CC BY
46
2006
ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА_Сер. 3. Вып. 4
БИОХИМИЯ
УДК 612.398.1:547.964.4
А. В. Меньшенин, Г. М, Алешина, Е, С. Клушевская, Ю. Ф. Леонова, Т. В. Овчинникова, Е. Г. Краснодембский, В. Н. Кокряков
НОВЫЙ АНТИМИКРОБНЫЙ ПЕПТИД ИЗ СЦИФОИДНОЙ МЕДУЗЫ AURELIA AURITA*
Антибиотические пептиды в настоящее время рассматриваются в качестве ведущих факторов системы врожденного иммунитета, представляющей собой первое звено защиты от патогенов [1]. Эти пептиды широко распространены в живой природе, начиная с микроорганизмов и заканчивая многоклеточными животными и растениями. Наличие антимикробных пептидов у низших организмов указывает на древнее происхождение пептидов и свидетельствует в пользу того, что они возникли и развивались как часть первичного иммунного защитного механизма [2]. К настоящему времени описано около девятисот антибиотических пептидов, полученных из различных органов и тканей животных. Выделение и изучение структуры, а также физико-химических и антибиотических свойств этих пептидов важно для выявления механизмов, лежащих в основе антибиотического действия пептидов. Кроме того, сопоставление структуры пептидов животных, принадлежащих разным таксономическим группам, вносит вклад в понимание закономерностей развития факторов системы врожденного иммунитета. В прикладном же аспекте антибиотические пептиды могут быть полезны в качестве эффективных антибиотиков нового поколения, поскольку, действуя при более низкой минимальной ингибирующей концентрации по сравнению с традиционными антибиотиками, не вызывают появления устойчивых штаммов микроорганизмов.
Aurelia aurita (тип Cnidaria - кишечнополостные, класс Scyphozoa - сцифоидные медузы) является объектом достаточно древним в эволюционном плане, но, к сожалению, мало исследованным в отношении антибиотических пептидов. В то же время изучение спектра антимикробных пептидов у медуз может представлять интерес для понимания путей эволюции системы врожденного иммунитета. Ранее нами были предприняты работы по выделению и изучению свойств антимикробных пептидов A. aurita. Настоящая работа является продолжением исследования антибиотических пептидов сцифоидной медузы A. aurita.
Материалы и методы исследования. Объект исследования - сцифоидные медузы Aurelia aurita ("тип кишечнополостные (Cnidaria^), класс сцифоидные медузы (Scyphozoa^). Материал был
*Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант № 06-04-49416) и ШТАБ (грант № 03-51-4984).
© А. В. Меньшенин, Г. М. Алешина, Е. С. Клушевская, Ю. Ф. Леонова, Т. В. Овчинникова, Е. Г. Краснодембский, В. Н. Кокряков, 2006
собран на Белом море в августе 2001 г. Экстракцию катионных белков и пептидов проводили из тканей и органов медуз: ротовых хоботков, щупалец, субгенитальных и гастроэнтеральных карманов, пищеварительных канальцев и мезоглеи. Перечисленные части тела помещали в 10%-ный раствор уксусной кислоты и хранили на холоде (4-5 °С) до экстракции. Препарированные части тела разрушали гомогенизацией в 10 %-ном растворе уксусной кислоты в стеклянном гомогенизаторе со стеклянным пестиком. Гомогенат центрифугировали при 25000 g в течение 1 ч, после чего супернатант отбирали, а к осадку добавляли двойной объем 10%-ной уксусной кислоты и ресуспендировали. Суспензию повторно осаждали центрифугированием при 25000 g в течение 1 ч. Полученный супернатант объединяли с предыдущим. Объединенные супернатанты подвергали ультрафильтрации через фильтр «Amicon» YM-10 с номинально отсекаемой молекулярной массой 1 кДа. Полученный ультрафильтрат далее подвергали концентрированию на фильтре «Amicon» YM-1 с номинально отсекаемой молекулярной массой 1 кДа. Полученный концентрат обессоливали на фильтре «Amicon» YM-1 путем пропускания через камеру для фильтрации избыточного объема 10%-ной уксусной кислоты. Смесь белков и пептидов полученного обессоленного концентрата разделяли на фракции препаративным электрофорезом, проводимым в 12,5%-ном полиакриламидном геле (НААГ) в кислой буферной системе в присутствии мочевины в аппарате для препаративного электрофореза («Bio-Rad», модель - AG501-X8) [3]. Разделение проводили в течении 18-20 ч. при напряжении 35 В/см, скорость элюции 0,5 мл/мин, объемы собираемых фракций составляли 8 мл. Спектр катионных пептидов во фракциях, полученных после проведения препаративного электрофореза, оценивали методом электрофореза в кислой буферной системе в присутствии мочевины в пластинах полиакриламидного геля на приборе фирмы «Hoefer» (США) [4].
