CC BY
366
УДК 615.4:545
ВАЛИДАЦИОННАЯ ОЦЕНКА ВЭЖХ-МЕТОДИКИ АНАЛИЗА СОСТАВА ДЛЯ ТЕРАПИИ ОЖОГОВ ПИЩЕВОДА В ФАЗУ РЕГЕНЕРАЦИИ
В.М. ВОРОБЬЕВА Л.Е. КУДРИКОВА В статье изложены экспериментальные данные
Алтайский государственный медицинский валида-ции ВЭЖХ-методики качественн°ш и
университет, г. Барнаул e-mail: [email protected] количественного ана-лиза метилурацила и
метронидазола, входящих в состав № 2 для местной терапии ожогов пищевода. Установлены пара-метры пригодности хроматографической системы, специ-фичности, линейности, правильности и прецизионности раз-работанной методики. Ключевые слова: состав для терапии ожогов пищевода, ВЭЖХ, количественное определение, валидация.
Введение. Химические ожоги пищевода вследствие отравления химическими веществами кислотной или щелочной природы с последующим стенозированием представляют сложную проблему хирургии. Проведение неотложных мероприятий должно быть продолжено комплексным лечением, способствующим быстрому зажив-лению ожоговой поверхности и профилактике развития рубцовых деформаций [1, 4]. Сотрудниками кафедр фармацевтической технологии и детской хирургии АГМУ пред-ложены составы для местной терапии химических ожогов пищевода с учетом этапно-сти развития патологического процесса. Состав № 1, обладающий противовоспали-тельным и местноанестезирующим действием, предназначен для применения в фазу воспаления. Состав № 2 оказывает регенерирующий и антипролиферативный эффек-ты для уменьшения образования грубой соединительной ткани и профилактики раз-вития рубцовых деформаций во время второй и третьей фаз ожогового процесса. Оба состава обладают антимикробной активностью для профилактики наслоения вторич-ной инфекции [3]. Состав № 2 представляет собой суспензию, стабилизированную по-лимером регенкур, и содержит метилурацила 2,0; метронидазола 0,75; гиалуронидазы 128 ЕД; регенкура 4,0; ароматизатора, идентичного натуральному 0,5; натрия сахари-ната 0,24; воды очищенной до 100,0. При подготовке нормативной документации была разработана методика анали-за лекарственных веществ, входящих в состав регенерирующего действия, методом ВЭЖХ. Согласно современным рекомендациям ICH и ведущих фармакопей [7, 8, 9] ме-тодика количественного определения должна быть валидирована по основным харак-теристикам, таким как специфичность (specificity), линейность (linearity), правиль-ность, или истинность (accuracy, or trueness), прецизионность (precision) [2,5,6]. Цель настоящей работы - изучение комплекса валидационных характери-стик разработанной методики. Методика эксперимента. Исследования проводили на микроколоночном жидкостном хроматографе МилиХром А-02 (ЗАО Институт хроматографии «ЭкоНо-ва», г.Новосибирск), с УФ-детектором, колонкой 2 х 7,5 мм и сорбентом ProntoSIL-120-5-С18 (размер частиц 5 мкм), результаты исследования обрабатывали с использовани-ем программы «МультиХром» для «Windows». При подготовке пробы к анализу учитывали тот факт, что метронидазол и ме-тилурацил в результате иммобилизации в матрице полимера регенкур неполно высво-бождаются из лекарственной формы и, в связи с этим, данные количественного опре-деления получаются заниженными. Для обеспечения выхода лекарственных веществ из полимерной матрицы добавляли раствор натрия хлорида 10%, который, взаимодей-ствуя с карбоксильной группой полимера, способствовал вытеснению анализируемых ингредиентов. Методика. Точную навеску анализируемого состава массой 0,5 г помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, добавляли 2,5 мл раствора натрия хлорида 10% и смесь, состоящую из 2,5 мл ацетонитрила и 2,5 мл раствора трифторуксусной кислоты (ТФУ) 1%, взбалтывали в течение 15 минут, доводили объем до метки водой очищен- ной, тщательно перемешивали, фильтровали через бумажный фильтр. Полученный фильтрат исследовали методом ВЭЖХ. В качестве элюента А
использовали раствор ТФУ 0,1%, в качестве элюента Б - ацетонитрил и водный раствор ТФУ 1% в соотношении (9:1), градиент от 2 до 40 % элюента Б за 10 мин., при скорости потока подвижной фазы 100 мкл/мин. и темпера- туре колонки 35 градусов, объем пробы 2 мкл. Детектирование проводили в УФ- области при длинах волн 240, 260, 270 и 300 нм. Расчет количественного содержания вещества в пробе проводили по калибровочному графику. Площадь пика на хроматограмме измеряли при длине волны 270 нм. Количественное содержание определяемых веществ (Х) в г/100 г в анализируе- мом составе вычисли по формуле: Х= • 10-3, где Р - содержание исследуемого вещества в хроматографической пробе, в мг/100г; V - вместимость мерной колбы, используемой для приготовления испытуемого раствора, в мл; р - плотность анализируемого состава, 1,06 г/мл; т - масса навески препарата, в граммах, 10-3 - пересчет миллиграммов на граммы. Обсуждение результатов. Хроматографирование анализируемой пробы при выбранных условиях (рис. 1) показало, что пики определяемых веществ хорошо разде- лены между собой и не накладываются на пики примесей из растворителя, на пики вспомогательных веществ и основы лекарственной формы (плацебо). тУ Р 0 00
Рис. 1. Хроматограмма фильтрата состава № 2 (1-метилурацил, 2-метронидазол) Время удерживания анализируемых веществ лекарственной формы (метилура- цила - 5,2 мин., метронидазола - 7,1 мин.) совпадает с временем удерживания соответ- ствующих стандартов в пределах допустимой ошибки (±2%).
