериментальном гименолепидозе в зависимости от дозы введенного инвазионного материала при заражении // Вестник ВГМУ - Том. 2. -№ 4. - 2003. - С. 84-89.
4. Побяржин В.В., Бекиш О.-Я.Л. Экспериментальная модель воспроизведения гименолепидоза // Тр. конф. «Совр. паразитология: проблемы и перспективы». - Витебск. - 1999. - С. 34-36.
5. Карташёва Л.Д., Прокофьева М.С., Лысакова Л.А., Петрова Т. А. Функциональная активность желудочно-кишечного тракта и интенсивность перекисно-го окисления липидов эритроцитов при гименоле-пидозе // Мед. паразитол. и паразитар. болезни. -1980. - № 3. - С. 32-37.
6. Bekish Vl.J. The alterations in genetic apparatus of somatic and generative cells of the host caused by helminthes metabolites // Wiadomoaci Parazytologiczne (Poland). -2001. - Tom 47, Zeczyt 4. - P. 891-896.
7. Choucroun P., Gillet D., Dorange G., Sawicki B., Dewitte J. Comet assay and early apoptosis // Mutation Research (Fund. and Mol. Mech. of Mutagenesis). - 2001. - Vol. 478. - P. 89-96.
8. Cotelle S., Ferard J.F. Comet Assay in Genetic Ecotoxicology: A Review // Environmental and Molecular Mutagenesis. - 1999. - Vol. 34. - Р. 246-255.
9. Florent M., Godard T., Ballet J.-J., Gauduchon P., Soal B. Detection by the comet assay of apoptosis induced in lymphoid cell lines after growth factor deprivation // Cell Biol. Toxicol. - 1999. - Vol. 15. - P. 185-192.
10. Gustafsson M.K., Lindholm A.M., Terenina N.B., Reuter M. NO nerves in a tapeworm. NADPH-diaphorase histochemistry in adult Hymenolepis diminuta // Parasitology.
- 1996. - Vol. 113, N 6. - Р. 559-565.
11. Hartmann A., Agurell E., Beevers C., Brendler-Schwaab S., Burlinson B., Clay P., Collins A., Smith A., Speit G., Thybaud V, Tice R.R. Recommendation for conducting the in vivo alkaline Comet assay // Mutagenesis. - 2003. - Vol. 18, N 1. - P. 45-51.
12. Hellman B., Vaghef H., Friis L., Edling C. Alkaline single cell gel electrophoresis of DNA fragments in biomonitoring for genotoxicity: an introductory study on healthy human volunteers // Int. Arch. Occup. Environ. Health. - 1997. -Vol. 69. - P.185-192.
13. Kassie F., Parxefall W., Knasmuller S. Single cell gel electrophoresis assay: a new technique for human biomonitoring studies // Mutation Research (Reviews in Mutation Research). - 2000. - Vol. 463. - Р.13-31.
14. Korea K., Lankoff A., Banasik A., Lisowska H., Kuszewski T., Gуцdц S., Koza Z., Wojcik W. A cross-platform public domain PC image-analysis program for the comet assay // Mut. Res. (Gen. Toxicol. and Environ. Mutagenesis). -2003. - Vol. 534. - P. 15-20.
15. Olive P.L., Banath J.P., Durand R.E. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the “Comet assay” // Radiat. Res. - Vol. 122. - 1990. - P. 86-94.
16. Osting O., Johanson K.J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian
cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. - Vol. 123. -1984. - P. 291-298.
17. Singh N., McCoy M., Tice R., Schneider E. A Simple Technique for quantification of low levels of DNA damage in individual cells // Exp. Cell Research. - 1988. - Vol. 175. - P. 184-191.
18. Terenina N.B., Onufriev M.V., Gulyaeva N. V., Lindholm A.M., Gustafsson M.K. A radiometric analysis of nitric oxide
synthase activity in Hymenolepis diminuta. // Parasitology.
- 2000. - Vol. 120, N і. - Р 91-95.
19. Tice R., Agurell E., Anderson D., Burlinson B., Hartmann A., Kobayashi H., Miyamae Y., Roias E., Ryu J.-C., Sasaki Y. Single Cell Gel/Comet Assay: Guidelines for In Vitro and In Vivo Genetic Toxicology Testing // Envir. and Molec. Mutagenesis. - 2000. - Vol. 35. - P. 206-221.
Поступила 07.09.2004 г. Принята в печать 09.12.2004 г.
