CC BY
456
Г.В.РАМЕНСКАЯ, ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова Минздравсоцразвития России, Филиал «Клиническая Фармакология» НЦ БМТ РАМН, И.Е.ШОХИН, ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова Минздравсоцразвития России,
A.Ю.САВЧЕНКО, ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова Минздравсоцразвития России, Филиал «Клиническая Фармакология» НЦ БМТ РАМН, К.С.ДАВЫДОВА, Филиал «Клиническая Фармакология» НЦ БМТ РАМН,
B.Г.КУКЕС, ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова Минздравсоцразвития России, Филиал «Клиническая Фармакология» НЦ БМТ РАМН
Обзор требований
К ВАЛИДАЦИИ БИОАНАЛИТИЧЕСКИХ МЕТОДИК
Ключевые слова: валидация, биоаналитическая методика, биоэквивалентность, FDA, EMA
Дана оценка требований к валидации биоаналитических методик в соответствии с документами U.S. FDA и Европейского Медицинского Агентства (EMA). Описаны подходы к установлению основных валидационных характеристик биоаналитической методики — специфичность, линейность, прецизионность (на уровнях inter-day/within run и intra-day/between run), правильность (на уровнях inter-day/within run и intra-day/between run), предел количественного определения и стабильность. Приведены рекомендации по оценке приемлемости анализа испытуемых образцов.
• ВВЕДЕНИЕ
В документах U.S. FDA и EMA биоаналитической методикой называется методика количественного определения лекарственных веществ (ЛВ) и (или) их метаболитов в биологических объектах (цельной крови, плазме, сыворотке, моче и др.) человека и животных [1, 2]. Биоаналитические методики используются в основном при проведении фармакокинетических исследований (в т.ч. исследований биоэквивалентности), токсикокинетических исследований, изучении метаболизма. Основные методы анализа, применяемые для определения ЛВ и их метаболитов в биологических жидкостях, преимущественно относятся к хроматографическим (ВЭЖХ, ГЖХ, ВЭЖХ-МС, ВЭЖХ-МС-МС, ГХ-МС, ГХ-МС-МС), а также к иммунологическим (например, твердофазный иммунофермент-ный анализ или поляризационно-флуоресцентный иммуноанализ) и микробиологическим [1, 2].
Согласно рекомендациям ICH [3, 4] биоаналитическая методика, как и любая аналитическая методика, должна быть подвергнута валидации. При этом следует отметить, что требования к валидации фармакопейных аналитических и биоаналитиче-ских методик различаются [5]. Это в первую очередь связано с большей
вариабельностью результатов биоаналитических определений (поскольку такие методики могут включать в себя процессы экстракции, осаждения белков и др.), а также со сложным составом биологической матрицы, содержащей определяемое вещество [6].
• ОСОБЕННОСТИ ВАЛИДАЦИИ БИОАНАЛИТИЧЕСКИХ МЕТОДИК
II1HBHHIH
Key words: validation, bioanalytical method, bioequivalence, FDA, EMA
Paper is devoted to comparative requirements to validation of bioanalytical methods according U.S. Food and Drug Administration and European Medicinal Agency (EMA). Evaluation of bioanalytical validation characteristics — specificity, linearity, precision (interday/within run h intra-day/between run), accuracy (inter-day/within run h intraday/between run), limit of quantification (LLOQ and ULOQ) and stability is described. Recommended structure of validation protocol is stated. RAMENSKAYA G.V., SHOHIN I.E., SAVCHENKO A.Y., DAVIDOVA K.S. and KUKES V.G. COMPARATIVE REQUIREMENTS TO VALIDATION OF BIOANA-LYTICAL METHODS.
В настоящее время существуют два основных руководства по валидации биоаналитических методик — руководство для предприятий U.S. FDA 2001 г. [1] и драфт-руководство Европейского Медицинского Агентства (ЕМА) 2009 г. [2]. В Российской Федерации нормативные документы, регламентирующие процедуру подобной валидации, отсутствуют, а данные вопросы затрагиваются в научных публикациях. Валидация биоаналити-ческой методики может быть полной, частичной либо кросс-валидацией. Полную валидацию проводят при разработке новой биоаналитической методики. Частичную валидацию проводят при смене лаборатории, оборудования, условий хранения проб и т.д. Для проведения частичной валидации обычно бывает достаточно провести определение правильности и прецизионности на уровнях intra-day (between-run) и, если применимо, определение стабильности. Кросс-валидацию проводят при необходимости сравнения результатов определений, полученных из разных лабораторий. При этом результаты анализа определяемого вещества с помощью обеих методик не должны различаться более чем на 15% [1, 2].
ВАЛИДАЦИОННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ БИОАНАЛИТИЧЕСКОЙ МЕТОДИКИ
• СПЕЦИФИЧНОСТЬ/СЕЛЕКТИВНОСТЬ (SELECTIVITY)
Специфичность — это способность методики безусловно определять действующее вещество в присутствии компонентов, которые могут содержаться в пробе [7]. Для определения специфичности методики проводят
анализ не менее 6 образцов чистой биологической жидкости. Параллельно проводят анализ чистой биологической жидкости, к которой предварительно прибавляют стандартный раствор определяемого вещества или веществ (и внутреннего стандарта, если это применимо) в таком количестве, чтобы его содержание в пробе находилось в предполагаемом диапазоне концентраций фармакокинетической кривой. Также анализируют стандартный раствор определяемого вещества и при необходимости — внутреннего стандарта. На всех хроматограммах образцов чистой биологической жидкости не должно наблюдаться пиков со временем удерживания, соответствующим времени удерживания определяемого вещества и внутреннего стандарта, которое определяют по хроматограммам стандартного раствора. Руководство ЕМА уточняет, что максимально допустимое мешающее воздействие посторонних веществ с временами удерживания определяемого вещества (и внутреннего стандарта, если это применимо) не должно превышать 20% от предела количественного определения (ПКО) определяемого вещества. В противном случае необходимо изменение условий методики определения [1, 2].
• ЛИНЕЙНОСТЬ/КАЛИБРОВОЧНАЯ КРИВАЯ (CALIBRATION CURVE)
Линейность — это способность методики (в пределах определенного диапазона) получать результаты, прямо пропорциональные концентрации (количеству) действующего вещества в пробе [7]. Для определения линейности проводят анализ не менее 6 образцов (обычно 6—8) чистой биологической жидкости, к каждому из которых предварительно прибавляют стандартный раствор определяемого вещества (и внутреннего стандарта, если это применимо) в таком количестве, чтобы содержание определяемого вещества в полученных растворах соответствовало предполагаемому диапазону концентраций фармакокинетической кривой (калибровочные образцы), причем данный диапазон дол-
жен включать в себя предполагаемый ПКО. Кроме того, проводят анализ пробы чистой биологической жидкости, к которой не прибавляют ЛС (холостая проба), и чистой биологической жидкости с прибавлением внутреннего стандарта (нулевая проба). При построении калибровочной кривой используют пригодные статистические методы (например, регрессионный анализ), причем нулевая точка в расчет не принимается. Для оценки приемлемости линейности в уравнение калибровочной кривой подставляют средние значения площадей пиков калибровочных образцов и рассчитывают отклонения полученных значений концентраций от фактических. Величина относительной погрешности рассчитанных концентраций от фактических для точки, соответствующей ПКО, не должна превышать 20%, для остальных точек — 15%, причем данное условие должно соблюдаться не менее чем для 4 образцов из 6 (FDA) [1] либо не менее чем для 75% образцов, но не менее 6 (ЕМА). [2] В случае, если несколько (в рамках вышеуказанных условий) калибровочных стандартов не соответствуют критерию приемлемости, то необходимо повторно рассчитать уравнение калибровочной кривой, при этом выпадающие результаты не учитывают.
