CC BY
25
СОЕДИНЕНИЯ антимикробного
действия в слизистых оболочках животных
Чернуха U.M., доктор техн. наук, Федулоез Л.В., канд. техн. наук, Василевская Е.Р., Ертикеева Е. А., Ахремко А. Г.
ФГБНУ «ВНИИМП им. В. М. Горбатова»
Основными факторами врожденного иммунитета грибов, растений и животных, сохранившимися в процессе эволюции, являются антимикробные пептиды, вырабатываемыесобственными клетками организма. В отличие от адаптивного иммунитета (который существует только у позвоночных животных), антимикробные пептиды распознают инфекционные возбудители и обеспечивают мгновенную защитную реакцию путем нарушения структуры или функции клеточной мембраны грибковых и бактериальных патогенов и многих оболочечных и безоболочечных вирусов [1]. Подобные иммунокомпетентные соединения, относятся к дефензинам - катионным пептидам.
УДК ¿37.5:547.964.4 Ключевые слова:
антимикробные пептиды, иммунитет, электрофорез
Сегодня выделено и изучено огромное количество дефензинов растений (например, из однолетнего сорняка ежовника Н, echinochloacrusgalli [2], лепестков петунии Petuniahybrida [3]): кожного покрова беспозвоночных -моллюсков (например, треугольника-раковины жемчужницы Н. cumingii\A, 5], молпюсха V. philippinarum [6), двухстворчатых моллюсков М. galloprovincialis [7]); ядов насекомых (например, скорпионов [8], муравьев вида Е. quadridens (пептид Ponericin-Q42 [9], сколопендры S. subspinipes mutilans (сколопендин-2, [10])); пресмыкающихся (например, змей Bungarusfasciatus (пептид кателицидин-BF, [10]) ящериц Л. carolinensis [12]),
Проведенные молекулярные исследования показали, что в более высокоорганизованных организмах (пресмыкающихся, рыб, млекопитающих) максимальное содержание антимикробных веществ отмечается в эпителиальных тканях - кожном покрове и слизистой оболочке [12]. Кроме того, последние исследования показывают наличие мощных антимикробных веществ в паренхиматозных и эпителиальных тканях рыб - из экстракта печени и кожных покровов полосатого тунца выделены соединения, проявляющие высокую активность против гастроэнтерита, молочницы, а так же грамположитепьных и грамотрицательных бактерий (пептиды SHpAP и SJGAP} [13, 14]. В лимфоидных органах (в миндалинах), и в слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта человека выявлена экспрессия дефензинов [15, 16]. Большинством исследований практически доказана антимикробная активность выделенных из разных источников дефензинов в экспериментах in vitro - показано ингиби-рующее действие в отношении широкого спектра бактерий и грибов [17,18,19]. Эта особенность дефензинов обусловила интерес к их использованию в качестве иммуностимуляторов для повышения иммунитета хозяина как потенциальная альтернатива синтетическим антибиотикам.
В связи с этим, одной из областей поиска неспецифических стимуляторов иммунитета стало исследование тканей и органов сельскохозяйственных животных, гипотетически содержащих эндогенные антимикробные пептиды,
Предпопожительное высокое содержание антимикробных пептидов в слизистых оболочках желудочно-кишечного тракта, дыхательных и уро-генитальных путях обусловлено их барьерными функциями, поскольку они максимально подвержены воздействию патогенов. В пользу данной гипотезы выступает тот факт, что в 1991 году из слизистой оболочки языка коровы был выделен и идентифицирован первый представитель fS-дефензинов млекопитающих [18, 20].
Целью данного исследования являлось изучение возможности выделения антимикробных соединений из слизистых оболочек различных органов и тканей сельскохозяйственных животных. Исследование выполнено в рамках гранта Российского научного фонда (проект №15-16-00008). Материалы и методы Объектами исследования являлись: индивидуальные экстракты слизистых оболочек свиней - ротовой полости, языка, носогубного зеркальца (пятачка), прямой кишки (ануса). Забор сырья для исследований производили на мясоперерабатывающем комбинате ОАО «Мясокомбинат Раменский».
