CC BY
80
О. Н. Зугаирова, О. В. Шамова, Д. С. Орлов, В. П. Дюбин, В, Н. Кокряков
ИЗУЧЕНИЕ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ ИЗ ЛЕЙКОЦИТОВ СЕВРЮГИ (ACJPENSER STELLATUS)*
Введение. В настоящее время, когда резистентность бактерий к традиционно используемым антибиотикам стремительно растет, появляется необходимость разработки новых лекарственных препаратов. Одними из возможных кандидатов на роль антибиотиков нового поколения могут быть природные антимикробные Пептиды (АМП), содержащиеся в фагоцитирующих клетках человека и животных и представляющие собой эффекторные молекулы системы врожденного иммунитета [1,7]. Поэтому поиск и изучение АМП животного происхождения становится актуальной задачей биологии и медицины в настоящее время. Целью данной работы было исследование АМП из лейкоцитов севрюги Acipenser stellatus, принадлежащей отряду осетровых рыб.
Рыбы находятся в тесном контакте с окружающей их водной средой, в которой присутствует большое количество разнообразных патогенных микроорганизмов. Необходимо отметить, что у рыб и других холоднокровных животных именно система врожденного иммунитета играет ключевую роль в защите от инфекций, так как в условиях низких температур система приобретенного иммунитета работает недостаточно эффективно и для продукции антител требуется длительное время. Так, например, для лососевых продукция антител занимает около 4-6 недель даже в относительно теплой воде в летнее время [2], в то время как многие микроорганизмы могут вызывать гибель рыб в течение нескольких дней инфекции. Таким образом, именно система врожденного иммунитета, обеспечивающая быстрый и не столь зависимый от температуры окружающей среды ответ, играет для рыб жизненно важную роль. Поэтому можно ожидать, что изучение молекулярных факторов системы врожденного иммунитета рыб приведет к открытию новых пептидов с высокой антимикробной активностью, которые в дальнейшем могут послужить моделями для создания новых антибиотических лекарственных препаратов. Кроме того, исследование АМП рыб является важным и актуальным для выяснения закономерностей эволюции фактором системы врожденного иммунитета позвоночных животных.
Работа посвящена поиску, выделению и характеристике новых антимикробных пептидов из лейкоцитов крови севрюги Acipenser stellatus. В задачи работы входило: выявление антимикробных белков и пептидов в кислотных экстрактах из лейкоцитов севрюги с последующим выделением и очисткой наиболее активных катионных пептидов; изучение их физико-химических свойств и оценка их антимикробной активности против грам-отрицательных и грамположительных бактерий и низших грибов.
Методы. Получение и обработка крови. Рыб отлавливали в дельте Волги в мае-июне на биологической станции Астраханского заповедника. Кровь получали путем разреза сосудов на уровне жаберных дуг, стабилизировали ее гепарином, конечная концентрация которого составляла 10-15 ME в мл. После 6 ч нахождения в сосудах кровь расслаивалась, лейкоцитарную пленку (buffy coat) отбирали и промывали дважды физиологическим раствором с последующим центрифугированием в течение 5 мин при 400 g. Лейкоцитарный осадок помещали в 20%-ную уксусную кислоту и перевозили в Санкт-Петербург, где продолжали экстракцию белков из лейкоцитарной фракции крови севрюги.
* Работа выполнена при поддержке РФФИ (гранты: № 06-04-49416 и № 07-04-01759) и INTAS (грант № 03-51-4984)
© О. Н. Зугаирова, О. В. Шамова, Д. С. Орлов, В. П. Дюбин, В. Н. Кокряков, 2007
Экстракция кислоторастворимых белков и пептидов из лейкоцитов севрюги и отделение фракции белков и пептидов с молекулярными массами 1-10 кДа. Полученный на предыдущем этапе материал центрифугировали при 15 ООО g один час, супернатант (экстракт 1) отбирали и оставляли для анализа; к осадку добавляли 4 объема 10%-ной уксусной кислоты, гомогенизировали в гомогенизаторе стекло-тефлон и проводили дальнейшую экстракцию катионных белков и пептидов. Материал центрифугировали при 15 ООО g в течение одного часа, после чего супернатант (экстракт 2) отбирали. Полученные экстракты объединяли и далее подвергали ультрафильтрации через мембрану «Amicon» YM-10, пропускающую молекулы с молекулярной массой не более 10 кДа, т, е. с номинально отсекаемой молекулярной массой (НОММ) 10 кДа. Раствор, прошедший через мембрану YM-10, концентрировали с помощью ультрафильтрации через мембрану фильтре «Amicon» YM-1 (НОММ 1кДа).
