CC BY
18
УДК 616.831: 616.153.455.04
содержание гидроперекисей в липидлх митохондрий мозгл и их лнтиоксидлнтныЕ свойства при гипогликемическом судорожном синдроме и после его купирования
А. В. ИВАНОВА
Смоленская государственная медицинская академия
Хемилюминисцентным методом исследовано содержание гидроперекисей, общая антиокси-дантная активность и концентрация малонового диальдегида (ТБК-тест) в митохондриях мозга при инсулиновом шоке и в различные сроки после его купирования глюкозой либо введением глюта-мата натрия в сочетании с вдыханием гиперкап-нической воздушной газовой смеси. Установлено, что под влиянием высоких доз инсулина, как на высоте судорожного состояния так и, особенно, в восстановительном периоде, после обоих способов его купирования на фоне сохранения анти-оксидантных возможностей в митохондриальных мембранах интенсифицируются перекисные процессы, которые могут быть причиной изменения их энергопреобразующей функции.
Проблема поражения головного мозга при тяжелых гипогликемических состояниях остается актуальной, несмотря на огромное количество исследований. Падение энергетического потенциала ткани вследствие снижения поступления глюкозы, основного энергетического субстрата мозга, рассматривается исследователями как важный, но не основной фактор проявления гипогликемической комы и развития судорожного состояния.
Предыдущими нашими исследованиями [2] было показано, что дыхательные цепи митохондрий вовлекаются в общую ответную реакцию нервной ткани на гипогликемический шок, повышая свою дыхательную активность, что, возможно, носит адаптивный характер. Однако, спустя даже сутки после купирования шока, как введением глюкозы, так и введением глютамата натрия, дыхание митохондрий мозга оставалось существенно измененным. Ряд параметров, характеризующих потребление ими кислорода в тех или иных метаболических состояниях, позволяет говорить о возможных неблагоприятных изменениях в митохондриальных мембранах. В этой связи нами было предпринято исследование по оценке состояния липоперокси-дации в этих органеллах в тех же условиях эксперимента: при инсулиновом шоке (на высоте судорожного состояния), спустя 1 час, либо 1 сутки, после купирования шока введением глюкозы, либо
введением глютамата натрия с вдыханием воздуха в смеси с 6% СО2.
Материалы и методы. Инсулиновый шок вызывался, как и ранее, введением инсулина в дозе 40 ед/ кг массы тела предварительно голодавшим в течение 14 часов животным (белые крысы массой 150 -220 г). Купирование судорожного состояния осуществлялось подкожным введением глюкозы (2 г/кг массы тела) либо глютамата натрия (0,5 г/кг массы тела) в сочетании с последующим вдыханием воздуха с добавлением 6% СО2. Животные, забой которых осуществлялся через сутки после выведения из шокового состояния, имели свободный доступ к пище.
Митохондрии выделялись дифференциальным центрифугированием из гомогената ткани головного мозга (за исключением мозжечка) в среде, содержащей 0,25 моль/л сахарозы, 0,01 моль/л трис-НС1. Состояние липопероксидации в митохондриях оценивали по концентрации в них гидроперекисей (ГПЛ), их общей антиоксидантной активности (АОА) и уровню малонового диальдегида (МДА). Содержание ГПЛ в митохондриальных мембранах определяли на хемилюминометре по интенсивности быстрой вспышки, инициированной Fe2+ в присутствии активатора хемилюминисценции родамина Ж [1]. АОА определяли как относительное снижение интенсивности Fe2+ активированной хе-милюминисценции после добавления взвеси митохондрий к стандартной суспензии желточных липо-протеидов [3]. Содержание МДА определяли спек-трофотометрически по реакции суспензии митохон-дриальных мембран с тиобарбитуровой кислотой [4]. Содержание белка в суспензии митохондрий определяли по методу Лоури.
Результаты исследования. Данные по хемилю-минисценции суспензии митохондриальных мембран показали, что к моменту развития шокового состояния концентрация гидроперекисей в них по сравнению с контролем несколько увеличивалась (табл. 1).
