CC BY
49
УДК 612.398.1:547.964.4
Вестник СПбГУ. Сер. 3, 2010, вып. 2
А. В. Комлев, О. В. Шамова, Ю. В. Андреева, В. Н. Кокряков
ИЗУЧЕНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ СЦИФОИДНОЙ МЕДУЗЫ CYANEA CAPILLATA*
Введение
В последнее время все большее внимание уделяется изучению механизмов врожденного иммунитета животных, которые обеспечивают их защиту на первых этапах взаимодействия с патогенами. Важнейшими молекулярными компонентами системы врожденного иммунитета являются антимикробные пептиды (АМП) и белки [1]. К АМП относят группу пептидов, обладающих следующими физико-химическими параметрами: они положительно заряжены (минимальный положительный заряд +2, чаще +4, +5), имеют низкую молекулярную массу (не более 10 кДа) и третичную структуру, в которой гидрофобные и гидрофильные боковые группы аминокислот пространственно разобщены, т. е. молекулы являются амфипатическими. Эти свойства АМП лежат в основе их действия на клетки патогенов, которое заключается в дестабилизации и последующем разрушении клеточной мембраны, что, в свою очередь, вызывает серьезные системные повреждения, несовместимые с жизнедеятельностью микробных клеток [8]. Это отличает АМП животных от антибиотиков микробного происхождения, действие которых, как правило, чаще направлено на разнообразные мишени, локализованные внутри клетки. Необходимо отметить, что in vivo АМП действуют кооперативно друг с другом и другими факторами врожденного иммунитета, обеспечивая наиболее эффективные защитные реакции организма-хозяина [13].
Наличие АМП у беспозвоночных животных указывает на древнее происхождение этой группы соединений. К настоящему времени описаны первичные структуры нескольких сотен индивидуальных АМП, выделенных из животных различных таксономических групп [1, 2, 6, 8], родственно не связанных между собой, а также растений, что является неоспоримым свидетельством универсальности и важности выполняемых АМП функций [5]. Наиболее широко АМП и белки изучены у представителей позвоночных животных, а также у насекомых. Антимикробные же пептиды большинства таксономических групп беспозвоночных животных остаются малоизученными, в то время как именно эти животные, не имея системы приобретенного иммунитета, обладают наиболее эффективной системой врожденного иммунитета. Поиск новых АМП и белков важен не только с фундаментальной, но и с практической точки зрения. В связи с растущей резистентностью микроорганизмов к традиционно используемым в медицине антибиотикам микробного происхождения в последние годы появляется необходимость создания антимикробных препаратов нового поколения. Кандидатами на роль таких антибиотиков являются АМП животного происхождения, поскольку, действуя при более низкой минимальной ингибирующей концентрации по сравнению с традиционны-
* Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (гранты №07-04-01759, №09-04-01655) и ФАНИ (грант №02.512.11.2234).
© А. В. Комлев, О. В. Шамова, Ю.В.Андреева, В. Н. Кокряков, 2010
ми антибиотиками, они не вызывают появления устойчивых штаммов микроорганизмов. Кроме того, наряду с антибиотической активностью некоторые из таких пептидов проявляют и другие функциональные свойства: противовоспалительное, противоопухолевое, иммуномодулирующее, что обусловливает интерес к ним как к матрицам для создания лекарственных препаратов.
Настоящая работа посвящена поиску, выделению и характеристике новых АМП из тела сцифоидной медузы Cyanea capillata, являющейся представителем типа кишечно-полостые (Cnidaria), класса сцифоидные (Scyphozoa), с последующим изучением наиболее активных катионных пептидов, их физико-химических свойств и оценкой антимикробной активности против грамотрицательных, грамположительных бактерий и грибков. Медузы являются древними в эволюционном плане животными, но малоисследованными в отношении наличия АМП. Исследование защитных молекул этих животных представляет несомненный интерес, поскольку сведения об АМП и белках кишечнополостных к настоящему времени ограничиваются лишь несколькими опубликованными работами, выполненными на кафедре биохимии СПбГУ совместно с сотрудниками Института биоорганической химии РАН, которые были посвящены изучению структурно-функциональных свойств антимикробного пептида аурелина из тела сцифоидной медузы Aurelia aurita [3, 4, 10].
