CC BY
10
МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИИ
Выводы. Опыт работы Национального РДКМ в условиях пандемии демонстрирует необходимость создания в РФ специализированных компаний по транспортировке гемопоэтических стволовых клеток. Специализированная компания должна обеспечить регулярное обучение курьеров, организацию достав-
ки в соответствии с международными и внутренними стандартами, контроль качества доставки, быстрое реагирование в случае нестандартных ситуаций. Что позволит освободить специалистов трансплантационных клиник от необходимости выполнять функцию курьера.
Минаева Н.В., Зорина Н.А., Хоробрых М.Н., Шерстнев Ф.С., Безрукова Л.А., Исаева Н.В., Ветошкин К.А., Утемов С.В., Малышева Н.А, Логинова М.А, Рылов А.В, Парамонов И.В.
СОДЕРЖАНИЕ СD34+ КЛЕТОК В ЛЕЙКОКОНЦЕНТРАТАХ, ПОЛУЧЕННЫХ НА 4 ДЕНЬ МОБИЛИЗАЦИИ, ОТ АЛЛОГЕННЫХ ДОНОРОВ
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства», г. Киров
Введение. В последние десятилетия в качестве источника гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) для трансплантации используется периферическая кровь. Согласно международным стандартам, аппаратные лейкоцитаферезы проводятся на 5-6 день мобилизации ГСК гранулоцитарным колониестимулирующим фактором (Г-КСФ). Наряду с мобилизующим действием, Г-КСФ обладает способностью стимулировать диф-ференцировку ГСК in vivo, что неизбежно снижает плю-рипотентность и пролиферативный потенциал этих клеток. Кроме того, известно, что введение Г-КСФ может сопровождаться нежелательными явлениями у доноров - боли в костях, лихорадка, недомогание, бессонница и т.д. Для успешного приживления трансплантата требуется не менее 2x106 CD34+ клеток/кг массы тела реципиента, а для своевременного восстановления гемопоэза и дальнейшей стабильной функции трансплантата более предпочтительной считается доза не менее 4x106 CD34+ клеток/кг массы тела. Сокращение сроков мобилизации ГСК в периферическую кровь до 3 дней может способствовать снижению числа нежелательных явлений у доноров, способствовать улучшению качественных характеристик трансплантата.
Цель. Оценить содержание CD34+ клеток в лейко-концентратах, полученных методом афереза на 4 день мобилизации с использованием Г-КСФ, от аллогенных доноров
Материалы и методы. Проанализированы характеристики аллогенных ГСК периферической крови, полученных у 143 родственных и неродственных доноров за период в 2015-2020 гг. Мобилизация ГСК проводилась филграстимом в дозе 10 мкг/кг, разделенной на 2 введения, ежедневно в течение 4-5 дней. Первый лей-коцитаферез проводили на 4 день от начала стимуляции с использованием клеточных сепараторов Amicus и Spectra Optia. Содержание CD34+ в лейкоконцентратах оценивали методом проточной цитофлюорометрии. Среди доноров было 57 (39,9%] женщин и 86 (60,1%] мужчин, неродственных - 98, родственных - 45. В качестве оптимальной нами принята доза более 4x106 CD34+/CT массы тела реципиента, субоптимальной от 2 до 4x106 CD34+/CT включительно, недостаточной - менее 2x106 CD34+/^ массы тела. Сроки приживления трансплантата оценены у 27 пациентов, которым
трансплантировано более 4x106 CD34+/кг, полученных в результате однократного афереза, проведенного на 4 день от начала мобилизации в клинике ФГБУН КНИИиГПК ФМБА России. Количественные значения содержания CD 34+ клеток представлены в виде медианы (Ме), первого и третьего квартилей ^1^3), среднего значения и стандартного отклонения.
Результаты. В результате однократного афереза, проведенного на 4 день от начала мобилизации, оптимальная трансплантационная доза ГСК получена от 91 (63,6%) донора, субоптимальная от 33 (23,1%), недостаточная от 19 (13,3%), что потребовало проведения повторных процедур аферезов. Медиана содержания CD34+/кг в трансплантате составила 6,27 (4,77; 9,6), 3,1 (2,5;3,7), 1,5 (0,9;1,9), а количество циркулирующих CD34+ клеток/мкл в периферической крови в день афереза составило 73,6±4,66, 39,6±5,38, 26,6±4,21 соответственно. Проанализировано соотношение массы тела в парах реципиент/донор (т1/т2). Установлено, что оптимальная трансплантационная доза получена при т1/т2 0,92± 0,04, субоптимальная - 1,15±0,06, недостаточная - 1,29± 0,06. Восстановление кроветворения у 25 реципиентов, которым трансплантировано более 4x106 CD34+/кг, полученных в результате однократного афереза на 4 день от начала мобилизации, произошло в соответствии с установленными в трансплантологии сроками: уровень лейкоцитов более 1х109/л в течение 3 последовательных дней достигнут в среднем на +18 сутки, тромбоцитов более 30х109/л - на +16 день. У 2 реципиентов, донорами для которых явились гаплоидентичные родственники, приживления трансплантата не произошло (медиана содержания CD34+ 4,8 х106/кг).
