CC BY
43
УДК 616.831: 616.153.455.04
ВЛИЯНИЕ ТЯЖЕЛОЙ ГИПОГЛИКЕМИИ НА ФУНКЦИЮ МИТОХОНДРИЙ МОЗГА КРЫС
А. В. Иванова, Н. М. Стунжас
Смоленская государственная медицинская академия
Полярографическим методом изучены дыхательные характеристики митохондрий мозга животных при инсулиновом шоке и в различные сроки его купирования глюкозой либо введением глютамата натрия в сочетании с вдыханием гиперкапнической воздушной газовой смеси. Установлено, что даже спустя сутки после обоих способов купирования судорожного состояния дыхание митохондрий не нормализуется, возможно, вследствие неблагоприятных изменений в их мембранных структурах.
Гипогликемия - широко распространенное патологическое состояние, крайним проявлением которого является гипогликемическая кома. Тяжелые гипогликемические состояния, сопровождающиеся нарушением функций головного мозга, является частым осложнением терапии сахарного диабета, наблюдается при некоторых заболеваниях печени, почек и в конечном итоге могут приводить к развитию нейропатии [3].
Тяжелая гипогликемия ухудшает энергетический статус мозга, не смотря на нормальное снабжение мозга кислородом. Падение энергетического потенциала ткани вследствие снижения поступления глюкозы, основного энергетического субстрата мозга, рассматривается исследователями как важный, но не основной фактор проявления гипогликемической комы и развития судорожного состояния. Хорошо известно, что неврологическая симптоматика при гипогликемии, в отличие от ишемическо-гипоксийных воздействий, возникает при степенях ее еще существенно не затрагивающих энергетическое состояние мозга. Более того, среди исследователей нет единого мнения по поводу того, как изменяется энергопреобразующая функция митохондрий в условиях гипогликемической комы. Одни полагают, что она вообще остается резистентной [5], другие же считают, что основные функциональные нарушения происходят уже после купирования комы глюкозой, предположительно вследствие активации перекисных процессов[6].
В данном исследовании были изучены респираторные характеристики митохондрий мозга при инсулиновом шоке, после классического его купирования введением глюкозы, либо введением глютамата натрия в сочетании с вдыханием
гиперкапнической газовой смеси. Купирующий эффект глютамата и углекислого газа проявляется в полном устранении судорожного состояния, но без нормализующего влияния на уровень глюкозы в крови. Эффективность данного способа выведения из гипогликемического шока доказана экспериментально [2] и апробирована в условиях клиники [1]. Метаболические механизмы этого эффекта совершенно не исследованы.
Материалы и методы. Исследования проведены на 48 беспородных крысах обоего пола массой 150 - 220 грамм. Все экспериментальные животные содержались в обычных условиях вивария. Животные были раз делены на 6 групп: 1 группа - интактные животные (контроль); 2 группа животные, находящиеся в инсулиновом шоке с выраженным судорожным состоянием (доза инсулина 40 ед/кг массы тела, после 14 часового голодания); 3 группа - животные через 1 час после купирования шока подкожным введением глюкозы в дозе 2 г/кг массы тела, либо спустя сутки (4 группа); 5 группа - животные спустя 1 час после купирования шока глютаматом натрия (0,5 г/кг массы тела) в сочетании с вдыханием гиперкапнической газовой смеси (21% О2, 72% N2, 7% СО2), либо спустя сутки после такого купирующего эффекта (6 группа животных). Выведенные из шокового состояния животные 4 и 6 групп в течение суток находились на обычном рационе питания.
Забой всех животных проводился путем одномоментной декапитации с параллельным определением уровня глюкозы в крови. Было отмечено, что к моменту развития судорожного состояния уровень глюкозы в крови крыс составлял менее 1 ммоль/л. При купировании шока введением глю-
40
Вестник Смоленской Медицинской Академии № 3, 2008
Таблица 1. Изменение исходной скорости дыхания митохондрий (V)
ч, Субстрат-глютамат Субстрат-сукцинат
Мср +/- т Мср +/- т
Контроль(п=8) 11,9 0,86 26,5 2,4
Инсулиновый шок(п=8) 14,6 1,42 30,5 2,23
Купирование глюкозой (п=8) 13,0 1,2 34,2 4,03
Купирование глюкозой (через сутки)(п=8) 9,3 1,07 31,6 5,67
Купирование глютаматом + СО2(п=8) 10,5 1,18 23,1 3,0
Купирование глютаматом + СО2 (через сутки)(п=8) 13,9 1,93 36,4 2,4
козы ее уровень в крови при забое животных не отличался от нормы в отличие от купирующего эффекта глютамата и углекислого газа, при котором уровень глюкозы так и оставался ниже 1 ммоль/л.