Препаративный электрофорез в кислой буферной системе при непрерывной элюции белков из полиакриламидного геля. Препаративный электрофорез проводили в 12.5%-ном полиакриламидном геле в кислой буферной системе в присутствии мочевины [5] в аппарате для препаративного электрофореза (Bio-Rad, модель - AG501-X8). Гель содержал 12.5% акриламида и 0.325% М,М-метилен-бис-акриламида.
Время полимеризации геля составляло около трех часов. Преэлектрофорез проводили в течение 8 ч при напряжении 20 В/см, площадь поперечного сечения трубки 10 см2, длина 12 см. Разделение проходило в течение 18-20 ч при напряжении 35 В/см. В качестве буфера использовали 5%-ный раствор уксусной кислоты. Перед нанесением на гель в пробе предварительно растворяли мочевину до конечной концентрации ЗМ.
Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОФ ВЭЖХ). ОФ ВЭЖХ проводилась на установке Gold System фирмы Beckman, США. Для разделения использовали колонку Zorbax С-18 (4.6x150 мм; диаметр частиц сорбента 5 мкм) с применением линейного градиента: вода (с 0.1%-ной трифторуксусной кислотой) - ацетонитрил. Следующий цикл хроматографии полученных белковых фракций проводили в градиенте концентрации ацетонитрила (1530%, 0.3%/мин) с использованием 0.13%-ной гептафтормасляной кислоты в качестве ионной пары.
Электрофорез в кислой буферной системе. Электрофорез в кислой буферной системе в присутствии мочевины [13] проводили в пластинах полиакриламидного геля на приборе фирмы Hoeffer (США).
Гель содержал 12.5%-ный раствор акриламида и 0.325%-ный раствор НЫ-метилен-бис-акри-ламида. Время полимеризации геля составляло около 60 мин.
В качестве электродного буфера использовали 5%-ный раствор уксусной кислоты (pH 2.2). Длительность как преэлектрофореза, так и электрофореза один час. Разделение проводили в пластинах геля длиной 75 мм и толщиной 1 мм при напряжении 20 В/1 см длины пластины геля. В качестве раствора для проб использовали ЗМ мочевину в 5%-ном растворе уксусной кислоты. На дорожку наносили 1-5 мкг белка в 10 мкл указанного раствора для проб.
Диск-электрофорез белков в присутствии додецилсульфата натрия [15] проводили в пластинах полиакриламидного геля на приборе фирмы Hoeffer (США). Разделяющий гель содержал 16%-ный раствор акриламида и 0.53%-ный раствор NjN-метилен-бис-акрилам ида, а также 0.1%-ный раствор додецилсульфата натрия. Концентрирующий гель содержал 3% акриламида, 0.1% К,К-метилен-бис-акриламида и 0.1% додецилсульфата натрия.
В качестве катодного буфера использовали буфер 0.24 М глицин - 0.025 М трис (pH 8.3) с 0.1%-ным додецилсульфатом натрия (ДС-Na). В качестве анодного буфера применяли буфер трис-НС10.2 М (pH 8.9). Напряженность электрического поля при электрофорезе составляла 10 В/см.
Определение молекулярной массы пептидов с помощью масс-спектрометрии MALDITOF. Масс-спектрометрический анализ пептидов был выполнен в Центре коллективного пользования «Аналитическая спектрометрия» на времяпролетном масс-спектрометре с ионизацией посредством лазерной десорбции с помощью матрицы (Matrix Assisted Laser Desorbtion/Ionisation Time-of-Flight MS), Voyager-DE («Perseptive Biosystem Inc», USA) с источником ионов замедленной экстракции.
В качестве матрицы использовали а-циано-гидроксикоричную кислоту (15 мг/мл) в 70%-ном ацетонитриле и 0.1%-ной трифторуксусной кислоте, в качестве внутренних стандартов - протегрин-1 и инсулин свиньи.