Таблица 1. Содержание ГПЛ и АОА митохондриальных мембран (относительные единицы)
18
Вестник Смоленской медицинской академии М2-3, 2009
Контроль п=8 Инсулиновый шок п=7 Купирование глюкозой п=8 Купирование глютаматом + СО2 п=8 Купирование глюкозой (через сутки) п=8 Купирование глюта-матом + СО2 (через сутки) п=8
ГПЛ 37,4+/-6,54 43,2+/-6,91 51,8+/-3,51 99,8+/-9,73*#Л 66,6+/-9,12*# 64,4+/-7,41*•
АОА 38,1+/-7,23 31,9+/-7,44 40,8+/-8,11 19,7+/-7,52Л 39,2+/-5,65 41,8+/-5,43•
* - достоверное отличие по сравнению с контролем Р<0,05
# - достоверное отличие по сравнению с инсулиновым шоком Р<0,05
л - достоверное отличие по сравнению с купированием глюкозой Р<0,05
• - достоверное отличие по сравнению с купированием глютаматом Р<0,05
Несмотря на устранение судорожного состояния и выход из шока при обоих способах его купирования, уровень ГПЛ в митохондриях возрастал еще более значительно, особенно при купировании шока введением глютамата в сочетании с СО2.
В течение суток после купирования шока глюкозой подверженность митохондриальных мембран липопероксидации продолжала нарастать и содержание гидроперекисей в них достигало уровня, почти вдвое превышающего контрольное значение. При купировании шока введением глютамата в сочетании с СО2 спустя сутки уровень ГПЛ в мембранах оказался пониженным относительно предыдущего показателя, но также почти вдвое превышающим контрольное значение.
Примечательно, что накопление ГПЛ в мембранах митохондрий в условиях опытов проявлялось на фоне, по существу, неизмененной антиоксидант-ной активности, которую проявляли эти органеллы.
Через сутки после купирования судорожного состояния глюкозой содержание МДА в митохондриях оставалось неизмененным, тогда как после купирующего эффекта глютаматом в сочетании с СО2, спустя также сутки, уровень МДА оказался даже ниже контрольных значений.
Таким образом, полученные данные показывают, что под влиянием высоких доз инсулина, приводящих к шоку и развитию судорожного состояния, несмотря на купирующее действие примененных
Исключением явилась лишь серия эксперимента спустя 1 час после купирования шока глютаматом в сочетании СО2, при котором было отмечено снижение АОА почти в 2 раза. Данный опыт не получил статистического подтверждения, однако, возможно, именно с ним связан наиболее высокий прирост концентрации ГПЛ в этой серии эксперимента. Спустя же сутки при таком способе купирования шока АОА митохондрий достигала контрольных значений.
Исследование уровня МДА (табл. 2) показало, что развитие судорожного состояния у животных приводит к некоторому увеличению уровня этого метаболита в митохондриях, но не достигающего грани достоверности. Через час после купирования шока как глюкозой, так и глютаматом уровень МДА возвращался к норме.
Таблица. 2. Содержание МДА в митохондриальных мембранах (нмоль/мг белка)
веществ, в митохондриальных мембранах интенсифицируются перекисные процессы. Тем не менее антиоксидантные возможности этих органелл, как это следует из приведенных данных, в указанные временные сроки остаются неисчерпанными, что, однако, не исключает возможных структурных изменений в митохондриальных мембранах. Это, по-видимому, и является причиной тех изменений в фосфорилирующей активности дыхательных цепей митохондрий, о которых сообщалось ранее [3].
Контроль Инсулиновый шок Купирование глюкозой Купирование глютаматом + СО2 Купирование глюкозой (через сутки) Купирование глютаматом + СО2 (через сутки)
МДА 1,9+/-0,386 2,5+/-0,35 1,6+/-0,16# 1,6+/-0,19# 1,5 +/- 0,16# 0,9+/-0,09*#
• - достоверное отличие по сравнению с купированием глютаматом Р<0,05
# - достоверное отличие по сравнению с инсулиновым шоком Р<0,05
ЛИТЕРАТУРА
1. Владимиров Ю. А., Арчаков А. И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. - М.: Наука, 1972. - 252 с.