Материалы и методы исследования
Объект исследования — сцифоидная медуза Cyanea capillata, представитель типа кишечнополостные (Cnidaria), класса сцифоидных медуз (Scyphozoa). Материал был собран на Белом море в августе 2008 г. Тела медуз были препарированы, помещены в 0,2 М натрий-ацетатный буфер и хранились на холоде (4—5°С) до экстракции. Экстракцию катионных белков и пептидов проводили из щупалец, купола и «середины», включающей ротовые хоботки и гонады. Препарированные части тела медуз разрушали гомогенизацией в 0,2 М натрий-ацетатном буфере (рН 4,6) в стеклянном гомогенизаторе со стеклянным пестиком. Гомогенат центрифугировали при 500 g в течение 1 ч, после чего супернатант отбирали, а к осадку добавляли 2 М натрий-ацетатный буфер до концентрации 0,2 М и ресуспендировали. Суспензию повторно осаждали центрифугированием при 500 g в течение 1 ч. Полученный супернатант объединяли с предыдущим. Объединенные супернатанты центрифугировали при 3000 g в течение 1,5 ч. Полученные супернатанты центрифугировали при 15 000 g в течение 1,5 ч. Последние экстракты подвергали ультрафильтрации при давлении 4 атм. на установке «Amicon» модель 402 через фильтр «Millipore» YM-10 с номинально отсекаемой молекулярной массой 10 кДа. Полученные ультрафильтраты далее разбавляли до концентрации буфера 0,05 М.
Хроматографическую очистку фракций белков и пептидов проводили на колонке с карбоксиметилцеллюлозой (КМЦ). Колонку уравновешивали 0,05 М натрий-ацетатным буфером (рН 4,6). Элюцию осуществляли линейным градиентом (0-0,8 М) раствора NaCl со скоростью 6 мл/ч. Хроматографическую очистку экстрактов купола и щупалец проводили совместно, «середины» (ротовых хоботков и гонад)—отдельно. Объемы собираемых фракций составляли 3 мл. Далее на спектрофотометре была измерена оптическая плотность собранных фракций при длине волны 225 нм. Фракции с оптической плотностью больше средней концентрировали высушиванием под вакуумом на центрифуге Savant Speed Vac SC 110-240 и далее фракционировали с помощью обра-щенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) на уста-
новке фирмы «Весктап». Разделение проводили на колонке Alltech C-18 (4,6 х 250 мм; сорбент Macrosphere 300 C 18, диаметр частиц 5 мкм) в градиенте концентрации аце-тонитрила (0-60%, 1%/мин) в 0,1%-ной трифторуксусной кислоте (ТФУ) [7]. Спектр пептидов в полученных препаратах оценивали методом электрофореза в кислой буферной системе в присутствии мочевины в пластинах полиакриламидного геля (ПААГ) на приборе фирмы «Hoefer» (США) [11]. В качестве стандарта использовали смесь дефен-синов кролика (NP-1, 2, 3, 4, 5). Чистоту полученных препаратов и приблизительную молекулярную массу пептидов оценивали при помощи электрофореза в присутствии до-децилсульфата натрия (ДС-Na) в пластинах ПААГ на приборе фирмы «Hoefer» (США) [12]. Напряжение электрического поля при электрофорезе составляло 10 В/см. В качестве стандарта использовали молекулярный весовой маркер для белков («Sigma», США), в состав которого входили белки с молекулярными массами: 2,8 (инсулин, а и в цепи), 6,2 (ингибитор трипсина быка), 14,3 (лизоцим), 18,4 (в-лактоглобулин), 29,0 (карбоангидраза), 43,0 (овальбумин) кДа.
Точную молекулярную массу пептидов оценивали при помощи MALDI-TOF (Matrix assisted laser desorbtion/ionization Time-of-Flight) масс-спектрометрии на приборе «Voy-adger» DE (Perseptive Biosystem Inc., USA) с использованием а-циано-4-гидроксикорич-ной кислоты в качестве матрицы. Качественное определение дисульфидных связей в катионных пептидах осуществляли путем окисления их надмуравьиной кислотой и последующего электрофоретического анализа [9]. О возможном наличии дисульфидных связей свидетельствует изменение электрофоретической подвижности пептидов, обработанных надмуравьиной кислотой, разрывающей SS-связи и окисляющей SH-группы до сернистокислых групп (SO3), в ПААГ в кислой буферной системе по сравнению с контрольными пробами.