Фракции белков и полипептидов после препаративного электрофореза концентрировали высушиванием пол Еакуумом на центрифуге Speed Vac CS-18 и далее фракционировали с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) на установке фирмы «Beckman». Разделение проводили на колонке Alltech С-18 (4,6 х 250 мм; сорбент Macrosphere 300 С 18. диаметр частиц 5 мкм) в градиенте концентрации ацетонитрила (0-60%, 1%/мин) в 0.1сс - кой трифторуксусной кислоте (ТФУ) [4]. Чистоту полученных препаратов и приблизительную молекулярную массу пептидов оценивали при помощи диск-электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия [9]. Электрофорез проводили в пластинах полиакриламидного геля на приборе фирмы «Hoefer» (США). Напряжение электрического поля при электрофорезе составляло 10 В см. В качестве стандарта использовали молекулярный весовой маркер для белков («Sigma». США), в состав .которого входили белки с молекулярнами массами: 2,8 (инсулин (а и ß цепи), 6,2 (ингибитор трипсина быка), 14,3 (лизоцим), 18,4 (ß-лактоглобу-лин), 29,0 (карбоангидраза), 43,0 (овальбумин) кДа. Точную молекулярную массу пептидов оценивали при помощи времяпролетного масс-спектрометра Vision 2000 («ThermoBioAnalysis», USA). Наличие дисульфидных связей в катионных белках определяли, окисляя их надмуравьиной кислотой [6]. О возможном наличии дисульфидных связей свидетельствовало изменение электро-форетической подвижности пептидов, обработанных надмуравьиной кислотой, которая разрывает SS-связи и окисляет SH-группы до сернистокислых групп (S03), в ПААГ в кислой буферной системе по сравнению с контрольными пробами. Антибиотическое действие катионных пептидов определяли методом радиальной диффузии в агарозном геле, предложенным Р. И. Лерером и соавторами [5], в отношении: Escherichia coli, штамм ML-35p, и Listeria monocytogenes, штамм EGD. Для оценки антибиотического действия пептидов измеряли диаметр зоны лизиса вокруг лунок, в которые наносили пробы. В качестве стандарта использовали дефенсин кролика NP-1. Определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК) проводили в агарозном геле, содержащем микроорганизмы Е. coli и L. monocytogenes. В качестве стандарта был использован дефенсин кролика NP-1. Пробы тестировали в концентрациях 200, 100, 50, 25, 12,5 мкг/мл.
