CC BY
29УДК 616.992:616-057
СОСТАВ И
БИОЛОГИЧЕСКАЯ
АКТИВНОСТЬ
УГЛЕВОДНЫХ
ФРАКЦИЙ PLEUROTUS
OSTREATUS
Ананьева Е.П., Турина С.В., Кожемякина Н.В.
Санкт-Петербургская государственная химикофармацевтическая академия, Санкт-Петербург,
Россия
© Коллектив авторов, 2007
Я течение последних десятилетии съедобные макромицеты все больше используют в качестве источников лечебных агентов, адаптогенов, иммуностимуляторов или добавок к пище. Объектом данного исследования был штамм Pleurotus ostreatus (вешенка обыкновенная). Изучали состав, биологическую активность и иммуномодулирующий эффект водных экстрактов из плодовых тел и мицелия, содержащих полисахариды, и, главным образом, р-(1,3)-глюкан.
Ключевые слова: активность биологическая, базидиомицеты, р-(1,3)-глюкан, иммуностимуляция, медицински значимые съедобные макромицеты
A COMPOSITION AND BIOLOGICAL ACTIVITY OF THE POLYSACCHARIDE FRACTIONS FROM PLEUROTUS OSTREATUS
Ananyeva E.P., Gurina S.V., Kojemyakina N.V.
Department of Microbiology, St. Petersburg State Chemical - Pharmaceutical Academy, St. Petersburg, Russia
© Collective of authors, 2007
In the last few decades mushrooms have increasingly used as a source of therapeutic agents, adaptogens, immunostimidants or health food supplement. Pleurotus ostreatus strain (aqueous extracts from fruit bodies and mycelia) have been studied. Namely composition and biological activity and the immune modulating effects of polysaccharide, obtained from fruiting bodies and culturaled mycelia has been investigated in our experiments. These components with biological activity are present as glucans with different types ofglycosidic linkages, mainly fi-(1,3) linkages in the core.
Key worrfs: Basidiomycetes, biological activity, immunostimulation, medicinal mushrooms, (5-1,3-glucan.
ВВЕДЕНИЕ
Базидиомицетовые грибы синтезируют спектр биологически активных веществ, важнейшими из которых являются полисахариды. Плодовые тела и вегетативная масса мицелия базидиальных грибов являются перспективными источниками получения биологически активных гликанов. Грибные полисахариды, обладающие общебиологической защитной функцией, используют в качестве профилактических и лечебных средств, иммуностимуляторов и, в ряде случаев, противоопухолевых средств [1,2].
Биологическая активность гликанов связана с их воздействием на клеточные компоненты иммунной системы: Т- и В-лимфоциты, макрофаги. Макрофаги входят в состав клеток системы мононуклеарных фагоцитов, занимающей центральное место в механизмах специфической и неспецифической защиты организма, и являются чувствительной и пластичной моделью для изучения действия биологически активных соединений.
Цель работы — подбор условий культивирования и получение биомассы мицелия Р. оьЬеаШь (вешенки обыкновенной), выделение углеводных фракций мицелия, проведение их физико-химического анализа, изучение действия углеводных фракций на показатели функциональной активности перитонеальных макрофагов мышей.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для получения биомассы мицелия культуру выращивали на жидком сусле при 24 °С в течение двух недель в статических условиях. Углеводные фракции получали из плодового тела и мицелия водной экстракцией при 100 “С в течение часа. После этого осадок отделяли центрифугированием, промывали этанолом (96%), сушили и получали основные фракции 111 (из плодового тела) и М I ( из мицелия). Надосадоч-ную жидкость после центрифугирования упаривали на ротационном испарителе, осаждали двукратным объёмом этанола, осадки выделяли, сушили и получали фракции ПII и М II, углеводный состав которых определяли хроматографически, а соотношение гли-козидных связей — методом перйодатного окисления [3]. Биологическую активность углеводных фракций оценивали по их влиянию на функциональную активность клеток системы мононуклеарных фагоцитов (СМФ). Использовали переживающую монослойную культуру перитонеальных макрофагов белых мышей, являющуюся чувствительной тест-системой для изучения любых биологически активных веществ [4]. Углеводные фракции вводили внутрибрюшинно белым беспородным мышам в объеме 1 мл. Клетки получали промыванием брюшной полости мышей средой 199, содержащей 20% сыворотки крупного рогатого скота, подсчитывали количество клеток в 1 мл промывной среды. Полученную жидкость разливали в пробирки Лейтона, и макрофаги культивировали в течение 2 суток.
Морфолого-функциональные изменения макрофагов изучали в световом микроскопе после извлечения из пробирок покровного стекла с прикрепившимися клетками.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
11ри культивировании на жидком сусле гриб образовывал кожистую пленку с небольшим воздушным мицелием в количестве 10 г/л. 11осле фракционирования плодового тела и мицелия были выделены основные углеводные фракции (II I и М I) с выходом 90% и 75% соответственно. Количества полисахаридов во фракциях 11 II и М II, выделенных из растворов после экстракции, оказались незначительными - 2,5% и 1,25% соответственно. Из-за малого содержания углеводов подробный анализ фракции М II не проводили и не изучали ее биологическую активность. Все выделенные фракции состояли в основном из глюкозы, количество которой варьировало от 83% до 92% (табл.).