Выявление дисульфидных связей в молекулах пептидов. Наличие дисульфидных связей в катионных белках определяли, окисляя их надмуравьиной кислотой [3]. При окислительном расщеплении S-S групп в белках остатки цистеина и цистина с выходом >90% превращаются в цистеиновую кислоту. Надмуравьиную кислоту готовили, добавляя к 30%-ному раствору перекиси водорода муравьиную кислоту. О возможном наличии дисульфидных связей свидетельствовало изменение электрофоретической подвижности пептидов, обработанных надмуравьиной кислотой, по сравнению с контрольными пробами при проведении аналитического электрофореза в кислой буферной системе, как было описано выше.
Определение концентрации белка. Концентрацию пептидов в водном растворе определяли по методу Вольфа [16]:
Концентрация (мкг/мл) = (Поглощение., 15 - Поглощение225) 144.
Данный метод удобен для определения концентрации белка в очищенных белковых препаратах, которые не содержат примеси других компонентов, имеющих поглощение при указанных длинах волн, а также не содержащих в растворе солей или кислот, которые дают высокий фон при измерении оптической плотности.
Оценка антимикробной активности пептидов методом радиальной диффузии в агарозных гелях. Антибиотическое действие пептидов определяли по методу, предложенному Р. Л. Лерером и соавторами [9]. Использовали культуры следующих микроорганизмов: Esherichia coli, штамм ML-35p (грамотрицательная бактерия); Listeria monocytogenes, штамм EGD (грам-положительная бактерия); устойчивый к метициллину Staphylococcus aureus АТСС 33591 (MRSA) (грамположительная бактерия); Candida albicans 820 (низший гриб).
Микроорганизмы предварительно культивировали в течение 16-18 ч в среде, содержащей 3%-ный раствор триптического гидролизата сои (ТСБ) (Sigma, США) при 37 °С. Затем аликвоты суспензии бактерий отбирали и переносили в свежеприготовленную среду триптического гидролизата сои, после чего инкубировали при 37 °С в течение 2.5 ч для получения микроорганизмов, находящихся в логарифмической фазе роста. В отношении Candida albicans использовали ночную культуру.
Полученные суспензии микробов центрифугировали при 2000 об/мин в течение 10 мин, осадок дважды промывали в 10 мМ натрий-фосфатном буфере (рН=7,4) и ресуспендировали в 3 мл того же буфера. Количество клеток каждого из микроорганизмов оценивали, измеряя оптические плотности суспензий на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 620 нм (величина оптической плотности 0.2 соответствовала 5-107 микробных клеток в миллилитре [9]).
Для приготовления агарозных гелей, содержащих микроорганизмы, аликвоту суспензии, имеющую 4-106 клеток, перемешивали с 8 мл стерильного 1%-ного раствора агарозы в 10 мМ натрий-фосфатном буфере (рН=7.4) при температуре 43 °С. Полученную смесь выливали в стерильную пластиковую чашку Петри диаметром 90 мм, где смесь остывала, образуя агарозный гель.
Определяли антибиотическое действие пептидов, находящихся в 0.01%-ном водном растворе уксусной кислоты. В агарозе делали отверстия диаметром 2 мм. В лунки вносили анализируемые образцы, содержащие пептид, и инкубировали в течение 3 ч при 37 °С. В процессе инкубирования пептиды диффундировали из лунок в агарозу. Затем на поверхность агарозного геля наносили 1%-ный раствор агарозы, содержащий 6%-ный триптический гидролизат сои, после этого чашки инкубировали в течение 24 ч при 37 °С.
Для количественной оценки антибиотического действия пептидов измеряли диаметр зон, где не отмечался рост микроорганизмов, принимая за одну единицу 0.1 мм и вычитая из измеренного значения 20 единиц, соответствующих диаметру лунки.