Каждому этапу очистки белков и пептидов сопутствовало определение их антимикробной активности. Антибиотическое действие катионных пептидов определяли методом радиальной диффузии в ПААГ, предложенным Р. И. Лерером и соавторами [9], в отношении: Escherichia coli, штамм ML-35p и Listeria monocytogenes, штамм EGD и Candida albicans, штамм 820. Для полуколичественной оценки антибиотического действия пептидов измеряли диаметр зон лизиса вокруг лунок, в которые наносили пробы, принимая за 1 единицу 1 мм и вычитая из измеренного значения 25 единиц, соответствующих диаметру лунки. В качестве стандарта использовали дефенсин кролика NP-1. Определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК) проводили в ПААГ, содержащем вышеупомянутые микроорганизмы. В качестве стандарта был использован дефенсин кролика NP-1. Антимикробная активность препаратов также изучалась методом наложения ПААГ после проведения в нем электрофореза в кислой буферной системе на чашку Петри с культурой тест-микроорганизма.
Результаты исследований и их обсуждение
Анализ полученных экстрактов из тканей тела медузы Cyanea capillata в 0,2 М натрий-ацетатном буфере (рН 4,6) показал, что все они содержат отдельные фракции белков (рис. 1), которые в большей степени обладают антимикробной активностью в отношении грамотрицательной Escherichia coli (рис.2), чем грамположительной Listeria monocytogenes. Антимикробная же активность экстрактов в отношении Candida albicans очень мала. После проведения трех этапов экстракции в 0,2 М натрий-ацетатном буфере и процедуры ультрафильтрации через фильтр «Millipore» YM-10 были получены фракции пептидов, имеющих молекулярную массу не более 10 кДа. Затем
Рис. 1. Предварительный электрофорез экстрактов из тканей тела медузы Суапеа еарШаЬа в кислой буферной системе:
1 — экстракт щупалец; 2 — экстракт целой медузы; 3 — экстракт тела медузы без щупалец
полученные фракции были подвергнуты хроматографической очистке и разделению. Фракции, в которых наблюдалось наибольшее поглощение при длине волны 225 нм, тестировали на наличие антимикробной активности в отношении вышеупомянутых тест-микроорганизмов методом радиальной диффузии в ПААГ. Антимикробная активность в отношении Escherichia coli и Listeria monocytogenes наблюдалась почти во всех выбранных для тестирования фракциях с максимальным значением в 40 единиц во фракциях «середины» №42, 49, 50, 51, 57 (рис.3, А, Б). Анализ фракций электрофорезом в присутствии ДС-Na показал, что молекулярные массы пептидов, составляющих эти фракции, находятся в пределах 2800-4500 Да (рис. 4).
Ввиду гетерогенности полученных фракций и низкого содержания в них пептидов после хроматографическиго разделения на колонке с КМЦ провели дальнейшие концентрацию, разделение и очистку катионных пептидов методом ОФ ВЭЖХ. При этом последовательные фракции с похожим значением оптической плотности при длине вол-
Рис. 3, А. Антимикробная активность Рис. 3, Б. Антимикробная активность наи-
наиболее активных фракций в отношении более активных фракций в отношении Listeria Escherichia coli, штамм ML35p monocytogenes, штамм EDG
Рис. 4- Электрофорез наиболее активных фракций в присутствии ДС-Na
Первая дорожка (слева — направо) — фракция №42; вторая — №49; третья — смесь белковых стандартов; четвертая — фракция №57
ны 225 нм объединили для упрощения и ускорения анализа. Хроматограмма разделения объединенных фракций № 48-57 методом ОФ ВЭЖХ с использованием линейного градиента концентрации ацетонитрила (0-60%, 1%/мин) в 0,1%-ной ТФУ изображена на рис. 5. Разделение осуществляли на колонке АШесЬ С-18. Скорость элюции составляла 1 мл/мин. Объем собираемых фракций составлял 1 мл. Детекцию осуществляли при длине волны 225 нм. Сопоставление хроматограммы с данными по антимикробной активности фракций после ОФ ВЭЖХ (таблица) показывает, что наибольшей антимик-
А-225 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 -0,2 -0,4 -0,6
0 10 20 30 40 50 60
Время, мин
Рис. 5. Хроматограмма разделения объединенных фракций №48-57 методом ОФ ВЭЖХ в градиенте концентрации ацетонитрила (0-60%, 1%/мин) в 0,1%-ной ТФУ на колонке АНесЬ С 18
Антимикробная активность фракций №16 и 17 после ОФ ВЭЖХ
№ фракции Антимикробная активность в условных единицах
ЕзсНепсЫа. соЫ ЫвЬепа, топосуЬодепез
16 40 10
17 35 10
№-1 50 65
робной активностью обладают фракции, элюируемые, на 16-17-й минутах, которым на хроматограмме (см. рис. 5) соответствуют отдельные пики.