Экспериментальная часть работы была выполнена по стандартной методике [4]. Митохондрии выделялись дифференциальным центрифугированием из гомогената ткани головного мозга (за исключением мозжечка). Среда выделения содержала 0,25 моль/л сахарозы, 0,01 моль/л трис-НС1, 0,1 ммоль/л ЭДТА. Дыхание митохондрий регистрировалось полярографически с помощью закрытого электрода Кларка в среде, содержавшей 178 ммоль сахарозы, 0,4 ммоль ЭДТА,
5 ммоль КН2РО4 0,01 моль трис-НС1 и 20 ммоль КС1) (рН 7,4). Субстратами дыхания служили сук-цинат и глютамат.
Были изучены следующие респираторные характеристики: исходное дыхание митохондрий (У0), скорость дыхания стимулируемая АДФ (У3), скорость дыхания после исчерпания введенного АДФ (У4), скорость дыхания под разобщающим действием ионофора - динитрофенола (^нф). Рассчитывались такие параметры как скорость фосфорилирования добавки АДФ/Щ, дыхательные контроли по Ларди и Чансу (ДКл и ДКч), и сте-
пень сопряжения дыхания и фосфорилирования Р/О. Статистическая обработка результатов исследований проводилась с использованием пакета программ специализированных программ.
Результаты исследования. Было установлено, что исходная скорость дыхания изолированных митохондрий мозга (У0) достоверно не изменялась ни в одной из серий опытов (табл. 1).
Изменение таких параметров как скорость дыхания при стимуляции АДФ (У3) и скорость фосфорилирования (АДФ/Д^ носили однотипный характер на протяжение всех серий экспериментов. Эти параметры существенно возрастали как при глюта-мат- так и при сукцинат зависимом дыхании митохондрий мозга животных, находящихся в состоянии гипогликемической комы, и оставались столь же высокими у животных забитых спустя 1 час после купирования шока глюкозой. Купирование же шокового состояния глютаматом в сочетании с углекислым газом, в отличие от купирования глюкозой, приводило указанные параметры дыхания к контрольному уровню. Однако, спустя сутки после такого способа купирования гипогликемического шока скорость дыхания митохондрий мозга под влиянием АДФ и скорость фосфорилирования вновь оказывались на уровне, близком к шоковому состоянию (табл. 2)
Таблица 2. Изменение скорости дыхания митохондрий V и скорости фосфорилирования АДФД
Субстрат- Субстрат-
глютамат глютамат
У3 Мср +/- т Мср +/- т
Контроль 39,4 3,74 66,7 6,63
Инсулиновый шок 58,1* 4,6 85,3* 6,93
Купирование глюкозой 53,1* 4,93 91,4* 11,0
Купирование глюкозой (через сутки) 50,7* 2,56 78,6 9,11
Купирование глютаматом + СО2 36,5 3,27 56,8 9,31
Купирование глютаматом + СО, (через сутки) 60,5* 4,59 97,9* 5,27
АДФ/Д1 Контроль 111,4 10,93 126,4 13,32
Инсулиновый шок 173,7* 16,14 161,3* 9,79
Купирование глюкозой 149,2 15,55 188,8* 26,43
Купирование глюкозой (через сутки) 138,4 9,71 140,1 16,83
Купирование глютаматом + СО, 100,0 9,68 101,5 17,74
Купирование глютаматом + СО2 (через сутки) 168,3* 14,27 169,4* 7,56
* - достоверное отличие от контроля Р<0,05
Таблица 3. Изменение скорости дыхания митохондрий V
Субстрат-глютамат Субстрат-сукцинат
Мср +/- т Мср +/- т
Контроль 31,5 3,48 68,9 5,16
V Инсулиновый шок 35,5 2,46 70,9 4,8
Купирование глюкозой 34,2 2,72 71,8 5,14
Купирование глюкозой (через сутки) 39,7 5,23 85,6 6,71
Купирование глютаматом + СО2 24,9 2,29 49,6* 5,2
Купирование глютаматом + СО2 (через сутки) 51,7* 3,00 88,5* 6,47
* - достоверное отличие от контроля Р<0,05
Таблица 4: Изменение сопряжения окисления и фосфорилирования Р/О
Субстрат-глютамат Субстрат-сукцинат
Мср +/- т Мср +/- т
Контроль 2,9 0,099 1,8 0,11
Р/О Инсулиновый шок 3,0 0,074 1,9 0,05
Купирование глюкозой 2,8 0,053 2,0 0,07
Купирование глюкозой (через сутки) 2,7 0,06 1,8 0,05
Купирование глютаматом + СО2 2,8 0,07 1,8 0,1
Купирование глютаматом + СО2 (через сутки) 2,6* 0,035 1,7 0,06
- достоверное отличие от контроля Р<0,05
Через сутки после купировании шока отмечено также повышение чувствительности митохондрий к разобщающему действию динитрофенола. Однако, если при купировании судорожного состояния глюкозой это проявлялось в виде выраженной тенденции, особенно при сукцинат зависимом дыхании, то при купировании глютаматом в сочетании с СО2 эти изменения носили при применении обоих субстратов дыхания достоверный характер (табл. 3).
