CC BY
136
Исследование фармакокинетики мебеверина в форме капсул с пролонгированным высвобождением
Хохлов А.Л.12, Джурко Ю.А.2, Шитов Л.Н.12, Яичков И.И.12, Шитова А.М.2,
Хозова Л.А.2, Мирошников А.Е.1
1 - ФГБОУ ВО «Ярославский государственный медицинский университет» МЗ РФ, г. Ярославль 2 - ООО «Квинта-Аналитика Ярославль», г. Ярославль
Резюме. Было проведено исследование фармакокинетики мебеверина в форме капсул с пролонгированным высвобождением на 24 здоровых добровольцах. Известно, что данное лекарственное вещество полностью метаболизируется на пресистемном этапе. Поэтому измерялись фармакокинетические параметры только его основных метаболитов - мебевериновой кислоты и деметилированной мебевериновой кислоты. Для определения концентрации данных метаболитов в плазме крови разработана биоаналитическая методика с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием.
Ключевые слова: мебеверин, мебевериновая кислота, деметилированная мебевериновая кислота, фармакокинетика, ВЭЖХ-МС/МС
Pharmacokinetic study of prolonged release capsules of mebeverine
Khokhlov A.L.1,2, Dzhurko Yu.A.2, Shitov L.N.1,2, Yaichkov I.I.1,2, Shitova A.M.2, Khozova L.A.2, Miroshnikov A.E.1 1 - The Yaroslavl State Medical University, Yaroslavl 2 - Quinta-Analytica Yaroslavl LLC, Yaroslavl
Resume. Pharmacokinetic study of prolonged release capsules of mebeverine was carried out on 24 volunteers. It is known that the drug substance is completely metabolized due to first-pass effect. Therefore, pharmacokinetic parameters of the main metabolites -mebeverine acid and desmethyl mebeverine acid were measured. Bioanalytical method was developed to measurement of concentrations of these metabolites in blood plasma by using HPLC-MS/MS.
Keywords: mebeverine, mebeverine acid, desmethyl mebeverine acid, pharmacokinetic, HPLC-MS/MS
Автор, ответственный за переписку:
Яичков Илья Игоревич - аспирант кафедры клинической фармакологии с курсом ИПДО ФГБОУ ВО «Ярославский государственные медицинский университет» МЗ РФ; 150043, г. Ярославль, ул. Автозаводская, д.29, кв. 97; +7 (910) 977-74-98; e-mail: ¡[email protected]
Введение
Мебеверин является миотропным спазмолитиком, механизм действия которого основан на блокаде быстрых натриевых и медленных кальциевых каналов на мембране миоцита, что замедляет её деполяризацию и препятствует сокращению мышечных волокон. Он обладает высокой селективностью в отношении глад-комышечных клеток желудочно-кишечного тракта, поэтому его используют, в основном, при спазмах различных отделов пищеварительной системы. Данный препарат обеспечивает как надёжный антиспастический эффект, так и препятствует развитию атонии (прокинетическое действие) [1].
Мебеверин, являющийся сложным эфиром, быстро гидролизуется на этапе пресистемной элиминации ферментами-эстеразами до 3,4-диметоксибензойной (вератровой) кислоты и мебеверинового спирта. Основными метаболитами данного препарата являются мебевериновая кислота (МК) и деметилмебевериновая кислота (ДММК) (рис.1) [2].
Период полувыведения ДММК при приёме капсул с пролонгированным высвобождением, по данным
[1, 3], составляет 5—6 ч, максимальная концентрация в крови (Стах) после однократного приёма составляет — 679 нг/мл, после двукратного приёма — 804 нг/мл, время достижения максимальной концентрации (Ттах) около 2,92 ч. Площадь под фармакокинетической кривой «концентрация—время» от нуля до последнего отбора крови (ЛиОм) для ДММК, согласно [3], равна 4 552 нг х ч/мл, константа элиминации равна 0,147 ч-1. Значения фармакокинетических параметров для МК не опубликованы. Поэтому получение новых данных о фармакокинетике мебеверина в форме капсул с модифицированным высвобождением является актуальным.