Выявление белков и пептидов, обладающих антимикробной активностью, в полиакриламидных гелях после проведения электрофореза в кислой среде (метод наложения гелей). Приготовление агарозных гелей, содержащих микроорганизмы, проводили с использованием процедуры, описанной выше. Полиакриламидные гели (ПААГ) после проведения электрофореза анализируемых препаратов в кислой буферной системе промывали дважды в 10 мМ натрий-фосфатном буфере (pH 7.4) по 15 мин. Затем ПААГ помещали на поверхность агарозного геля, содержащего микроорганизмы, и инкубировали в течение 3 ч при температуре 37 °С. При инкубировании пептиды диффундировали из ПААГ в агарозу. После инкубирования полиакриламидные гели снимали, а на поверхность агарозного геля наносили 1%-ный раствор агарозы,
содержащий 6%-ный триптический гидролизат сои. Затем чашки инкубировали в течение 24 ч при 37 °С. После инкубации на чашках наблюдались зоны, где происходило ингибирование роста микробов. Эти зоны сравнивали с соответствующими белковыми полосами в полиакриламидных гелях, окрашенных Кумасси, и получали информацию об электрофоретической подвижности белков и пептидов, обладающих антимикробной активностью.
Анализ гемолитической активности пептидов. Для определения гемолитической активности пептидов использовали эритроциты человека. Кровь собирали в пластиковые пробирки, в которые предварительно добавляли гепарин, из расчета 10 мкл гепарина на 1 мл крови. Затем кровь центрифугировали в течение 10 мин при 1000 об/мин с охлаждением до 4 °С. Супернатант удаляли. К осадку добавляли 10 мл охлажденного забуференного физиологического раствора (ЗФР) (pH 7.4) с 4мМ ЭДТА. Перемешивали, затем центрифугировали в течение 10 мин при 1000 об/мин с охлаждением 4 °С. Надосадочную жидкость удаляли и доводили оставшийся объем до 10 мл добавлением ЗФР, перемешивали и центрифугировали при тех же условиях. Процедуру отмывания эритроцитов повторяли три раза. Из полученного осадка эритроцитов (принималось, что в осадке содержание эритроцитов - 100%) отбирали 280 мкл, доводили объем суспензии до 10 мл охлажденным ЗФР, Таким образом, получали 2.8%-ную суспензию эритроцитов. Эту суспензию использовали для приготовления проб, в которых проводили анализ гемолитической активности пептидов. Пробы состояли из 27 мкл 2.8%-ной суспензии эритроцитов и 3 мкл анализируемого пептида. После добавления пептидов получали 2.5%-ные суспензии эритроцитов. Конечная концентрация пептидов в инкубируемых пробах составляла от 1.25 до 40 мкМ. Серийные разведения анализируемых пептидов производили в 0.01%-ной уксусной кислоте (УК). Положительным контролем (100%-ный лизис эритроцитов) служили пробы, в которых к 27 мкл раствора эритроцитов добавляли 3 мкл детергента (Triton X-100, разбавленный в 10 раз в водном растворе
0.01%-ной УК). Для получения негативного контроля (0%-ный лизис эритроцитов) к 27 мкл раствора эритроцитов добавляли 3 мкл 0.01%-ной УК. Анализируемые растворы инкубировали при 37 °С в течение 30 мин. После инкубации реакцию останавливали добавлением 75 мкл охлажденного ЗФБ, пробы центрифугировали при 10 000 об/мин при 4 °С в течение 4 мин. Супернатант отбирали и вносили в ячейки 96-луночного планшета (Costar, Corning Inc.).
Измерение оптической плотности проб при длине волны 540 нм производили на фотометре Multyscan MS (Labsystems, Финляндия). Процент гемолиза подсчитывали по формуле:
(%) = OPH0 .(°JW )- 540 (0%лизис )
OD J40 (100 % лизис )- OD 54о (0% лизис )
Результаты исследования. Для обнаружения белков и пептидов, обладающих антимикробной активностью, нами был использован метод электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в кислой среде, с последующим выявлением в ПААГ белков, способных вызывать подавление роста микроорганизмов (метод наложения гелей). На рис. 1 представлен блок ПААГ, полученный после проведения электрофореза белков экстракта из лейкоцитов севрюги, и окрашенный Кумасси бриллиантовым голубым (А), а также агарозные гели (содержащие бактерии), на которые накладывали ПААГ, не окрашенные Кумасси (Б, В). На рисунке стрелкой отмечены участки, в которых наблюдалось ингибирование роста микроорганизмов. Было установлено, что в экстракте имеется ряд белков, обладающих способностью ингибировать рост грамотрицательной бактерии Esherichia coli и грамположительной бактерии Listeria monocytogenes.