Пригодность хроматографической системы характеризовалась несколь- кими параметрами: сходимость инжекций (п=6), эффективность колонки (N>2000) 2115т.т. для метилурацила и 13906т.т. для метронидазола, коэффициенты ассиметрии пиков (Т<2,о) для метилурацила - 1,26, для метронидазола - 1,51, коэффициент разде- ления пиков СК$>2,о) для метилурацила не менее 6, для метронидазола не менее 4,5, величина относительного стандартного отклонения площади пика (RSD<2,0%) для ме- тилурацила 0,62%, для метронидазола 0,65%. Данные проверки сходимости инжекций, которые оценивали по воспроизводимости площадей пиков метилурацила и метронидазола (п=6), представлены в табл. 1. Полученные результаты позволяют оценить пригодность хроматографической системы по основным показателям.
Таблица 1
Оценка пригодности хроматографической системы по воспроизводимости площадей пиков
№ п/п Метилурацил Метронидазол
1 43,083 8,010
2 42,970 7,995
3 43,242 8,101
4 42,557 7,970
5 43,288 8,084
6 42,921 8,018
Sср 43,010 8,030
8Б 0,265 0,052
RSD < 2,0 % 0,62 0,65
Определение линейности и диапазона применения проводили на 5 уровнях концентрации, для чего готовили растворы стандартных веществ в концен-трациях 50, 80, 100, 120 и 150% от номинального значения. Измеряли аналитический сигнал (площадь пика) для проб с различными концентрациями определяемых ве-ществ. Зависимости площадей пиков метилурацила и метронидазола от их содержания в пробе представлены на рис. 2 и 3 соответственно. Зависимость величины аналитического сигнала (отклика) от количества опре-деляемого вещества в пробе в диапазоне концентраций от 50 до 150% от номинального значения выражается уравнением регрессии для метилурацила У=1,0468^Х+0,98644 с коэффициентом корреляции 0,9991, для метронидазола У=0,53268^Х+0,043103 с ко-эффициентом корреляции 0,9999. Линейность зависимости площади пика от содер-жания анализируемых веществ (рис. 2, 3), воспроизводимость и точность результатов определения, а также значение коэффициента корреляции более 0,999 свидетельству-ют о том, что интервал от 20 до 60 мг/100г для метилурацила и от 7,5 до 22 мг/100 г для метронидазола можно определить как аналитическую область методики.
20 25 30 35 40 45 50 55 60
Концентрация. мг/100г
Рис. 2. Калибровочная кривая зависимости площади пика метилурацила от его содержания в пробе
Рис. 3. Калибровочная кривая зависимости площади пика метронидазола от его содержания в пробе Правильность методики устанавливали путем анализа лекарственных форм с содержанием действующих веществ 80-120% от номинального с последующим опреде-лением значения коэффициента R (открываемость), средняя величина которого долж-на принадлежать интервалу 100±2%.
Таблица і
Оценка правильности методики количественного определения метилурацила
Ожидаемое содержание в пробе, мг/100 г Полученное содержание в пробе, мг/100 г Открываемость, %
1,б97 1,71б 101,12
1,710 1,б81 98,31
1,719 1,734 101,08
2,177 2,15 99,07
2,187 2,147 98,17
2,1бБ 2,1б3 99,93
2,Бб4 2,Б4б 99,28
2,Бб3 2,555 99,б7
2,570 2,538 98,74
Среднее значение, % - 99,49
Таблица 2 Оценка правильности методики количественного определения метронидазола
Ожидаемое содержание в пробе, мг Полученное содержание в пробе, мг Открываемость, %
0,б44 0,б5б 101,8б
0,б39 0,б31 98,75
0,б48 0,б39 98,б1
0,803 0,790 98,38
0,808 0,807 99,88
0,800 0,804 100,50
0,959 0,954 99,47
0,975 0,972 99,69
0,961 0,954 99,27
Среднее значение, % - 99,60
Из данных табл. 2 и 3 видно, что в разработанной методике процент восстанов-ления при определении метилурацила находился в пределах от 98,17 до 101,12%, при определении метронидазола от 98,38 до 101,86%. Среднее значение отклика для каж-дого из анализируемых веществ не превышает рекомендуемых значений. Прецизионность методики оценивали путем воспроизведения методики на одной серии препарата в 6 повторностях, с последующим определением относительно-го стандартного отклонения (табл. 3).