Экстракцию сырья в соответствии со следующей схемой: измельчение -> экстракция -> центрифугирование,
Измельчение осуществлялось гомогенизацией предва-ритепьно размороженных тканей в мясорубке KENWOOD (Англия) с использованием решетки с диаметром отверстий
3-5 мм. Экстракцию проводили на ЛДУ (Лаботекс, Россия) с использованием водно-солевого раствора (концентрация натрия хлорида 0,9%) при постоянном перемешивании в течение 24 часов со скоростью 300 об/мин, при температуре
4-5 "С (соотношение объемов 1:2). Полученные экстракты центрифугировали на центрифуге СМ-6М (ELMI, Латвия) при
ВСЕ О МЯСЕ N-5 I ¿ОБ
3500 об/мин в течение 8 мин, затем отобрали надосадочную жидкость, которую использовали в качестве испытуемых образцов. Анализ белково-пептидного состава экстрактов выполняли методом электрофореза в 15 и 18% полиакрила-м и дном геле. В качестве свидетелей использовали маркер, включающий одиннадцать стандартов с молекулярными массами 250, 150.100, 70, 50, 40, 30, 20,15,10 и 5 цДа (фирмы Fermentas, Литва).
Параллельно производили разделение и очистку полученных экстрактов на установке для ультрафильтрации Vivaflow 200 (Sartorius, Германия) с использованием мембран с диаметром отверстий 5кДа и 30 «Да под давлением Р-2,5 бар. Таким образом экстракты были разделены на три фракции по соответствующим молекулярным массам: 1 - до 5 кДа; 2 - от 5 до 30 кДа; 3 - от 30 и более кДа. После чего во всех полученных образцах определяли концентрацию белка биуретовым методом с использованием фотометра BioChem SA (HTI, США) [21].
Результаты исследования
Анализ электрофореграмм в 15% (Рис. А) и 18% геле (Рис. Б) показал, что в экстрактах содержится большое количество как высокомолекулярных, так и низкомолекулярных соединений.
В экстракте слизистой оболочки языка (Рис. А, трек1) обнаружены 19 полос. Присутствует минорная белковая зона в диапазоне 5-9 кДа, обнаружены низкомолекулярные соединения до 5 кДа; минорная попоса 13-14 кДа, четкие отдельные полосы в диапазоне 18-54 кДа (17-19 кДа,
М, кДа ст
20-22 кДа, 24-25 кДа. 27-28 кДа, 28-29 кДа, 29-30 кДа, 33-34 кДа, 35-37 кДа, 38-39 кДа, 40 кДа, 43-45 кДа, 52-55 кДа), 85-86 кДа; минорные полосы в диапазонах 22-23 кДа, 25-26 кДа, ярко выраженная белковая зона в диапазоне от 59 до 72 кДа. При анализе электрофореза слизистой оболочки языка в 18% ПААГ, отмечено соответствие результатов с данными, полученными при электрофорезе в 15% ПААГ, обнаружено 28 полос. Также присутствуют четкие белковые зоны 13-14 кДа, 28-29 кДа, 38-39 кДа, 43-45 кДа, 56-70 кДа, 85-86 кДа; минорные белковые зоны 17-18 кДа, 20-21 кДа, 21-22 кДа, 22-23 кДа. Получено более детальное разделение низкомолекулярных белковых зон (отмечены полосы от 2 до 6 кДа, 11-12 кДа, 14-15 кДа, 16 кДа), в диапазоне от 18 до 54 кДа проявились минорные зоны 31 кДа, 32-33 «Да, 52-53 кДа, 54-55 кДа. Отмечено появление четкой полосы, соответствующей молекулярной массе 100-101 кДа.