Выводы. У 124 (86,7%) доноров получена достаточная трансплантационная доза в результате однократного лейкоцитафереза, проведенного на 4 день от начала мобилизации ГСК, при этом у 91 (63,6%) достигнуто оптимальное содержание CD 34+ клеток в трансплантате. Показано, что на эффективность заготовки влияет соотношение массы тела реципиента и донора. Восстановление кроветворения у реципиентов происходит в сроки, установленные международными требованиями. Таким образом, использованный нами подход является перспективным, поскольку сокраще-
ВЕСТНИК ГЕМАТОЛОГИИ, том XVII, № 3, 2021
ние сроков мобилизации ГСК в периферическую кровь тимальным содержанием CD 34+ клеток, что может из-до 3 дней и проведения лейкоцитафереза на 4 день не менить взгляд на существующий режим мобилизации у влияет на возможность получения трансплантата с оп- аллогенных доноров ГСК.
Морозова Г.А., Лебедева Л.Л., Шубина Ю.Ф., Бронин Г.О.
ОПЫТ ПРИМЕНЕНИЯ ТЕХНОЛОГИИ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В ИССЛЕДОВАНИИ ХИМЕРИЗМА ПОСЛЕ ТРАНСПЛАНТАЦИИ
ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
Государственное бюджетное учреждение здравоохранения города Москвы «Морозовская детская городская клиническая больница Департамента здравоохранения города Москвы»
Введение. Анализ химеризма - это рутинный тест, выполняемый для оценки результатов трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК). Результаты этого теста дают ценную информацию о приживлении донорских клеток и могут свидетельствовать о возможном рецидиве заболевания, поэтому представленные данные имеют большое значение при принятии решений о необходимых лечебных вмешательствах, таких как трансфузии донорских лимфоцитов и т.д. В настоящее время существуют разнообразные методы выявления химеризма гемопоэтических клеток, однако необходимость высокочувствительных технологий обнаружения небольших клеточных популяций является актуальной проблемой.
Целью данного исследования было изучение мониторинга гемопоэтического химеризма методом количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР] с использованием реагентов GenDx (Нидерланды], ретроспективный анализ полученных результатов и сравнение их с клиническими данными пациентов.
Материалы и методы. Материалом для исследования служили образцы периферической крови и костного мозга пациентов до и после трансплантации и донорские образцы периферической крови. Геномную ДНК выделяли методом связывания и осаждения на мембране с силикагелем (QIAamp DNA MiniBlood Kits, Германия]. Клеточные линии CD3+, CD19+, CD34+ получали методом положительной магнитной сепарации с использованием парамагнитных сфер (Invitrogen, США]. Исследование химеризма проводилось с использованием 29 основных информативных маркеров и 10 дополнительных (в случае необходимости], стратегически размещенных на 16 хромосомах. Перед аллоТГСК ДНК реципиента и донора типировали с помощью набора маркеров KMRtype, мультиплексированных по три в каждой смеси. Поскольку как реципиент так и донор могли быть гомо- и гетерозиготными по маркерам, информативными они являлись, если были отрицательными у реципиента или донора в гомозиготном состоянии. Обнаруженные информативные маркеры служили для наблюдения за реципиентом после трансплантации, при этом уровень химеризма в исследуемых образцах реципиента сравнивался с уровнем химеризма перед трансплантацией (обра-
зец перед трансплантацией служил в качестве эталона]. Этот процесс выполнялся с использованием реагентов KMRtrack, где на реакцию наносился 1 маркер (одиночный комплекс]. Процентное соотношение химеризма рассчитывалось с помощью программного обеспечения производителя KMRengine.
Результаты. Исследовано 57 пациентов (2 получили вторую алло ТГСК] в возрасте от 0,17 до 18 (медиана 10] лет и 57 доноров костного мозга. Среди пациентов 36 страдали различными вариантами острых лейкозов, 9 - апластической анемией, 5 пациентов - талассемией, 5 пациентов с диагнозами: нейробластома, тяжелый комбинированный иммунодефицит, ювенильный миеломоноцитарный лейкоз, гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз, му-кополисахаридоз. Частота исследований проводилась в фиксированные временные точки (+30, +60, +100, +180, +3б5-й дни], при необходимости анализ выполнялся так часто, как того требовала клиническая ситуация. Всего за исследуемый период (20202021гг) было выполнено 450 тестов. У 40 пациентов была проведена родственная ТГСК, при этом для 33 пациентов - от гаплоидентичных родителей и для 7 от ^А идентичных сиблингов. 15 реципиентам была осуществлена неродственная ТГСК от доноров с совместимостью 10/10 (8 пациентов] и 9/10 (7 пациентов]. Для всех пар донор/реципиент были обнаружены не менее двух информативных маркеров, по которым в дальнейшем велся мониторинг химериз-ма гемопоэтических клеток. По уровню химеризма пациенты были разделены на четыре группы: с полным донорским химеризмом, у которых обнаружена 100% донорская ДНК - 44 случая (9,8%]; группа со смешанным химеризмом, у которых присутствует более 1% ДНК реципиента - 220 случаев (48,88%]; третья группа, пациенты с обнаруженной ДНК только реципиента - 6 случаев (1,32%]. Кроме того, нами была выявлена четвертая группа, с так называемым микрохимеризмом, когда в исследуемом образце была обнаружена ДНК реципиента в количестве 0,11% (всего 180 случаев, что составляет 40%].
Выводы. Таким образом, высокая чувствительность представленного метода позволяет выявить гемопоэтический микрохимеризм, что является значимым диагностическим признаком развития посттрансплантационных осложнений, и способствует своевременному проведению корректирующих мер.