Результаты исследования и их обсуждение. Предварительный анализ кислотных экстрактов из тканей тела медузы Aurelia aurita позволил обнаружить в экстракте из мезоглеи наличие антибиотической активности в отношении обоих тестируемых мик-
роорганизмов Е. coli и L. monocytogenes, причем большая зона лизиса наблюдалась в отношении Е. coli. Путем проведения процедуры ультрафильтрации через фильтр «Amicon» YM-10 и последующего концентрирования ультрафильтрата на фильтре «Amicon» YM-1 была получена фракция пептидов, имеющих молекулярную массу не более 10 кДа. Затем полученная фракция была подвергнута разделению на фракции при помощи препаративного электрофореза в кислой буферной системе в присутствии мочевины. Фракции, в которых наблюдалось поглощение при длине волны 225 нм, тестировали на наличие антибиотической активности в отношении Е. coli и L. monocytogenes методом радиальной диффузии в агарозном геле. Наибольшая антибиотическая активность в отношении Е. coli наблюдалась во фракциях № 98-108, значительно меньшая активность в отношении L. monocytogenes была обнаружена во фракциях № 100-140 с максимальным значением в 25 единиц во фракции № 104. Для определения электрофоретической подвижности в кислой буферной системе фракции № 96-110 были подвергнуты аналитическому электрофорезу в кислой буферной системе. Электрофоретическая подвижность пептидов во фракциях № 96-108 в кислой буферной системе была близка к подвижности дефенсина кролика NP-2. Анализ фракций электрофорезом в присутствии ДС-Na показал, что молекулярные массы пептидов, составляющих эти фракции, находятся в пределах 2000-7000Да. Ввиду гетерогенности фракций № 96-110 после препаративного электрофореза требовалось дальнейшее их разделение. Дальнейшее разделение и очистку катионных пептидов медузы осуществляли методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Хроматограмма разделения объединенных фракций № 107 и 108 методом ОФ ВЭЖХ с использованием линейного градиента концентрации ацетонитрила (0-60%, 1%/мин) в 0,1 %-ной ТФУ изображена на рис. 1. Разделение осуществляли на колонке Alltech С-18. Скорость элюции составляла 1 мл/мин. Объем собираемых фракций составлял 1 мл. Детекцию осуществляли при длине волны 225 нм. Сопоставление хроматограммы с данными по антимикробной активности фрак-
0,0 ¿0 2,0 3,0 4,0 Ь, мин
Рис. 1. Хроматограмма разделения объединенных фракций № 107 и 108 методом ОФ ВЭЖХ с использованием линейного градиента концентрации ацетонитрила (0-60%, 1%/мин) в 0,1%-ной ТФУ на колонке АШесЬ С-18.
Антимикробная активность фракции № 31 после ОФ ВЭЖХ
№ фракции Антимикробная активность, усл. ед.
Escherichia coli Listeria monocytogenes
31 55 10
NP-1 50 65
ций после ОФ ВЭЖХ (таблица ) показывает, что наибольшей антимикробной активностью обладает фракция, элюируемая на 31-й минуте, которой на хроматограмме соответствует отдельный пик. Причем активность фракции № 31 в отношении Е. coli в пять раз превосходила акнимикробное действие в отношении L. monocytogenes.
Гомогенность и приблизительную молекулярную массу пептида полученной фракции оценивали электрофорезом в присутствии ДС-Na в денатурирующих условиях (рис. 2, А). Фракции №31 в геле соответствовала единичная полоса на уровне приблизительно 3500Да. Электрофоретическую подвижность полученного пептида (далее п-1) в кислой буферной системе определяли аналитическим электрофорезом в кислой буферной системе (рис. 2, Б). Подвижность пептида п-I была близка к подвижности де-фенсина кролика NP-2. Таким образом, выделенный пептид обладал молекулярной массой и зарядом при рН 2, близкими к молекулярной массе и заряду дефенсина кролика NP-2.
А Б
¿3 кДа 29 кДа 18,4 кДа 14,3 кДа
6,2 «Да 2,8 «Да
Рис. 2. Электрофорез пептида п-1 в ПААГ в присутствиии додецилсульфата натрия (Л) в 12,5%-ном ПААГ в кислой буферной системе в присутствии мочевины (Б).
Результаты определения МИК выделенного пептида п-1 в отношении тестируемых микроорганизмов представлены на рис. 3. МИК пептида в отношении Е. coli составляет приблизительно 7,5 мкг/мл, тогда как МИК в отношении L. monocytogenes составляет приблизительно 20 мкг/мл.