Известны методики количественного определения метаболитов мебеверина в плазме крови методами ВЭЖХ и ВЭЖХ-МС/МС [2-6]. Недостатками данных методик является длительная пробоподготовка с использованием твёрдофазной и жидкостно-жидкостной экстракции и низкая чувствительность.
В связи с этим целью данной работы является изучение фармакокинетики лекарственного препарата мебеверина в форме капсул (Дюспаталин) и разработка новой чувствительной и экспрессной биоаналитиче-
57
ФАРМАКОКИНЕТИКА И ФШЩИШИКА
Мсбосрп
СИ.
McívecpiiiioBiin oirii p i
Нсрисришн кии.тнпа
Рис. 1. Схема метаболизма мебеверина
'r^j
ЛХХ
г
j
М 111'i н м я
KIH-kllU
JM
а' -|,v'' Лсысиишрнккипи
■нбсщфцМн j iL'.-.i'.i i a
скои методики для определения концентрации его метаболитов в плазме крови методом ВЭЖХ-МС/МС.
Материалы и методы
Для измерения концентрации метаболитов мебеверина в плазме крови использовалась ВЭЖХ-МС/МС-система, оснащённая трёхквадруполь-ным масс-спектрометрическим детектором Thermo Scientific TSQ Quantum Ultra. Подготовка проб осуществлялась методом осаждения белков; процедуры пробоподготовки включали внесение в образцы внутренних стандартов — мебевериновой кисло-ты^5(МК^-5) и деметилированной мебевериновой кислоты-DS (ДММК-DS) (рис. 2). Разделение
Рис. 2. Структурные формулы изотопно-меченных внутренних стандартов для определения мебевериновой кислоты (а) и деметилированной мебевериновой кислоты (б)
компонентов биологической матрицы проводили на двух хроматографических колонках Phenomenex Luna 5uC8, (150 х 4,6 мм, 5 мкм) и Phenomenex Luna 5uC8, (150 х 4,6 мм, 5 мкм) с использованием подвижной фазы на основе ацетонитрила и формиатного буферного раствора при градиентном режиме элюирования. Масс-спек-трометрический детектор работал в режиме регистрации положительных ионов последующим MRM-переходам: для МК m/z - 280—>121, для ДММК m/z - 266,2—107, для MK-D5 m/z - 285—121, для ДММК^5 m/z - 271—107. Время анализа составило 6 мин.
Валидация аналитической методики выполнялась в соответствии с требованиями руководств EMEA [7], FDA [8] и Руководства по экспертизе лекарственных средств НЦЭСМП (Т.1) [9]. Полученные результаты валидационных тестов представлены в табл. 1, они отвечают всем установленным критериям приемлемости. Определение концентраций обоих аналитов проводилось в диапазоне от 10 до 2 000 нг/мл. Были использованы следующие калибровочные точки:10, 50, 200, 500, 750, 1 000, 1 500, 2 000 нг/мл. Содержание определяемых веществ в образцах контроля качества составило 10, 30, 400, 800, 1 600, 2 000 нг/мл.
Исследование фармакокинетики
Исследование фармакокинетики препарата Дюспа-талин проводилось в соответствии с требованиями ГОСТ Р 52379-2005 «Надлежащая клиническая практика», нормативных документов FDA [10] и EMEA [11], а также в соответствии с этическими принципами, изложенными в Хельсинкской Декларации [12].
В популяцию для оценки фармакокинетических параметров было включено 24 испытуемых в возрасте от 18 до 45 лет, в том числе 13 женщин и 11 мужчин европеоидной расы, отобранных согласно критериям включения и не включения. В скрининге приняло участие 37 кандидатов. Средний возраст добровольцев составил 25,8±7,1 лет, рост - 171,5±9,4 см, масса -68,1±10,5 кг, ИМТ - 23,3±2,8 кг/м2.