Таблица 3
Оценка прецизионности разработанной методики
Повторность Определенное содержание в пробе, мг /100 г
Метилурацил Метронидазол
1 41,559 15,160
2 41,045 15,000
3 41,224 15,090
4 41,021 15,170
5 40,497 15,215
6 40,602 15,399
Среднее значение (Хср±ДХср) 40,99±0,413 15,17±0,140
8 0,394 0,134
Е, % 1,0 0,927
RSD < 2,0% 0,96 0,88
Из данных, представленных в табл. 3, видно, что относительное стандартное от-клонение не превышает 2,0%, что свидетельствует о прецизионности методики в усло-виях повторяемости. Обобщенные валидационные характеристики методики представлены в табл. 4.
Таблица 4
Валидационные характеристики ВЭЖХ-методики
Характеристики Критерий приемлемости Результаты испытаний
Метилурацил Метронидазо л
Пригодность хроматографической системы:
Сходимость инжекций ЯЯБ < 2,0% 0,62 0,65
Эффективность колонки N не менее 2000 т.т. 2115 13906
Коэффициент ассиметрии не более 2 1,26 1,51
Критерий раз-деления пиков Де > 1,5 6,01 4,61
Линейность г > 0,9990 0,9991 0,9999
Правильность R±ДR=100±2% 99,49±0,85% 99,б0±0,85%
Прецизионность ЯЖ= ±2% 0,96 0,88
В результате проведенных исследований установлено, что ВЭЖХ-методика оп-ределения метилурацила и метронидазола в составе регенерирующего действия дос-тупна, занимает минимум рабочего времени, не требует дорогостоящих реактивов и позволяет объективно оценить качество многокомпонентной лекарственной формы. Полученные результаты включены в Методические рекомендации по изготовлению и контролю качества составов для местной терапии ожогов пищевода. Заключение.
1. Проведена валидация методики качественного и количественного анализа метронидазола и метилурацила в составе № 2 для местного лечения ожогов пищевода в фазу регенерации методом ВЭЖХ.
2. Установлены параметры пригодности хроматографической системы, специ-фичности, линейности, правильности и прецизионности разработанной методики.
Литература
I. Воробьева, В.М. Ранозаживляющее действие новых лекарственных составов, предна-значенных для лечения ожогов пищевода, в эксперименте / В.М.Воробьева, Д.Г. Полухин, А.В. Лепилов,
A.К.Смирнов // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2010. - Т. 73, № 2. - С. 31-342. ГОСТ ИСО 5725-3-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и ре-зультатов измерений» [Электронный ресурс]. - М. : Госстандарт, 2002. - Режим доступа: http://www.docload.ru.
3. Патент № 2286781 Способ лечения химических ожогов пищевода у детей / В.А. Кожев-ников,
B.М Воробьева, А.К. Смирнов, В.Ф. Турецкова, Д.Г. Полухин (РФ), заявка 2003121575/14 от
II.07.2003 г., патент РФ №2286781, опубликовано 10.11.2006 г., Бюл. № 31. - 8 с.
4. Смирнов, А.К. Лечение и профилактика рубцовых стенозов пищевода и желудка по-сле химических ожогов у детей : автореф. дис. ...д-ра мед.наук / А.К. Смирнов. - Барнаул, 2009. - 40 с.
5. Эпштейн, Н. А. Оценка пригодности (валидация) ВЭЖХ методик в фармацевтиче-ском анализе // Химико-фармацевтический журнал. -2004. - Т. 38, № 4. - С. 40-55.
6. Эпштейн, Н.А. О требованиях к пригодности хроматографической системы при кон-троле качества лекарственных субстанций и препаратов методом ВЭЖХ / Н.А. Эпштейн, С.В. Емшанова // Химико-фармацевтический журнал. - 2008. - Т. 42, № 11. - С. 34-40.
7. European Pharmacopoeia, 7th ed. European Directorate for the Quality of Medicines, Coun-cil of Europe. - Strasburg, France, 2010.
8. ICH Harmonized Tripartite Guidelines. ICH Q2A «Text on Validation of Analytical Proce-dures». -ICH, Geneva, 1995.
9. ICH Harmonized Tripartite Guidelines. ICH Q2B «Validation of Analytical Procedures: Methodology». - ICH, Geneva, 1997.
VALIDATION OF HPLC TECHNIQUE IN ASSAYING FORMULATIONS FOR ESOPHAGEAL BURN TERAPY IN REGENERATION PHASE
V.M. VOROBYEVA L.E. KUDRIKOVA Altai The article presents experimental data validation of State Medical University, Barnaul e-mail: HPLC technique for qualitative and quantitative
[email protected] assaying of methyluracil and metronida-zole,
constituting the № 2 formulation for local therapy of esophageal burns has been conducted. Parameters of HPLC applicability and of speci-ficity, linearity, correctness and precision of the technique have been de-termined. Key words: formulations for esophageal burns therapy, HPLC, quan-tification, validation.