После окисления выделенного пептида надмуравьиной кислотой, его электрофо-ретическая подвижность к катоду в ПААГ в кислой буферной системе уменьшалась по
100
&
0
1
80
1 60
го
ZT
I 40
20
0
10
100
Концентрации пептидов, мкг/мл
Рис. 3. Определение минимальных ингибирующих концентраций пепетида п-1 и дефенсина кролика NP-1.
сравнению с неокисленными образцами, что свидетельствовало о наличии дисульфид-ных связей в молекулах этого пептида.
Точная молекулярная масса выделенного пептида п-1, определенная на время-пролетном MALDI-масс-спектрометре Vision 2000 («ThermoBioAnalysis», USA) в институте Биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова (г. Москва), составляла 4,2978 кДа. Частичный анализ первичной структуры пептида был проведен в этом же институте на белковом секвенаторе 491 Procise («Applied Biosystems», USA). Частичная N-концевая последовательность пептида п-1 A-A-C-S-D-R-A-H-G-H-I-C-E-S-F-K-S-F-C-K-D-S-G-R-N-G-V-K-L-R-A-N-C-.
В настоящее время проводится работа по определению полно!! первичной структуры выделенного пептида п-1, а также структуры его гена. Результаты анализа электро-форетической подвижности пептида п-1 в ПААГ в кислой буферной системе свидетельствуют о том, что выделенный нами пептид является катионным и при pH 2 имеет заряд, сходный с зарядом дефенсина кролика NP-2. Исходя из выявленной частичной N-koh-цевой первичной последовательности пептида п-1, можно видеть, что доля основных аминокислот (аргинина, лизина и гистидина) в нем составляет 21%, а доля кислых (глу-таминовой и аспарагиновой аминокислот) - 9%. В то же время доля основных аминокислот в дефенсине кролика NP-2 составляет 27%, а доля кислых - лишь 3%. Для того чтобы дать объяснение факту сходной электрофоретической подвижности обоих пептидов в кислой буферной системе следует предположить наличие в оставшейся С-кон-цевой части пептида п-1 нескольких основных аминокислот, что могло бы компенсировать трехкратное различие в содержании кислых аминокислот в пептиде п-1 и дефенсине NP-2. В N-концевом фрагменте пептида п-1 содержится четыре остатка цистеина, которые могут образовывать при замыкании два дисульфидных мостика. В то же время, при определении наличия в исследуемом пептиде дисульфидных связей, изменение электрофоретической подвижности в окисленном образце по сравнению с неокисленным со-
впадало с изменением электрофоретической подвижности после окисления дефенсина кролика NP-2, в молекуле которого содержится три дисульфидных мостика. Как следствие, можно предположить, что в исследуемом пептиде также имеются три дисульфидных мостика, а соответственно в оставшейся С-концевой части следует ожидать наличия двух остатков цистеина.
Анализ антибиотического действия исследуемого пептида п-I показал, что в отличие от а- и р-дефенсинов, для которых характерно более сильное действие в отношении грамположительных микроорганизмов, чем в отношении грамотрицательных [10], исследуемый пептид п-I был значительно более активным в отношении грамотрицатель-ной бактерии Е. Coli, чем в отношении грамположительной бактерии L. monocytogenes. Подобная активность характерна для некоторых криптдинов мыши и пролинбогатых пептидов, таких как апидацин, дрозоцин, бактенецины, а также цекропинов [2, 6].
Для определения степени близости первичной структуры исследуемого пептида с первичной структурой ранее изученных антибиотических пептидов проведен кластерный анализ в програме Statistica. Для кластерного анализа были взяты представители основных изученных к настоящему времени семейств пептидов. Из результатов проведенного кластерного анализа следует, что ни один из представителей основных семейств известных антибиотических пептидов не имеет заметного структурного сходства с выделенным пептидом п-I. Возможно, что выделенный пептид п-I не может быть отнесен ни к одному из известных в настоящее время семейств антибиотических пептидов. Окончательное заключение о принадлежности выделенного пептида к какому-либо семейству антибиотических пептидов может быть сделано лишь после окончательного установления его первичной структуры.