58
ФШКОШЕТШ И ФШЩШМШ
МШГСМ Л^ШЖЯ^ (М
Таблица 1
Валидационные характеристики разработанной методики
№ п/п Валидационный параметр Результаты
Анализ 6 образцов бланковой плазмы крови (полученной из разных источни-
1 Селективность ков) и плазмы, содержащей определяемые вещества показал, что интерференция в области времени удерживания аналитов не превышала 20% от уровня LLOQ, а в области времени удерживания внутренних стандартов — не превышала 5% от их концентрации (рис. 3)
2 Нижний предел количественного определения (LLOQ) МК 10 нг/мл (точность 101,39% от теоретической, прецизионность (СУ*) — 15,75%)
ДММК 10 нг/мл (точность 108,22% от теоретической, прецизионность (СУ) — 9,34%)
3 Линейность МК Диапазон концентраций: 10—2 000 нг/мл. Коэффициент корреляции калибровочной кривой (г2): 0,9987—0,9999
ДММК Диапазон концентраций: 10—2 000 нг/мл. Коэффициент корреляции калибровочной кривой (г2): 0,9965—0,9999
4 Прецизионность и точность МК Точность от 101,39% до 107,42%; СУ от 6,31% до 15,75%
ДММК Точность от 108,09 до 110,48%; СУ от 4,01% до 9,34%
5 Степень извлечения МК 91,48 %
ДММК 91,98%
6 Отсутствие влияния разведения (двукратное разведение МК Точность — 112,23%
образцов с концентрацией аналитов 3 200 нг/мл) ДММК Точность — 110,58%.
7 Эффект влияния матрицы МК NMF** находился в диапазоне от 1,053 до 1,063; CV от 2,24 до 3,23%
ДММК NMF** находился в диапазоне от 1,060 до 1,127; CV от 2,89 до 2,95%
Краткосрочная МК 97,81% от номинальной концентрации
(24 ч) ДММК 98,46% от номинальной концентрации
Долгосрочная МК 105,45% от номинальной концентрации
8 Стабильность (28 дней) ДММК 110,33% от номинальной концентрации
При МК 110,79% от номинальной концентрации
замораживании/ размораживании ДММК 110,98% от номинальной концентрации
Примечание: * — Коэффициент вариации; NMF** — нормализованный фактор матрицы.
Отбор образцов крови осуществлялся до приёма препарата и через 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 5; 6; 8; 10; 12 и 24 ч после приёма препарата через локтевые катетеры [3, 13]. Плазму немедленно отделяли центрифугированием и замораживают при температуре не выше — 20 °С. В связи с быстрым пресистемным метаболизмом лекарственного вещества определялись концентрации двух основных метаболитов — мебевериновой кислоты и деметилмебевериновой кислоты [1—6].
Для исследования использовался препарат Дюспа-талин в форме капсул пролонгированного действия в дозировке 200 мг производства «Эбботт Хелскеа САС» (Франция) (серия 10215, годен до 04.2017).
Статистическая обработка полученных результатов проводилось с помощью пакетов программного обеспечения Rv. 3.2.1, модуль Bear (Lee, Hsin-yaandLee, Yungjin (2014). bear: Data Analysis Tool for Average Bioequivalence and Bioavailability.Rpackage
version 2.6.4) и StatSoft STATISTICA v.12. Рассчитывались следующие фармакокинетические параметры:
♦ максимальное измеренное значение концентрации метаболитов в плазме крови (Cmax);
♦ время достижения максимальной концентрации
(Tmax);
♦ площадь под фармакокинетической кривой «концентрация—время» от нуля до последнего отбора крови (AUC0_t), при котором концентрация метаболитов равна или выше нижнего LLOQ методики;
♦ площадь под фармакокинетической кривой, начиная с нулевого значения времени до бесконечности (AUC0-M);
♦ отношение значений AUC0-t к AUC0_M — относительная скорость всасывания (Cmax/AUC);
♦ константа скорости терминальной элиминации
(K);
59
ФШШШШ И ФШЩШМШ
ДММК-D5 МК-D5 а
ДММК^5 МК-D5 б
Рис. 3. Примеры хроматограмм: бланковой плазмы и плазмы с добавлением аналитов (а) на уровне LLOQ и внутренних стандартов (б)
№ 1. 2017!