Данный анализ позволил оценить электрофоретическую подвижность белков, обладающих АМН, сопоставляя расположение зон ингибирования роста бактерий в агарозных гелях и расположение белковых зон в ПААГ. Для выделения и очистки этих антимикробных компонентов был использован комплекс следующих методов: 1) ультрафильтрации, 2) препаративного электрофореза и 3) обратнофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. С целью получения препарата, содержащего низкомолекулярную фракцию белков и пептидов, была проведена ультрафильтрация
в
Ж
Рис. 1. Выявление пептидов, обладающих антимикробной активностью против Escherichia coli и Listeria monocytogenes (метод наложения гелей).
А - блок полиакриламидного геля (ПААГ) после проведения электрофореза в кислой среде препарата общих кислоторастворимых белков; БиВ- блоки агарозных гелей, содержащие микроорганизмы (Б - Escherichia coli; В - Liste?ia monocytogenes).
исходного материала через мембраны YM-10 и YM-1 соответственно. Полученный препарат, включающий белковые молекулы с массами от 1 до 10 КДа, подвергли препаративному электрофорезу в кислой среде в присутствии мочевины, позволяющему разделять полипептиды в соответствии с величиной положительного заряда их молекул. Фракции анализировали, измеряя поглощение света раствором в каждой пробирке при длине волны 280 нм, а также выявляя наличие антимикробной активности против Esherichia coli, Listeria monocytogenes и Candida albicans (рис. 2). Кроме того, белковый состав каждой фракции исследовали с помощью аналитического электрофореза в присутствии Д С-натрия. Для дальнейшего исследования были отобраны фракции с 40-й по 71-ю, где содержались наиболее активные пептиды. Молекулярные массы этих пептидов варьировали от 3 до 6 кДа. Для получения индивидуальных фракций этих АМП применяли ОФ ВЭЖХ на колонке Zorbax С-18 (4.6 ммх 15 см) фирмы Du Pont. Фракции после препаративного электрофореза наносили на колонку и вели хроматографию с использованием линейного градиента: вода (с 0.1%-ной трифторуксусной кислотой) - ацетонитрил от 0 до 60% (рис 3,А). Полученный материал анализировали с помощью электрофореза в присутствии ДС-натрия, а также оценивали антимикробную активность в каждой фракции. Чтобы получить препараты вы-сокоочищенных пептидов, потребовалось провести несколько циклов хроматографии (рис. 3, Б и В), используя при этом разные ионные пары (трифторуксусную и гептафтормас-ляную кислоты). После хроматографии нами были получены препараты двух высокоочи-щенных пептидов (Пептид 1 и Петид 2) (см. рис. 3). Электрофорез в присутствии ДС-натрия показал, что препараты не содержат примесей, и масса пептидов составляет около 5 кДа.
Масс-спектрометрическим анализом (MALDITOF) пептидов, который был выполнен в Центре коллективного пользования «Аналитическая спектрометрия», была подтверждена гомогенность выделенных пептидов и определены их молекулярные массы, которые составили 5335 и 5448 Да, т. е. пептиды отличаются всего на 113 Да.
60 80 Номера фракций
Рис. 2. Профиль элюции белков с электрофоретической колонки с ПААГ (12,5%-ный АА) фирмы Bio-Rad (США) при проведении препаративного электрофореза в кислой среде низкомолекулярной фракции кислоторастворимых белков экстрактов из лейкоцитов севрюги,
Сила тока - 30 мА, скорость элюции - 36 мл/час, объем фракций - 3 мл.
При электрофорезе в кислой среде в присутствии мочевины электрофоретическая подвижность Пептида 1 и Пептида 2 была одинаковой.
Чтобы узнать, присутствуют ли в молекулах полученных пептидов дисульфидные мостики, проводили окисление этих пептидов надмуравьиной кислотой, В результате реакции положительный заряд молекул цистин-содержащих пептидов снижается и, следовательно, их электрофоретическая подвижность по направлению к катоду уменьшается, в то время как свойства пептидов, не имеющих дисульфидных связей, не изменяются. После обработки надмуравьиной кислотой исследуемых нами пептидов, электрофоретическая подвижность их не изменилась, т. е. оба пептида не имеют в составе молекул дисульфидных мостиков и представляют собой линейные молекулы.