Спустя сутки после купирования шокового состояния выявлено и некоторое снижение энерго-
эффективности работы дыхательных цепей митохондрий, особенно при глютамат зависимом дыхании, о чем говорит падение коэффициента Р/О (табл. 4).
Кроме того, в эти временные параметры эксперимента глютамат - зависимое дыхание митохондрий характеризовалось, как оказалось,значительным превалированием дыхательного контроля по Ларди над показателем контроля по Чансу, что указывает на высокую скорость гидролиза, образующегося АТФ и снижение спустя сутки сродства дыхательных цепей к данному макроэргу (табл. 5).
Таблица 5: Изменение дыхательного контроля по Ларди и дыхательного контроля по Чансу
*
Субстрат-глютамат Субстрат-сукцинат
Мср +/- т Мср +/- т
Контроль 3,4 0,65 2,6 0,18
Инсулиновый шок 4,3 0,55 2,8 0,23
ДКл Купирование глюкозой 4,8 0,84 2,7 0,17
Купирование глюкозой (через сутки) 5,8# 0,49 2,9 0,36
Купирование глютаматом + СО2 3,6 0,18 2,5 0,2
Купирование глютаматом + СО2 (через сутки) 5,2 0,86 2,8 0,25
Контроль 3,2 0,39 2,5 0,22
ДКч Инсулиновый шок 4,1 0,39 4,1 0,76
Купирование глюкозой 4,5 0,65 3,4 0,36
Купирование глюкозой (через сутки) 3,7 0,37 3,3* 0,29
Купирование глютаматом + СО2 3,9 0,36 3,1 0,34
Купирование глютаматом + СО2 (через сутки) 3,5 0,38 3,2 0,29
# - достоверное ДКл от ДКч Р<0,05, * - достоверное отличие от контроля Р<0,05
42
Вестник Смоленской Медицинской Академии № 3, 200В
Таким образом, результаты проведенных экспериментов показывают, что дыхательные цепи митохондрий вовлекаются в общую ответную реакцию нервной ткани на гипоглике-мический шок, повышая свою дыхательную активность, что, возможно, носит адаптивный характер. Эффект купирования шока глютаматом и углекислым газом, в отличие от купирова-
ния глюкозой как бы нивелирует эти изменения в работе дыхательных цепей митохондрий. Однако, спустя даже сутки после обоих способов купирования шока, дыхание митохондрий остается существенно измененным, и ряд параметров, характеризующих их дыхание, позволяют говорить о возможных неблагоприятных изменениях в митохондриальных мембранах.
ЛИТЕРАТУРА
1. Вангейм К. А., Двалидзе Ю. Ф., Пиленкова Г. А., Удинцев Н. А.
2. О влияние глютаминовой кислоты на судороги, осложняющие инсулиновую гипогликемию //Сов. Мед-на - 1962. - №11. - С. 89-94
3. Козлов Н. Б. Обмен аммиака и его роль в развитии некоторых патологических состояний: Автореф. дис. ... докт. мед. наук. - Минск, 1962. - 24 с.
4. Телушкин П. К. активность окислительных ферментов, содержание субстратов цикла Кребса, свободного и пептидносвязанного глютамата в мозге при гипогликемическом нервном синдроме.: Автореф. дисс... канд. мед. наук. - Ярославль, 1987. - 26 с.
5. Шаров А. Н. Состояние энергетического обмена в тканях головного мозга при воздействие на организм высокой внешней температуры и введения в этих условиях ионола и углекислого газа: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. - Смоленск, 1984. - 28 с.
6. Agardh C.-D, Chapman A. G., Pelligrino D., $^аоит1 B. K. Influence of severe hypoglycemia on mitochondrial and plasma membrane function in rat brain.// Journal of Neurochemistry. - 1982. - 38:3, P. 662-668
7. Sang W.S., Elizabeth T. G., Aaron M. , Pak H. C., and Raymond A. S. Hypoglycemic neuronal death is triggered by glucose reperfusion and activation of neuronal NADPH oxidase // J. Clin. Invest. - 2007.- 117: P. 910-918