В экстракте слизистой оболочки ротовой полости (Рис. А, трек 2) обнаружены 20 полос. Присутствуют 2 интенсивные белковые полосы в диапазоне 7-9 кДа, 11-12 кДа; возможны и более низкомолекулярные соединения; четкие полосы в диапазонах 13-14 кДа, 18-19 кДа, 2642 кДа (26-27 кДа, 29-30 кДа, 34-35 кДа, 35-36 кДа, 38-39 кДа, 41-42 кДа), 85-86 кДа, 100-101 кДа, 148-149 «Да; минорные полосы в диапазонах 16-17 кДа, 21-22 кДа, 24-25 кДа, 45-46 кДа, 50-52 кДа; четкая белковая зона в диапазоне от 52 до 75 «Да. При анализе электрофореза слизистой оболочки ротовой полости в 18% ПААГ обнаружены 30 полос. Отме-
М,
20 15 10
5
Рис. А. Электрофорез в 15% ПААГ
Условные обозначения:
Ст-Маркеры молекулярной массы
1- экстракт слизистой оболочки языка
2- экстракт слизистой оболочки ротовой полости
3- экстракт слизистой оболочки носовой полости |ляточок] и- экстракт слизистой оболочки прямой кишки (ануса!
I, кДн ст, т в 100 —
ьо
30
20 1 ММ
10 — 5
Рис, Б, Электрофорез в 15% ПААГ
20)5 | №5 ВСЕ О МЯСЕ
чено значительное соответствие результатов с данными, полученными при электрофорезе е 15% ПААГ. Показано присутствие четких белковых зон в области 11-12 кДа, 13-14 кДа, 26-27 кДа, 34-35 кДа, 35-36 кДа, 38-39 кДа, 41-42 кДа, 100-101 кДа; минорных белковых зон в районе 16-17 кДа 21-22 кДа. Также было получено детальное разделение минорных зон в диапазоне 17-18 кДа, 20-21 кДа, 29-30 кДа, 49-50 кДа; четких зон 25-26 кДа, 28-29 кДа, 30-31 кДа, 32-33 кДа, 43-45 кДа, 47-48 кДа, 149-150 кДа.
В экстракте слизистой оболочки носовой полости (Рис. А, трек 3) обнаружены 18 полос. Присутствуют 2 интенсивных белковых полосы в диапазоне 11-12 кДа; четкие белковые зоны в диапазонах 22-23 кДа, 26-27 кДа, 28-29 кДа, 34-35 кДа, 35-36 кДа, 39-40 кДа, 42-43 кДа,
43-44 кДа, 85-86 кДа, 100-102 кДа, 148-149 кДа; минорные белковые зоны в диапазонах 24-25 кДа, 25-26 кДа, 31-32 кДа, 50-52 кДа; четкая ярко выраженная белковая зона в диапазоне от 52 до 75 кДа. При анализе электрофореза слизистой оболочки носовой попости в 18% ПМГ отмечено соответствие результатов с данными, попученными при электрофорезе в 15% ПААГ, обнаружены 30 полос. Присутствуют полосы четкие бепковые зоны 26-27 кДа, 28-29 кДа, 34-35 кДэ, 35-36 кДа, 39-40 кДа; минорные белковые зоны в обпасти 24-25 кДа, 25-26 кДа. Более детально проявились минорные зоны 23-24 кДа, 45-46 кДа. 96-97 кДэ; ярко выражены зоны 12-13 кДа, 14 кДа, 19 кДа. 32-33 кДа, 36-37 кДа,
44-45 кДэ, 47-48 кДа, 89-90 кДа: 149-150 кДа.