60
! ФШШШШ И ФШЩШМШ
• период полувыведения метаболитов (Т^);
♦ среднее время удержания метаболитов в крови (MRT).
Полученные результаты представлены в табл. 2 и проиллюстрированы на рис. 4. Среднее значение соотношения AUC0-t/AUC0-M для мебевериновой кислоты равнялись 88,51%, для деметилированной мебеверино-
вой кислоты — 86,26%, что указывает на достаточную длительность наблюдения. Средние значения максимальных концентраций МК и ДММК, определяемых в плазме крови добровольцев, составили 62,52±35,01 и 291,81±125,92 нг/мл, соответственно, средние значения АиС<„ - 293,94+151,78 и 2191,85+542,94 нг х ч/мл, соответственно, средние значения Ттах — 3,27+1,03 и
Таблица 2
Фармакокинетические параметры метаболитов мебеверина
Мебевериновая кислота
Сшах, нг/мл Тшах, ч AUCo-t, нгхч/мл AUCo-„, нгхч/мл AUCo-t / AUCo-„, % Cmax/AUCo-t, ч-1 Kel, ч-1 Т1/2, ч MRT, ч
Mean±SD* 62,52± 35,01 3,27± 1,03 293,94± 151,78 365,85± 140,49 82,34± 11,61 0,2238± 0,0598 0,27584± 0,08426 2,87± 1,39 5,82± 1,57
Min 22,3 1,5 54,03 110,01 47,43 0,1649 0,08683 1,61 4,27
Max 173,5 5 601,03 649,49 96,04 0,4128 0,43138 7,98 11,45
CV, % 56,00 31,55 51,64 38,40 14,10 26,72 30,55 48,38 26,91
Деметилированная мебевериновая кислота
Сщах, нг/мл Тшах, ч AUCo-t, нгхч/мл AUCo.„, нгхч/мл AUCo-t/ AUCo-„, % Cmax/AUCo-t, ч-1 Kel, ч-1 Т1/2, ч MRT, ч
Mean±SD 291,81± 125,92 3,19± 1,48 2191,85± 542,94 2551,74± 546,96 86,26± 11,62 0,1339± 0,0497 0,11605± 0,06657 7,52± 3,31 11,2± 4,25
Min 114,6 1,5 1081,45 1388,65 40,34 0,0838 0,04631 2,33 5,34
Max 607,4 8 3262,43 3547,35 95,84 0,2969 0,29771 14,97 22,49
CV, % 43,15 46,44 24,77 21,43 13,47 37,15 57,36 44,04 37,97
Примечание: Mean±SD* — среднее значение ± стандартное отклонение.
?50 П
п' v
Я 4 Ц 11 « 30 ¡4
QprtuR, ч
Рис. 4. Усреднённый фармакокинетические профили концентрации мебевериновой и деметилированной мебевериновой кислот в плазме крови добровольцев после однократного приёма капсул Дюспаталин в дозировке 200 мг
Ш 1. 2017
ФШКОШЕТШ И ФШЩШМШ
3,19±1,48 ч, соответственно. Таким образом, время наступления максимальной концентрации для обоих метаболитов было практически одинаковым, при этом максимальная концентрация в плазме, ЛиС04 у ДММК значительно выше, чем у МК. Это может свидетельствовать о том, что большая часть МК сразу после окисления мебеверинового спирта подвергается деметилированию.