2. Иванова А. В., Стунжас Н. М. Влияние тяжелой гипогликемии на функцию митохондрий мозга крыс // Вестник Смоленской медицинской академии, 2008. - № 3. - С. 39-42.
3. Лопухин Ю. М., Владимиров Ю. А. Регистрация хемилюминисценции составных частей сыворотки крови в присутствии двухвалентного железа // Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 1983. - Т. 95. - С. 61-63.
4. Медицинские лабораторные технологии и диагностика. Справочник / Под ред. А. И. Карпищенко. -СПб: Интермедика, 1999. - 780 с.
УДК 616.273.015.3.08
возможность экстренной профилактики острой гипоксии некоторыми производными лминотиолов
Д. В. сосин
Смоленская государственная медицинская академия
В экстремальных ситуациях содержание кислорода в доступном для дыхания воздухе может уменьшаться с различной скоростью. Быстрое нарастание кислородного дефицита требует проведения неотложных мероприятий по защите людей. Как правило, в этих случаях либо осуществляется эвакуация пострадавших, либо за-действуются специальные технические устройства. При постепенном нарастании гипоксии в комплексе защитных мероприятий важное место отводится фармакотерапии, т. е. использованию различных лекарственных веществ - антигипок-сантов, повышающих резистентность организма к недостатку кислорода. Выбор антигипоксанта, тактика его применения во многом зависят не только от вида формирующегося гипоксическо-го состояния, но и от скорости его нарастания. Однако протективное действие большинства антигипоксантов при быстро нарастающей гипоксии развивается относительно медленно и не всегда обеспечивает желаемый уровень защиты организма [1,8,13].
Перспективы для изыскания антигипоксических средств значительно расширились в связи с появлением новой группы химических веществ - комплексных соединений биометаллов с природными антиок-сидантами, синтез которых был осуществлен на базе НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ГУ Российского онкологического научного центра РАМН [12]. Многие металлсодержащие антиок-сиданты демонстрировали широкий спектр действия и высокую эффективность при разнообразных патологических состояниях, в том числе и при гипоксии. В частности, было установлено, что комплексное соединение на основе цинка и ^ацетил^-цистеина (вещество пФ1104), относящееся к производным
аминотиолов, значительно повышает вероятность успешного переживания животными различных видов острых экзогенных гипоксических состояний [4]. Отсутствие данных об эффективности антигипоксан-тов метаболического типа действия в случае их использования в качестве корректоров гипоксических состояний, развивающихся с разной скоростью, послужили основанием для выполнения экспериментальных исследований.
Материалы и методы исследования. В соответствии с целью и задачами исследования опыты выполнены на 50 мышах-самцах линии CBF1, массой 20-25 г.
Для изучения протективных эффектов при различной скорости нарастания гипоксии были отобраны следующие производные аминотиолов: бис ^-ацетил^-цистеинато) аквоцинк (II) дисемиги-драт цинка - вещество пФ901; бис ^-ацетил^-цистеинато) цинк (II) сульфат октагидрат - вещество п^1104; 3,5-диамино-1,2,4-тиадиазол - амтизол; 2-этилтиобензимидазол гидробромид - бемитил. Состояния острой экзогенной гипоксии с гиперкап-нией (ОГ+Гк) в опытах на мышах воспроизводили по методике, рекомендованной для проведения скрининга антигипоксантов [4]. Состояние острой экзогенной нормобарической гипоксии без гипер-капнии (ОГ-Гк) у мышей воспроизводили по авторскому способу [3]. Скорость нарастания гипоксии при (ОГ+Гк) и (ОГ-Гк) варьировали, размещая животных в герметичных емкостях различного объема. «Быструю» скорость нарастания получали при использовании емкости объемом в 0,25 л, «среднюю» -при использовании емкости в 0,5 л, «медленную» -при использовании емкости в 1,0 л. У всех животных измеряли ректальную температуру. В опытах регистрировали ЭКГ, пневмобарограмму, измеряли