Нами был проведен анализ антимикробной активности Пептида 1 и Пептида 2 в отношении Esherichia coli, штамм ML-35p (грамотрицательная бактерия); Listeria monocytogenes, штамм EGD (грамположительная бактерия); устойчивый к метициллину Staphylococcus aureus АТСС 33591 (MRSA) (грамположительная бактерия); Candida albicans 820 (низший гриб). Активность пептидов изучали в разных условиях: оценивали их антимикробное действие в среде, содержащей только 0.01 М натрий-фосфатный буфер без добавления солей и в той же среде, но с содержанием 150 мМ хлорида натрия (физиологическая концентрация хлорида натрия). Для сравнения использовали два других антимикробных пептида, свойства которых хорошо изучены и описаны в литературе - протегрин-1 свиньи (его активность не зависит от концентрации соли в среде) и дефен-син человека HNP-1 (его активность снижается при добавлении в среду хлорида натрия).
!
Минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) определяли по методу Лере-ра [9]. Строили графики зависимости величины АМП пептидов, выраженной в условных единицах активности от концентрации пептидов. Величину МИК находили как точку пересечения полученных линейных регрессий с осью абсцисс. Полученные данные представлены в таблице.
А Б
Время, мин
Рис. 3. Хроматографическое разделение пептидов, содержащихся во фракциях 40-43 после препаративного электрофореза (обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография на колонке (15x0.46 см) 2огЬах С-18 (Би Роп^ в различных условиях.
А - Элюция пептидов с колонки с помощью линейного градиента: вода (с 0.1% трифторуксус-ной кислоты) - ацетонитрил от 0 до 60% за 60 мин, 1 мл/мин. Стрелкой отмечен пик, в котором содержались наиболее активные белковые фракции. Фракции № 30 и объединенные фракции №31-32 были подвергнуты рехроматоргафии. Б - Элюция пептидов с колонки с помощью линейного градиента: вода (с 0.13% гептафтормасляной кислоты) - ацетонитрил от 15 до 45% за 60 мин, 1 мл/мин (рехроматография фракции 30). Стрелкой отмечен пик, в котором вышел очищенный антимикробный пептид (Пептид 1). В - элюция пептидов с колонки с помощью линейного градиента: вода (с 0.13% гептафтормасляной кислоты) - ацетонитрил от 15 до 45% за 60 мин, 1 мл/мин (рехроматография фракций 31-32). Стрелкой отмечен пик, в котором вышел очищенный антимикробный пептид (Пептид 2).
При исследовании гемолитической активности пептидов из лейкоцитов севрюги было установлено, что ни Пептид 1, ни Пептид 2 во всем исследованном диапазоне концентраций (от 1 до 20 мкМ) не вызывают лизиса эритроцитов человека. Таким образом, было показано, что хотя в концентрациях 1-5 мкМ пептиды севрюги проявляют антимикробные свойства, они не обладают гемолитической активностью, даже взятые в концентрации 20 мкМ.