• ПРЕЦИЗИОННОСТЬ И ПРАВИЛЬНОСТЬ (PRECISION AND ACCURACY)
Прецизионность и правильность методики определения лекарственного вещества в биологической жидкости определяют на двух уровнях — в течение 1 рабочего дня (inter-day accuracy и inter-day precision) и в течение нескольких (не менее 2) рабочих дней (intra-day accuracy и intra-day precision) [1, 2]. При использовании хроматографа с автосамплером (ЕМА) допустимо проводить определение прецизионности и правильности в пределах одной хроматографической последовательности (within-run accuracy и within-run precision) и между хроматографическими последовательностями (between-run accuracy и between-run precision) [2]. Прецизионность и
правильность методики определяют на одних и тех же пробах. Для этого проводят анализ не менее 3 (FDA) или 4 (EMA) образцов чистой биологической жидкости, к каждому из которых предварительно прибавляют стандартный раствор определяемого вещества и внутреннего стандарта при необходимости в таком количестве, чтобы содержание определяемого вещества в полученных растворах находились на нижней границе (ПКО), верхней границе (75% от верхней точки линейного диапазона) и середине (50%) линейного диапазона методики [1, 2]. ЕМА дополнительно рекомендует анализировать точку, соответствующую 3-кратному значению ПКО [2]. Каждую пробу хроматографируют не менее 5 раз и рассчитывают по калибровочной кривой концентрации определяемого вещества в биологической жидкости. Прецизионность и правильность методики характеризуют величины относительного стандартного отклонения и относительной погрешности, соответственно. Данные значения не должны превышать 20% для точки, соответствующей ПКО, и 15% — для остальных точек на уровнях inter-day (within-run) и intra-day (between-run) [1, 2].
Кроме того, руководство FDA совместно с прецизионностью и правильностью рекомендует определять степень извлечения (recovery), которая представляет собой отношение отклика детектора пробы биологической жидкости с прибавленным раствором определяемого вещества и раствора этого вещества такой же концентрации. При этом критерий приемлемости степени извлечения не нормируется [1]. В то же время очевидно, если методика обладает приемлемой правильностью и прецизионностью, это подразумевает, что степень извлечения соответствует допустимым нормам и ее определение не требуется.
• ПРЕДЕЛ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ (LOWER LIMIT OF QUANTIFICATION, UPPER LIMIT OF QUANTIFICATION)
Оба нормативных документа (FDA и EMA) выделяют два предела количест-
венного определения — нижний ПКО (LLOQ) и верхний ПКО (ULOQ). Нижнему пределу количественного определения соответствует минимальная концентрация определяемого вещества в биологической жидкости, для которой величины относительного стандартного отклонения и относительной погрешности не превышают 20% на уровнях inter-day (within-run) и intra-day (between-run). FDA дополнительно уточняет, что отношение сигнал-шум для ПКО должно составлять не менее 5. Верхнему пределу количественного определения соответствует верхняя точка линейного диапазона калибровочной кривой [1, 2].
• СТАБИЛЬНОСТЬ (STABILITY)
Определение стабильности проводят с целью подтверждения, что ни один из этапов анализа, включая хранение образцов, не влияет на концентрацию определяемого вещества в пробе. При полной валидации биоанали-тической методики рекомендуется проводить следующие испытания на стабильность [1, 2]:
« стабильность исходного и рабочих растворов стандартного вещества и внутреннего стандарта (stock solution stability);
« стабильность определяемого вещества в биологической жидкости после заморозки и разморозки (freeze and thaw stability). Данную характеристику определяют после, по крайней мере, 3 циклов заморозки и разморозки; + длительная стабильность определяемого вещества в биологической жидкости при хранении в морозильнике (long term stability). Данную характеристику определяют в течение периода времени, соответствующего длительности одного исследования;
« кратковременная стабильность определяемого вещества в биологической жидкости и пробах (экстракте и т.д.) при комнатной температуре (short term stability). Данную характеристику определяют в течение 4—24 часов;
« стабильность приготовленных проб, в т.ч. при хранении в автосамплере (post-preparative stability). Данную ха-
рактеристику определяют в течение периода, соответствующего времени хранения хроматографической последовательности в автосамплере. Стабильность исходного и рабочих растворов стандартного вещества и внутреннего стандарта определяют после соответствующего разведения до концентрации, соответствующей диапазону линейности детектора. Для определения других видов стабильности проводят анализ не менее
3 проб (растворов) чистой биологической жидкости, к каждому из которых предварительно прибавляют стандартный раствор определяемого вещества (и внутреннего стандарта, если это применимо) на двух уровнях концентраций, соответствующих нижней и верхней части калибровочной кривой. Стабильность считается подтвержденной, если величина относительной погрешности рассчитанных значений концентраций от фактических не превышает 15% [1, 2].
• АНАЛИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ
Анализ исследуемых образцов допустимо проводить только после проведения валидации используемой методики. В течение каждого рабочего дня (при проведении анализа на хроматографе без автосамплера) либо в одной хроматографической последовательности (при проведении анализа на хроматографе с автосампле-ром) необходимо дополнительно анализировать [2]:
Ф пробу чистой биологической жидкости;
+ пробу чистой биологической жидкости с прибавлением внутреннего стандарта, если это применимо;
+ не менее 6 проб чистой биологической жидкости с прибавлением определяемого вещества в линейном диапазоне методики (калибровочные стандарты);
♦ по 2 пробы чистой биологической жидкости (контрольные пробы),
к каждой из которых предварительно прибавляют стандартный раствор определяемого вещества и внутреннего стандарта, если это применимо, не менее чем на 3 уровнях концент-
раций (на нижней границе, верхней границе и середине линейного диапазона методики). Общее количество контрольных образцов, анализируемых в течение 1 рабочего дня (одной хроматографической последовательности), должно составлять не менее 5% от общего количества анализируемых проб.
Рекомендуется проводить определение проб от одного добровольца в течение 1 рабочего дня (одной хроматографической последовательности). Допустимо проводить определение проб от нескольких добровольцев в течение 1 рабочего дня (одной хроматографической последовательности).
Результаты анализа серии проб, проанализированных в течение 1 рабочего дня (одной хроматографической последовательности), считаются достоверными, если [2]:
« величина относительной погрешности рассчитанных концентраций калибровочных стандартов от фактических для точки, соответствующей ПКО, не превышает 20%, для остальных точек — 15%. Данному критерию приемлемости должно соответствовать не менее 75% от общего количества калибровочных стандартов, но не менее 6. Если несколько (но не более 25%) калибровочных стандартов не соответствуют критерию приемлемости, то необходимо повторно рассчитать уравнение калибровочной кривой, при этом выпадающие результаты не учитывают. Если выпадающим результатом является проба, соответствующая ПКО, то за ПКО принимают следующую концентрацию калибровочного стандарта;
« величина относительной погрешности рассчитанных значений концентраций от фактических для не менее 4 из 6 контрольных проб и не менее 50% контрольных проб на каждом из уровней концентраций не превышают 15%.
Кроме того, величины относительной погрешности и относительного стандартного отклонения (RSD, %) между рабочими днями или хроматографическими последовательностями для всех контрольных образцов не должны превышать 15%. В
случае несоответствия критерия приемлемости необходимо переделать все пробы, проанализированные в данный рабочий день (хроматографическую последовательность) [1, 2].
• СРАВНИТЕЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ТРЕБОВАНИЙ
Следует отметить следующие основные особенности биоаналитической валидации, которые отличают ее от валидации фармакопейных методик [1, 2, 5]:
« для валидации используют пробы чистой биологической жидкости, к которой предварительно прибавляют раствор определяемого вещества (и внутреннего стандарта, если это применимо);
4 нормы метрологических характеристик (относительной погрешности и относительного стандартного отклонения) для биоаналитической методики составляют не более 15% и не более 20% для уровня концентраций, соответствующих пределу количественного определения (ПКО);
4 прецизионность и правильность методики определяют на двух уровнях — в течение 1 рабочего дня (inter-day accuracy и inter-day precision) и в течение нескольких рабочих дней (intra-day accuracy и intra-day precision).
При этом руководство ЕМА, очевидно, в первую очередь ориентировано на валидацию методик определения хромато-масс-спектрометрическими методами. В данном руководстве имеется валидационная характеристика «матрикс-эффект» (matrix effect), которую следует устанавливать только для методов ВЭЖХ-МС, ВЭЖХ-МС-МС, ГХ-МС и ГХ-МС-МС. Кроме того, прецизионность и правильность рекомендуется устанавливать не на уровнях 1 рабочего дня и нескольких рабочих дней, а в течение одной хроматографической последовательности (within run) и между хроматографическими последовательностями (between run), что подразумевает использование современного хроматографа с автосамплером. При этом при анализе испытуемых образцов
в каждую хроматографическую последовательность дополнительно включается не менее 14 дополнительных проб (контрольных, калибровочных и нулевых) [2]. Обычно время хроматографирования пробы биожидкости методом ВЭЖХ составляет 15—30 минут [8, 9], в то время как хромато-масс-спектрометричес-ким — 5—10 минут [10, 11], поэтому анализ такого количества валидаци-онных образцов на хроматографе, не оснащенном МС-детектором, может вызвать затруднения.