В экстракте слизистой оболочки прямой кишки (ануса) (Рис. А, трек 4) обнаружены 18 полос. Присутствует нечеткая белковая зона в диапазоне 10-12 кДа, возможны и более низкомолекулярные соединения; четкая ярко выраженная белковая зона в диапазонах 23-24 кДэ, 25-26 кДа, 28-29 кДа; 30-31 кДэ, 37-38 «Да, 38-39 кДа: 39-40 кДа, 49-50 кДа, 54-55 кДа, 85-86 кДа, 100-101 кДа. 148-149 кДа; минорные белковые зоны в диапазонах 25-26 кДа, 32-33 кДа, 33-34 кДа. 52-53 кДа; ярко выраженная белковая зона в диапазоне от 53 до 75 «Да При анализе электрофореза слизистой оболочки ануса в 18% ПААГ отмечено соответствие результатов с данными, полученными при электрофорезе е 15% ПМГ, обнаружено 23 полосы. Также присутствуют полосы четкие белковыеэоны 25-26 кДа, 28-29 кДа, 38-39 кДа, 54-55-кДа, 100-101 кДа;Болеедетально проявились минорные зоны 14-15 кДа; четкие белковые зоны в обпасти 12-13 кДа, 33-34 кДа, 120-121 кДа и 150-151 кДа,
Содержание белка в экстрактах, разделенных на фракции, представлено в таблице 1. Показано, что максимальное количество бепковых соединений в образцах фракций с молекулярными массами менее 5 кДа выяв-пено в экстрактах ротовой и носовой (пяточка) полостей, Во фракциях молекулярной массой от 5 до 30 кДа, высокая концентрация белка показана в экстрактах прямой кишки и ротовой попости, среди фракций более 30 кДа наибольшее количество белка отмечено в экстрактах носовой попости и языка (Табл. 1). Эти данные коррели-
руют с результатами электрофоретических исследований и подтверждают содержание в экстрактах белков в широком диапазоне молекулярных масс.
Анализ полученных данных с использованием международных баз данных предположительно указывает на содер-
Табл.1. Количественное содержание белка в экстрактах, разделенных на фракции
Обрак'ц >кс факта слизи- Содержание белки в исследуемых фракциях, г/л
стой оболочки < 5 кДа 5 - 30 кДа > 30 кДа
Ротовон полости ] .87±0.15 0,775(1,22 27,211,2
Ячмка 0.04 ¿0,01 0,59+0.13 32,5±1.6
Носовой ПОЛОС! Н 1 Л4±0,10 0,47*0,12 39,2±1,9
Прямой КИШЮ1 0.75±0,0« Ы0±0,14 21,2±1,0
жание в экстракте слизистой оболочки языка следующих белков, задействованных в иммунных реакциях: Интегрин-бета (87 кДа, 86 кДа}, Бета-катенин (85 кДа), белок АМОТ (73 кДа), белок-рецептор серина/треонинкиназы(57 кДа, 58 кДа, 60 кДа). полипиримидиновый путесвязывающий белок -1 (60 кДа), белок РРЭ2 (57 кДа), белок 1ГОР тюкозо-6-дегидрогеназы (55 кДа), МНС класса 1 антиген (40кДа), Бета-дефензин (17 кДа), белок ШР глкжо-6-дегидрогеназы (5 кДэ), белок МАРН4 белок (4 кДа). белок ЫЭО 1 (2 кДа). В экстракте слизистой оболочки ротовой полости предположительно были определены следующие белки: Хордин (102 кДа), Интегрин-бета (87 кДа, 86 кДа), белок АМОТ (73 кДа), белок-рецептор серина/треонинкиназы(57 кДа, 58 кДа, 60 кДа), полипиримидиновый путесвязывающий белок -1 (60 «Да), белок ГИ52 (57 кДа), белок ДОР глюко-6-дегидрогенэзы (55 кДа), Интегрин-бета (50 кДа), МНС класса 1 антиген (40кДа). Бета-дефензин (17 кДэ), В экстракте слизистой оболочки носовой полости предположительно были определены следующие белки: Хордин (102 кДа), Интегрин-бета (87 кДа. 86 кДа), Бета-катенин (85 кДа), белок АМОТ (73 кДа), белок-рецептор серина/тре-онинкиназы (57 кДа, 58 кДа, 60 кДа), полипиримидиновый путесвязывающий белок -1 (60 кДа), белок РКБ2 (57 кДа), белок ШР глюко-6-дегидрогеназы (55 кДа), Интегрин-бета (50 кДа). МНС класса 1 антиген (40кДа). В экстракте слизистой оболочки прямой кишки предположительно были определены следующие белки; Интегрин-бета (67 кДа, 86 кДа), Бета-катенин (85 кДа), бепок АМОТ (73 «Да), белок-рецептор серина/треонинкиназы (57 «Да, 58 «Да, 60 кДа), полипиримидиновый путесвязывающий белок - 1 (60 «Да), белок (57 «Да), белок 1ЮР глюко-6-дегидрогенаэы (55 кДа), Интег-рин-бета (50 кДа), МНС класса 1 антиген (40кДа) [22].