Минимальные концентрации пептидов (мкМ), ингибирующие рост микроорганизмов (определялись по методу Лерера [9])
Escherichia coli ML35p Listeria monocytogenes EGD MRSA 33591 Candida albicans 820
Пептиды Среда без NaCl Среда, содер- жащая 150мМ NaCl Среда без NaCl Среда, содер- жащая 150мМ NaCl Среда без NaCl Среда, содер- жащая 150Мм NaCl Среда без NaCl Среда, содер- жащая 150мМ NaCl
Пептид 1 1.32 6.17 2.51 2.00 2.69 >20 1.23 >20
Пептид 2 1.48 5.55 2.63 1.99 2.65 >20 1.55 >20
Протегрин-1 0.65 0.91 0.45 0.44 0.57 0,58 0.32 1.41
Дефенсин HNP-1 3.01 >20 0.78 1.48 2.95 >20 3.09 >20
Обсуждение результатов исследования. Антимикробные пептиды являются важнейшими эффекторными молекулами системы врожденного иммунитета животных; подобные пептидные молекулы, обладающие антимикробными свойствами, обнаружены также у растений, грибов и даже бактерий [1,11,17]. Эти молекулы представляют собой положительно заряженные полипептиды, в состав которых входит 15-60 аминокислотных остатков. Эти пептиды были названы «антимикробными» в связи с тем, что они обладают широким спектром активности, подавляя рост и развитие грамотрицательных, грамполо-жительных бактерий, низших грибов (включая дрожжи), паразитов (включая планарий и нематод) и даже вирусов, таких, как ВИЧ и вирус герпеса [4]. К настоящему времени описаны АМП различных представителей класса млекопитающих, птиц, амфибий. Сведения об АМП рыб пока весьма немногочисленны. У костистых рыб антимикробные вещества были выделены из кожи камбалы Pardachirus marmoratus [12], амурского сома Parasilurus asotus [14], радужной форели Oncorhynchus ту kiss [6], карпа Cyprinus carpio [10], из слизистых покровов палтуса Hippoglossus hippoglossus L. [5], а также из слизистых покровов кожи и пищеварительного тракта некоторых других рыб. Однако отсутствуют данные об АМП из клеток крови рыб.
Работа посвящена поиску, выделению и характеристике новых антимикробных пептидов из лейкоцитов крови севрюги Acipenser stellatus, принадлежащей к отряду осетровых, классу костистых рыб. Представители данного отряда сохраняют признаки, характерные для наиболее древних рыб, таких, как хрящевые рыбы - акулы и скаты.
Нами был проведен поиск белковых молекул, обладающих антимикробной активностью, в экстрактах из лейкоцитарной фракции крови севрюги. Использованная в работе процедура выделения и очистки этих антимикробных компонентов позволила получить два высокоочищенных препарата пептидов, обладающих антимикробной активностью. Молекулярные массы полученных пептидов составили 5335 и 5448 Да. Оба пептида являлись положительно заряженными молекулами, имели сходную электрофоретическую подвижность по направлению к катоду в кислой среде и представляли собой линейные молекулы. Различие в молекулярных массах пептидов (ИЗ Да) позволяет предположить, что выделенные нами пептиды являются изоформами и отличаются на один остаток лейцина (или изолейцина). Подтвердить данное предположение поможет только анализ первичной структуры этих пептидов.
Анализ антимикробной активности пептидов из лейкоцитов севрюги выявил, что Пептид 1 и Пептид 2 обладают сходным спектром активности и, как было показано для большинства альфа-дефенсинов, теряют эту активность при физиологических концентрациях хлорида натрия в среде. Можно предположить, что, как и дефенсины, пептиды севрюги выполняют свою защитную функцию, инактивируя микроорганизмы, оказавшиеся внутри фаголизосомы фагоцитирующей клетки, где концентрация солей снижена по сравнению с таковой в крови. Этим они отличаются от пептидов, которые преимущественно секретируются фагоцитами во внеклеточное пространство, где они и проявляют свою антимикробную активность, как, например, протегрины и некоторые другие пептиды из семейства кателицидинов. Кроме того, можно предположить, что выделенные нами из лейкоцитов севрюги пептиды могут быть близки к пептиду, выделенному из кожной слизи палтуса Hippoglossus hippoglossus - хипозину [5]. Этот пептид имеет молекулярную массу 5459 Да, обладает антимикробной активностью против грамположительных, грамотрицательых бактерий и низших грибов и является производным гистона Н2А.
Полученные данные представляют интерес как для понимания процесса эволюции молекулярных факторов системы врожденного иммунитета, так и с практической точки зрения, поскольку после определения аминокислотной последовательности полученных из лейкоцитов севрюги АМП, эти пептиды смогут выступить в качестве возможных моделей для создания на основе их структуры лекарственных препаратов для использования в медицине и ветеринарии.
***
Авторы выражают благодарность сотрудникам Центра коллективного пользования «Аналитическая спектрометрия» за предоставленную возможность использования оборудования для выполнения масс-спектрометрического анализа.
Summary
Zugairova О. N., Shamova О. V., Orlov D, S., Dubin V. P., Kokryakov V. N. investigation of antimicrobial peptides from leucocytes of stellate sturgeon (acipenser stellatus).