Гомогенность и молекулярную массу пептида полученных фракций оценивали электрофорезом в денатурирующих условиях в присутствии ДС-Ма. Фракциям № 16 и 17 в геле соответствовала единичная полоса на уровне приблизительно 2800 Да. Электрофо-ретическую подвижность полученных пептидов в кислой буферной системе определяли аналитическим электрофорезом в кислой буферной системе. Подвижность пептидов была близка к подвижности дефенсина кролика МР-2. Таким образом, выделенный пептид обладал молекулярной массой и зарядом при рН 2, близкими к молекулярной массе и заряду дефенсина кролика МР-2.
В настоящее время проводится работа по выделению достаточного количества найденных пептидов. Далее будут определены наличие/отсутствие в их молекулах дисуль-фидных связей, точная молекулярная масса и первичная структура, а также структуры их генов, на основе чего можно будет судить о принадлежности этих пептидов к какому-либо из известных классов АМП.
Литература
1. Кокряков В. Н. Биология антибиотиков животного происхождения. СПб., 1999, 162 с.
2. Кокряков В. Н. Очерки о врожденном иммунитете. СПб., 2006, 261 с.
3. Меньшенин А. В., Алешина Г. М., Клушевская Е. С., Леонова Ю. Ф., Овчинникова Т. В., Краснодембский Е. Г., Кокряков В. Н. Новый антимикробный пептид из сцифоидной медузы Aurelia aurita // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3. 2006. Вып. 4. С. 116-122.
4. Меньшенин А. В., Алешина Г. М., Леонова Е. Е., Овчинникова Т. В., Краснодембский Е.Г., Кокряков В.Н. Дефенсиноподобные пептиды сцифоидной медузы Aurelia aurita // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3. 2001. Вып. 4. С. 99-103.
5. Boman H. G. Peptide antibiotics and their role in innate immunity // Annu. Rev. Immun. 1995. Vol. 13. P. 61-92.
6. Bulet Ph., Stocklin R., Menin L. Antimicrobial peptides: from invertebrates to vertebrates // Immunol. Revs. 2004. Vol. 198. P. 169-184.
7. Kokryakov V. N., Harwig S. S. L., Panyutich E. A., Shevchenko A. A., Aleshina G. M., Shamo-va O. V., Korneva H. A., Lehrer R. I. Protegrins: leukocyte antimicrobial peptides combine features of corticostatic defensins and tachyplesins // FEBS Lett. 1993. Vol.327, N2. P. 231-236.
8. Lehrer R. I., Ganz T. Defensins of vertebrate animals // Curr. Opin. Immunol. 2002. Vol. 14. P. 96-102.
9. Lehrer R. I., Rosenman M., Harwig S. S., Jackson R., Eisenhauer P. Ultrasensitive assays for endogenous antimicrobial polypeptides // J. Immunol. Methods. 1991. Vol. 137. P. 167-173.
10. Marchini D., Giordano P. C., Amons R. et al. Purification and primary structure of cerato-toxin-A and ceratotoxin-B, 2 antibacterial peptides from the female reproductive accessory glands of the medfly Ceratitis capitata (Insecta, Diptera) // Insect Biochem. Molec. Dial. 1993. Vol.23. P. 591-598.
11. Ovchinnikova T. V., Balandin S. V., Aleshina G. M., Tagaev A. A., Leonova Y. F., Krasnodembsky E. G., Menshenin A. V., Kokryakov V.N. Aurelin, a novel antimicrobial peptide from jellyfi sh Aurelia aurita with structural features of defensins and channel-blocking toxins // Biochem. Biophys. Res Commun. 2006. Vol. 348, N 2. P. 514-523.
12. Panyim S., Chalkley R. High resolution acrylamide gel electrophoresis of histones // Arch. Biochem. and Biophys. 1969. Vol. 130, N 2. P. 337-346.
13. Schagger H., Von Jagow G. Tricine-sodium dodecylsulphate-polyacrilamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1-100 kDa // Anal. Biochem. 1987. Vol. 166. P. 368-379.
14. Zasloff M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms // Nature. 2002. Vol.415. P. 389-395.
Статья поступила в редакцию 3 декабря 2009 г.