Рассчитанные фармакокинетические параметры ДММК существенно отличаются от данных ранее опубликованных исследований (табл. 3) [1—3]. Так,
Таблица 3
Сравнение полученных значений фармакокинетических параметров ДММК с данными литературы [1, 3]
Параметр Полученное значение Опубликованное значение
Cmax, Иг/мл 291,81±125,92 679
T ч i max? ^ 3,19±1,48 2,92
AUC0-t, нгхч/мл 2191,85±542,94 4553
AUC0_„, нгхч/мл 2551,74±546,96 4863
Kel 0,11605±0,06657 0,147
Т1/2, ч 7,52±3,31 4,91
полученные средние значения Cmax, AUC0-t, AUC0_M приблизительно в 2 раза ниже, а измеренный период полувыведения на 2 ч дольше, чем по данным литературы. Это может быть связано с высокой межсубъектной вариабельностью и влиянием ситуационных факторов на процесс гидролиза лекарственного вещества на пресистемном этапе.
Выводы
Таким образом, разработана и валидирована новая экспрессная, точная и чувствительная ВЭЖХ-МС/ МС-методика количественного определения основных метаболитов мебеверина в плазме крови человека, отвечающая всем необходимым требованиям, изложенным в руководствах EMEA, FDA и НЦЭСМП. Предел количественного определения для МК и ДММК составил 10 нг/мл. В результате проведённого с использованием данной методики исследования фармакокинетики капсул в дозировке 200 мг были получены новые данные о фармакокинетических параметрах мебевериновой и деметилмебевериновой кислот, которые могут быть использованы для разработки дизайна исследований биоэквивалентности.
Литература
1. Brittain H.G. Analytical Profiles of Drug Substances and Excipients, Vol. 25.California:Academic press, 1998.
2. StockisA., Guelen P.J.M., de Vos D. Identification of Mebeverine Acid as the Main Circulating Metabolite of Mebeverine in Man. J Pharm Biomed Anal. 2002; 29: 335-340.
3. Winsemius A., Meuwsen I.M., Boon C., van der Laan A., Brekle A., de Vries M. A pharmacokinetic comparison of the modified release capsule and a plain tablet formulation of mebeverine. Int J Clin Pract. 2002; 9 (56): 659-662.
4. Elliott S., Burgess V. Investigative implications of the Instability and Metabolism of Mebeverine. J Anal Tox. 2006; 30: 91-97.
5. Bergeron M., Bergeron A., Amsterdam P., Furtado M., Garofolo F. Use of polarity switching for the simultaneous bioanalysis of analytes with three orders of magnitude difference in concentration by HPLC-MS/MS. Bioanal. 2013; 5 (15): 1911-1918.
6. KhatriCA., PhanikumarCh V., JayaveeraK., Reddy K.Y. Development and Validation of Bioanalytical Method for Simultaneous Quantification of Veratric Acid, Mebeverine Acid and Desmethyl Mebeverine Acid in Human Edta Plasma by Using LC-MS/MS. J Pharm Chem. 2012; 4 (6): 11-18.
7. Guideline on validation of bioanalytical methods (draft), European Medicines Agency, Committee for medicinal products for human use; 2010.
8. Guidance for Industry: Bioanalytical method validation. U. S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evolution and Research (CDER), U. S. Government Printing Office, Washington, DC; 2013.
9. Миронов А.Н., ред. Руководство по экспертизе лекарственных средств. Т. 1. М.: Гриф и К; 2013.
10. Food and Drugs Administration Guidance for Industry: Waiver of In Vivo Bioavailability and Bioequivalence Studies for Immediate Release Solid Oral Dosage Forms Based on Biopharmaceutics Classification SystemRockville, MD: U.S. Department of Health and Human Services, FDA, Center for Drug Evaluation and Research; 2015.
11. Guidance on the investigation of bioequivalence,European Medicines Agency, Committee for medicinal products for human use; 2010.
12. Declaration of Helsinki of the AMM-Ethical Principles for Medical Research in humans, World Medical Assembly, 64th General Assembly; 2013.
13. Хохлов А.Л., Лилеева Е.Г., Синицина О.А., Спешилова С.А., Дема-рина С.М., Шитов Л.Н. Проблемы проведения биоаналитической части исследований биоэквивалентности лекарственных препаратов в России. Фармакокинетика Фармакодинамика. 2014; 1: 37-43.
62
ФАРМАКОКИНЕТИКА И ФАРМАКОДИНАМИКА