Авторы статьи выражают благодарность сотрудникам центра коллективного пользования «Аналитическая спектрометрия» при СПбГПУ за предоставленную возможность использования приборов, принадлежащих центру.
Summary
Menshenin А. V., Aleshina G. Л/.. Leonora Yu. F., Ovchinnikova Т. V., Klushevskaya E. S., Krasnodembskiy E. G., Kokryakov V. N. A new antimicrobial peptide from jelly-fish Aurelia aurita.
Using ultrafiltration, preparative acid electrophoresis and reversed-phase high-performance liquid chromatography we have isolated and purified new antimicrobial peptide from mesogloea of Aurelia aurita (ph. Cnidaria, cl. Scyphozoa). Peptide has molecular weight 4298,7 Da and active against gram-negative E. coli and to a lesser degree against gram-positive L. monocytogenes. Electrophoretic mobility in acid PAAG of isolated peptide was similar to rabbit defensin NP-2. Partial N-terminal amino acid sequence was determined: A-A-C-S-D-R-A-H-G-H-I-C-E-S-F-K-S-F-C-K-D-S-G-R-N-G-V-K-L-R-A-N-C-.
Литература
1. Кокряков В. H. Биология антибиотиков животного происхождения. СПб., 1999. 2. ВотапН. G. Peptide antibiotics and their role in innate immunity //Annu. Rev. Immun. 1995. Vol. 13. P. 61-92. 3. Earwig S. S., Chen N. P., Park A. S. K., Lehrer R. I. Purification of cysteine-rich bioactive peptides from leukocytes by continuous acid-urea-polyacrylamide gel electrophoresis // Anal. Biochem. 1993. Vol. 208. P. 382-386.4. Kokryakov V. N., HarwigS. S. L., PanyutichE. A., Shevchenko A. A.. Aleshina G. M., Shamova О. V., Korneva II. A., Lehrer R. I. Protegrins: leukocyte antimicrobial peptides combine features of corticostatic defensins and tachyplesins // FEBS Lett. 1993. Vol. 327. X 2. P. 231-236.
5. Lehrer R. I., Rosenman M., Harwig S. S.Jackson R., Eisenhauer P. Ultrasensitive assays for endogenous antimicrobial polypeptides //J. Immunol. Methods. 1991. Vol. 137. P. 167-173. 6. Marchini D., Giordano P. C„ Amons R. et al. Purification and primary structure of ceratotoxin-a and ceratotoxin-b, 2 antibacterial peptides from the female reproductive accessory glands of the medfly Ceratitis capitata (Insecta, Diptera) // Insect Biochem. Molec. Dial. 1993. Vol. 23. P. 591-598. 7. Miyasaki K. T., Lehrer R. 1.13-sheet antibiotic peptides as potential dental therapeutics // Intern. J. Antimicrob. Agents. 1998. Vol. 9. P. 269-280. 8. Panyirn S., Chalkley R. High resolution acrylamide gel electrophoresis of histones // Arch. Biochem. and Biophys. 1969. Vol. 130. N 2. P. 337-346. 9. SchaggerH., VonJagow G. Tricine-sodium dodecylsulphate-polyacrilamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1-100 kDa // Anal. Biochem.1987. Vol. 166. P. 368-379. 10. Zimmerman G. R„ Legault P., Sels-ted M. E. PardiA. Solution structure of bovine fl-defensin-12: the peptide fold of the B-defensins is identical to that of the classical defensins // Biochemistry 1995. Vol. 34. P, 13663-13671.
Статья поступила в редакцию 6 апреля 2006 г.