An innate immune system plays a key role in antibacterial and antifungal defense in fish and other poikilothermal animals since it provides a fast and relatively independent temperature reply to bacterial invasion while the antibody production takes several weeks and cannot protect fish from many dangerous pathogens. Antimicrobial peptides are significant components of this system. The present work aims at studying antimicrobial peptides from leukocytes of stellate sturgeon (Acipencer stellatus). By using a purification procedure containing acid extraction of proteins followed by continuous elution electrophoresis and reverse-phase HPLC we have isolated two antimicrobial peptides with molecular masses of 5335 and 5448 Da Both obtained peptides appeared to be linear, had similar electrophoretic mobility during acid-urea electrophoresis and both showed antimicrobial activity against gram-negative bacteria Escherichia coli, gram-positive bacteria Listeria monocytogenes and methicillin resistant Staphylococcus aureus, and fungi Candida albicans. The isolated antimicrobial peptides of stellate sturgeon demonstrated low ability to lyse human red blood cells,
E-mail: [email protected] Литература
1. Кокряков В. H. Биология антибиотиков животного происхождения. СПб., 1999. 2. Лукьяненко В. И. Иммунобиология рыб. М., 1989. 3. Торчинский Ю. М. Сера в белках. М., 1977. 4. Bevins С. L. Antimicrobial peptides as effector molecules of mammalian host defense // Contrib. Microbiol. 2003. Vol. 10. P. 106-148.5. Birkemo G.A., Luders Т., Andersen O., Ingolf I. F„ Nissen-MeyerJ. Hipposin, a histone-derived antimicrobial peptide in Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus) // Bio-chimica et Biophisica Acta 2003. Vol. 1646, P. 207-215. (i.Femandes J. М., Kemp G. D., Molle G. D.,
Smith V.J. Antimicrobial properties of histone H2A from skin secretions of rainbow trout., Oncohoryncus mykiss // Biochem. 2002. Vol. 368. P. 611-620. 7. Hancock R.E.W., Scott M. G. The role of antimicrobial peptides in animal defenses // PNAS. 2000. Vol. 97. P. 8856-8861. 8. Harwig S. S., Chen N. P., Park A. S. K., LehreerR. I. Purification of bioactive cysteine-rich peptides from leukocytes by continuous acid-urea polyacrilamide gel electrophoresis // Anal. Biochem. 1993. Vol. 208. P. 382-346. 9. Lehrer R. I., Rosenman M., Harwig S. S. Jackson R., Eisenhauer P. Ultrasensitive assays for endogenous antimicrobial polypeptides //J. Immunol. Methods. 1991. Vol. 137. P. 167-173.10. LemaitreC., Orange N., Saglio P., Saint N., Gagnon J., Molle G. Characterization and ion channel activities of novel antibacterial proteins from the skin mucosa of carp (Cyprinuscarpio) // Eur.J. Biochem. 1996. Vol. 240. P. 143-149.
11. Marshall S. H., Arenas G. Antimicrobial peptides: a natural alternative to chemical antibiotics and a potential for applied biotechnology // Electr. J. Biotechnol. 2003. Vol. 6. P. 271-282.12. Oren Z„ Shai Y. A class of highly potent antibacterial peptides derived from pardaxin, a pore-forming peptide isolated from Moses sole fish Pardachirus marmoratus // Eur.J. Biochem. 1996. Vol. 237. P. 303-410.13. Panyim S., Chalkley R. High resolution acrylamide gel electrophoresis of histones // Atch. Biochem. and Biophys. 1969. Vol. 130. N 2. P. 337-346.14. Park I. Y.,Park C. B.,KimM. S., Kim S. C. Parasin 1, an antimicrobial peptide derived from histone H2A in the catfish, Parasilurus asotus // FEBS Lett. 1998. Vol. 437, P. 258-262.15. SchaggerH., vonJagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis for separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa // Anal. Biochem. 1987. Vol. 166. P. 368-379. 16. Wolf P. A critical reappraisal of Waddell's technique for ultraviolet spectrophotometric protein estimation//Anal, Biochem. 1983. Vol. 128. Pt. l.P. 145-155,17. Zasloff M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms // Nature. 2002. Vol. 415. P. 389-395.
Статья принята к печати 19 февраля 2007 г.