Таблица
Характеристика полисахаридных фракций Pleurotus ostreatus
Образец Моносахарид ный состав, % Золь- ность, % Редуцирующие вещества, % Белок, %
Glu Xyl Man Gal
Плодовое тело* Glu следы следы следы 5,2 62,1 25,0
ПІ 92,0 2,5 3,0 • 1,4 80,2 2,5
ПН 82,0 3,0 5,0 10,0 0,9 87,6 0,9
Мицелий* Glu следы следы следы 3,2 83,4 9,0
Ml 87,0 2,0 - 7,0 1,1 86,8 1,5
*- определяли количественный состав моносахаридов
Образцы содержали небольшие количества ман-нозы и ксилозы (до 3%), а во фракциях ПII иМ I была обнаружена галактоза (10% и 7% соответственно). Количество редуцирующих веществ превышало 80%. Содержание белка в выделенных фракциях и мицелии было незначительным (от 0,9 до 2,5%), однако в плодовом теле оно достигало 25% (табл.). В результате перйодагного окисления было установлено, что основные углеводные фракции II I и М I содержали около 65% 1,3-гликозидных связей, 27—28% 1,2- и 1,4-связей и незначительное количество нередуцирующих концевых остатков. Таким образом, полученные углеводные фракции представляли собой преимущественно 1,3-связанные глюканы. Влияние выделенных полисахаридных фракций на макрофаги оценивали по изменению их важнейших эффектор-ных функций: способности этих клеток к распластыванию на стекле и хемотаксису - показателям, моделирующим начальные стадии фагоцитоза, а также поглотительной способности в отношении убитых нагреванием клеток дрожжей Candida albicans. Хе-мотаксическую активность определяли по приросту клеток в брюшной полости мышей после введения препаратов.
Для определения оптимальной активирующей
дозы полисахаридных фракций их вводили i.p. однократно в количестве 0,5; 1,0; 2,0 мг/мл и оценивали действие на показатели хемотаксиса и способности к распластыванию на стекле. В качестве оптимальной была выбрана концентрация 1 мг/мл (50 мг/кг). Изменение показателей функциональной активности макрофагов, отражающих стадии фагоцитоза, изучали на 1-е и 5-е сутки после введения гликановых фракций. Функциональная активность макрофагов под влиянием выделенных углеводных полимеров существенно возрастала к 5-м суткам после введения полисахаридов. Все изучаемые фракции существенно увеличивали значения показателей хемотаксиса макрофагов (в 1,7-2,7 раза) и их способности к распластыванию на стекле (в 1,5-2,0 раза). Поглотительная способность макрофагов в отношении убитых нагреванием дрожжевых клеток С. albicans также достоверно возрастала под действием гликанов (в 1,5-1,7 раза). Наиболее заметное возрастание числа фагоцитированных клеток вызывала углеводная фракция М I (Рис.1).
Y
з .
2.5
2
1.5
1
0,5
0
прирост клеток в брюшной полости ^ распластывание клеток на 1 сутки распластывание клеток на 5 сутки шш фагоцитоз
К — контрольный уровень
У — степень активации, равная отношению опытных показателей (введение полисахаридов) к контрольным (введение физиологического раствора)
Рис. 1. Изменение показателей функциональной активности макрофагов под действием углеводных фракций из Р1еиго (ШОВ Ггео Ш5.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Из плодовых тел и мицелия Р. ОШваЫЬ выделены углеводные фракции, составляющие от 72 до 95% массы гриба. Основным компонентом полученных фракций являлась глюкоза с присутствием незначительных количеств (до 3%) ксилозы и маннозы, а в некоторых фракциях - до 10% галактозы (фрак-
ПРОБЛЕМЫ МЕДИЦИНСКОЙ МИКОЛОГИИ. 2007. Т.9. №1
ция IIII). Установлено, что основные фракции П 1 и М I представляли собой преимущественно 1,3-свя-занные глюканы. Данные полисахариды оказывали стимулирующее действие на функциональную активность клеток СМФ. Максимальное увеличение значений показателей наблюдали на пятые сутки после введения полисахаридов. Более выраженной активностью обладали (И ,3-с вязанные глюканы (III и М I), содержащие наименьшее количество других углеводных компонентов (а именно ксилозы, манно-зы). Вероятно, биологической активностью обладают
1-3 связанные глюканы, количество которых во фракциях ПI и М I максимально.
Клетки СМФ (моноциты крови и макрофаги) выполняют ряд важнейших функций в организме: участвуют в поддержании гомеостаза, в неспецифической защите, в развитии иммунного ответа. На основании полученных данных можно заключить, что полисахаридные фракции, выделенные из базидиомицета Р. оигеаШ$, перспективны как неспецифические стимуляторы защитных функций макроорганизма.
ЛИТЕРАТУРА
1. Елинов Н.П. Химия микробных полисахаридов.- М.: Высшая школа, 1984.- 256 с.
2. Yoshioka Y., Tabeta R. Antitumor polysaccharides from Pleurotus ostreatus: isolation and structure of a beta-glucan// Appl. Microbiol. BT.-2002.- Vol. 58.-P.582-599.
3. Захарова И.Л., Косенко Л.В. Методы изучения микробных полисахаридов. — Киев: Наук. Думка, 1982.-189 с.
4. Феофилова Е.П. Прогресс в области экспериментальной микологии// Микробиология.- 1997.-Т.66, №3.-С.302-309.
Поступила в редакцию журнала 15.03.2007 Рецензент: ГЛ.Бабенко