Охарактеризованные соединения в организме участвуют во многих процессах, а именно способствуют более быстрому ранозаживлению, обладают противоопухолевой и антибактериальной активностями с широким спектром
ВСЕ О МЯСЕ №5 | .
действия против различных грибковых и бактериальных патогенов, активируют различные ферменты.
В дальнейшем предполагается изучить антимикробные свойства пептидов in vivo и ex vivo грамотрицательных и грамположительных бактерий и грибов.|
КОНТАКТЫ
Чернуха Ирина Михайловна
+7 [495) 676-7211
Федулова Лилия Вячеславовна Василевская Екатерина Романовна Ертикеева Екатерина Александровна Ахремко Анастасия Геннадьевна
+7 [495) 676-9211
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
1. Абатуров, Д. Е, Катионные антимикробные пептиды системы неспецифической защиты респираторного тракта: дефензины и кателиидины / А. Е. Абатуров // Теоретична медицина, -2011, - №7,- С. 161-170.
2. DorinJ.R. Chapter 30- Mammalian Antimicrobial Peptides; Defensins and Cathelicidins/ J.R. Dorin, B. J. McHugh, S. L. Cox, DJ. Davidson// Molecular Medical Microbiology (Second Edition). - 2015. - V. 2. - P. 539-565.
3. Ha kar sso n A, P. protective ef fects of h u ma n m i I k a nti m i с rob ia I peptides against bacterial infection/ A. P. Hakansson// Jomal dePediatria. - 2015. -V. 91,1,1. -P. 4-5.
4. Алешина Г. M. Современная концепция об антимикробных пептидах как молекулярных факторах иммунитета / Г М. Алешина, В. Н. Кокряков, 0. В. Шамова, Д. С. Орлов // Медицинский академический журнал. - 2010, ■ Ne4. - 149-160.
5. Ian Ren. Six defensins from the triangle-shell pearl mussel Hyriopsis cumingii. /Ren Qian, Meng Li, Chi-Yu Zhang, Ke-PingChen// Fish & Shellfish Immunology. - 2011. - V. 31, I. 6. - P. 1232-1238.
6. Vanagi S. Significance of human c-defensins in the epithelial lining fluid of patients with chronic lower respiratory tract infections / S. Yanagi, J. Ashitani, K. Imai [et al.j // Clin. Microbiol. Infect. - 2007. - Vol. 13, N 1. - P. 63-69.
7. Gerdol M. Big defensins and mytimacins, new AMP families of the Mediterranean mussel Mytilus galloprovincialis/ M. Gerdol, G. De Mora, C. Manfrin, P. Venier, A. Pallavicini// Developmental & Comparative Immunology. - 2012. - V. 36,1.2.-P. 390-399.
8. Harrisona P !-.. Antimicrobial peptides from scorpion venoms / P. L. Harrisona, M. A. Abdei-Rahmana, K. Millera, P. N. Strong//Toxicon. - 2014. - V. 88,1.15. - P. 115-137.
9. Pluzhnikov K. A. Linear antimicrobial peptides from Ectatomma quadridens ant enom/ K. A. Pluzhnikov, S. A. Kozlov,, A. A. Vassilevski, 0. V. Vorontsova, A. V. Feofanov, E. V. Grishin//Biochimie. - 2014. -V. 107, P. B. - P. 211-215.