Помимо этого, стоит отметить более высокие требования драфт-руковод-ства ЕМА к определению прецизионности и правильности (не менее
4 уровней концентраций, в отличие от требований FDA — не менее 3 уровней) и линейности (не менее
75% и не менее 6 калибровочных стандартов должно соответствовать нормам, по FDA — не менее 4 из 6) [1, 2].
В обоих руководствах также приведены требования к составлению вали-дационного протокола и протокола анализа (следует отметить, что в протокол анализа при исследованиях биоэквивалентности рекомендуется включать не менее 20% хроматограмм), а также рекомендации по валидации методик, основанных на иммунных и микробиологических методах [1, 2]. В целом, руководство ЕМА выглядит более строгим и современным, в то же время при разработке аналогичного российского документа целесообразно основываться на обоих документах.
Ф
ЛИТЕРАТУРА
1. Guidance for Industry: Bioanalytical method validation. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evolution and Research (CDER). U.S. Government Printing Office: Washington, DC, 2001.
2. Guideline on validation of bioanalytical methods (draft). European Medicines Agency. Committee for medicinal products for human use: London, 2009.
3. ICH Harmonized Tripartite Guidelines. ICH Q2A «Text on Validation of Analytical Procedures». — ICH, Geneva, 1995.
4. ICH Harmonized Tripartite Guidelines. ICH Q2B «Validation of Analytical Procedures: Methodology». — ICH, Geneva, 1997.
5. Guidance for Industry: Analytical procedures and method validation (draft). U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evolution and Research (CDER). U.S. Government Printing Office: Washington, DC, 2000.
6. Shah V.P., Midha K.K., Dighe S., McGilveray I.J., Skelly J.P., Yacobi A., Layloff T., Viswanathan C.T., Cook C.E., McDowall R.D., Pittman K.A., Spector S. Analytical methods validation: bioavailability, bioequivalence and pharmacokinetic studies. Conference report. Pharm.Res. — 1992. — №9. — P. 588—592.
7. Валиадция аналитических методик для производителей лекарств. Типовое руководство предприятия по производству лекарственных средств, подготовленное Федеральным Союзом Фармпроизводителей Германии (BAH). Пер. Аладышевой Ж.И. и Спицкого О.Р Под ред. Береговых В.В. — М., Литерра, 2008. — 70 с.
8. Widmer N., Beguin A., Rochat B., Buclin T., Kovacsovics T., Duchosal M.A., Leyvraz S., Rosselet A., Biollaz J., Decosterd L.A. Determination of imatinib (Gleevec) in human plasma by solid-phase extraction-liquid chromatography-ultraviolet absorbance detection. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. — 2004. — Vol. 803. — №2. — P. 285—292.
9. Zufia .L, Aldaz A., Giraldez J. Simple determination of capecitabine and its metabolites by liquid chromatography with ultraviolet detection in a single injection. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. — 2004. — Vol. 809. — №1. — P. 51—58.
10. Roth O., Spreux-Varoquaux O., Bouchet S., Rousselot P., Castaigne S., Rigaudeau S., Raggueneau V., Therond P., Devillier P., Molimard M., Maneglier B.I matinib assay by HPLC with photodiode-array UV detection in plasma from patients with chronic myeloid leukemia: Comparison with LC-MS/MS. Clin Chim Acta. — 2010. — Vol. 411. — №3 — 4. — P. 140—146.
11. Guichard S.M., Mayer I., Jodrell D.I. Simultaneous determination of capecitabine and its metabolites by HPLC and mass spectrometry for preclinical and clinical studies. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. — 2005. — Vol. 826. — №1—2. — P. 232—237.