10. LeeaH. Scolopendin 2, a cationiс antimicrobial peptide from centipede, and its membrane-active mechanism/ H. Leea, J.-S. Hwangb, J. Leec, J. I. Kimc, D. G. Lee// Biochimica et Biophysica Acta (ВВД) - Siomembranes. - 2015. - V, 1848, I, 2,-P, 634-642,
11. Xia X. The antimicrobial peptide cathelicidin-BF could be a potential therapeutic for Salmonella typhi murium infection/ X. Xia, L. Zhang, Y. Wang// Microbiological Research. -2015.-V. 171.-P. 45-51.
12. 8ais R. Epithelial antimicrobial peptides in host defense aga i nst infection/ R. Bals// Resp. Res. - 2000. - N 1. - P. 141-150.
13. Seoa J.-K. Antimicrobial functinn of SHpAP, a novel hemoglobin p chain-related antimicrobial peptide, isolated from the liver of skipjack tuna, Katsuwonus pelamis/ J.K. Seoa, M. J. Leeb, H.-G. Jungb, H.-J. Gob, Y. J. Kimc, N. G. Park// Fish & Shellfish Immunology. - 2014. - V. 37, I. l.-P. 173-183.
14. Seoa J.-K. Antimicrobial function of the GAPDH-related antimicrobial peptide in the skin of skipjack tuna, Katsuwonus pelamis/ J.-K. Seoa, M. J. Leeb, H.-J. Gob, Y. J. Kimc, N. G. Park// Fish & Shellfish Immunology. - 2014. -V.36,1.2.-P. 571-581.
15. Budikhina A.S. Defensins - multifunctional cations peptides of human / Budikhina A S., Pinegin B.V. // Immunopathology, allergology, infectology. 2008. - Vol.2, N l.-P. 31-40.
16. Antoni L Human colonic mucus isa reservoirforantimicrobial peptides./ L. Antoni, S. Nuding, D, Weller, (VI. Gersemann, G. Ott, J. Wehksmp, E. F. Stange// Journal of Crohn's and Colitis. - 2013. - V. 7,1.12. - P. e652-e664.
17. Melon! M. Preliminary study on expression of antimicrobial peptides in European sea bass (Dicentrarchus labrax) following in vivo infection with Vibrio anguillarum. A time course experiment/ M. Meloni, S. Candusso, M. Galeotti,
D. Volpatti// Fish & Shellfish Immunology - 2015. - V. 43, 1.1, - P, 82-90.
18. Чернуха И.М. О продлении сроков хранения мясного сырья/ И.М, Чернуха, А.Н. Макаренко, Л.6. Федулова, Г.С. Толмачева // Мясная индустрия. - 2012 г. - №10. -Стр. 12-14.
19. Чернуха И.М. Биотрансформация побочного мясного сырья как инновационный подход к созданию протеомно-пептидных средств направленного действия./И.М. Чернуха, Л.А. Люблинская, Л.В. Федулова,
E.Р. Василевская, Е.Д. Котенкова, А.Н. Макаренко// Все о мясе. - 2015. - №2. - С. 14-17.
20. Rapista A. Human defensins 5 and 6 enhance HIV-1 infectivity through promoting HIV attachment / A. Rapista, J. Ding, B. Benito, Y. Lo, M. Neiditch, W. Lu, Th. L Chang// Retrovirology. - 2011. - V. 8. - P. 45-55.
21. Э.Г. Розанцев, Е.И. Симбмрева, H.C, Данилова, В.В. Бойко, Л,И, Салитринник / практикум по биологической химии/МГУПП. -2004г. - 130с.
22. Protein Knowledgebase (UniProtKB), 2002-2014 [Электронный ресурс]. URL: http://www.uniprot.org (Дата обращения 15.03.2015).
20Б | №5 ВСЕ О МЯСЕ
