CC BY
27
19. Liu G. W., Gong P. S., Zhao H. G. et al. // Radiat. Res. - 2006. - I. 165. - P. 379-389.
20. Sun Z. M. et al. // Zhonghua Yi Xue Za Zhi: study of 151 cases. - 2007. - Vol. 87. - P. 1263-1265.
21. Williams A. C., Ford W. C. // Fertil. Steril. - 2005. - Vol. 83, №4. - P. 929-932.
22. Yukawa O., Nakajima T., Yukawa M. et al. // Int. J. Radiat. Biol. - 1999. - Vol. 75. - P. 1189-1199.
удк 616.831:616.153.455.04
липопероксидное состояние мембран митохондрий
головного мозга крыс при гипогликемическом судорожном синдроме
А. В. Иванова
Смоленская государственная медицинская академия
Исследовалось содержание первичных продуктов ПОЛ - гидроперекисей липидов, конечных продуктов ПОЛ - малонового диальдегида (ТБК-тест), оценивалось состояние антиоксидантной системы по общей антиоксидантной емкости и изменению концентрации восстановленного глютатиона в митохондриях мозга при инсулиновом шоке и в различные сроки после его купирования глюкозой либо введением глютамата натрия в сочетании с вдыханием гиперкапнической воздушной газовой смеси. Установлено, что под влиянием высоких доз инсулина, как на высоте судорожного состояния так и, особенно, в восстановительном периоде, после обоих способов его купирования на фоне сохранения антиоксидантных возможностей в ми-тохондриальных мембранах интенсифицируются перекисные процессы.
Ключевые слова: гипогликемия, перекисное окисление липидов, головной мозг, митохондрии.
lipoperoxide state of rat brain mitochondria membranes at hypoglycemic convulsive syndrome
A. V. Ivanova
Smolensk State Medical Academy
We examined content ofprimary and terminal products of lipid peroxidation, estimated antioxidant system state (as antioxidant capacity and reduced glutathione level) at rat brain mitochondria during hypoglycemic shock and after different ways of its arresting. It was found that high insulin doses lead to intensification of mitochondria membranes lipid peroxidation, nether the less, antioxidant resources of these organelles were not exhausted at experimental conditions.
Key words: hypoglycemia, lipid peroxidation, brain, mitochondria.
Проблема поражения головного мозга при тяжелых гипогликемических состояниях остается актуальной, несмотря на огромное количество исследований. Падение энергетического потенциала ткани вследствие снижения поступления глюкозы, основного энергетического субстрата мозга, рассматривается исследователями как важный, но не основной фактор проявления гипогликемической комы и развития судорожного состояния. Как известно, гипогликемия приводит к нарушению ионного гомеоста-за клетки. Нарушение ионного гомеостаза, в свою очередь, ведет не только к деполяризации мембран нейронов, но и к активации свободнорадикальных окислительных процессов (СРО), следствием чего является развитие метаболического окислительного
стресса [2]. Активация процессов СРО в клетке является результатом усилением синтеза АФК. Синтез АФК осуществляется в основном митохондриальны-ми электронтранспортными цепями. Однако митохондрии являются не только главным инициатором оксидативного стресса, но и мишенью этого патологического процесса [4]. Ряд исследователей отмечают интенсификацию ПОЛ в мембранах митохондрий после гипогликемии и считают, что повреждение митохондриальных мембран при увеличении продукции АФК является начальным этапом развития гипогликемической нейропатии [5]. С другой стороны, усиление процессов ПОЛ в мембранах митохондрий может быть результатом снижения активности антиоксидантной системы [6]. Однако в этом плане
24
Вестник Смоленской медицинской академии • № 3 • 2010
в литературе имеется мало экспериментальных данных, и к тому же довольно противоречивых. В связи с этим нами было предпринято исследование по оценке состояния липопероксидации в митохондри-альных мембранах ткани мозга при инсулиновом шоке (на высоте судорожного состояния), спустя час, либо сутки, после купирования шока введением глюкозы, либо введением глютамата натрия с вдыханием гиперкапнической газовой смеси.
Цель работы - провести исследование изменения содержания первичных продуктов перекисного окисления - гидроперекисей липидов (ГПЛ), терминальных продуктов - малонового диальдегида (МДА), оценить состояние антиоксидантной системы по изменению общей антиоксидантной емкости (АОЕ) и концентрации восстановленного глютатиона (GSH).
Материалы и методы. Инсулиновый шок вызывался, как и ранее, введением инсулина в дозе 40 ед/ кг массы тела предварительно голодавшим в течение 14 часов животным (белые крысы массой 150-220 г). Купирование судорожного состояния осуществлялось подкожным введением глюкозы (2 г/кг массы тела) либо глютамата натрия (0,5 г/кг массы тела) в сочетании с последующим вдыханием воздуха с до-
Несмотря на устранение судорожного состояния и выход из шока при обоих способах его купирования, уровень ГПЛ в митохондриях возрастал еще более значительно, особенно при купировании шока введением глютамата в сочетании с СО2.
В течение суток после купирования шока глюкозой подверженность митохондриальных мембран ли-попероксидации продолжала нарастать и содержание гидроперекисей в них достигало уровня, почти вдвое превышающего контрольное значение. При купировании же шока введением глютамата в сочетании с СО2 спустя сутки уровень ГПЛ в мембранах оказался пониженным относительно предыдущего показателя, но также почти вдвое превышающим контрольное значение.
бавлением 7% СО2. Животные, забой которых осуществлялся через сутки после выведения из шокового состояния, имели свободный доступ к пище.
Митохондрии выделялись дифференциальным центрифугированием из гомогената ткани головного мозга (за исключением мозжечка) по стандартной методике. Состояние липопероксидации митохондри-альных мембран оценивали по концентрации в них ГПЛ, их общей АОЕ, уровню МДА и восстановленного GSH. Содержание ГПЛ и АОЕ в митохондри-альных мембранах определяли по изменению интенсивности Fe2+ активированной хемилюминисценции относительно стандартной системы [1]. Содержание МДА определяли спектрофотометрически по реакции суспензии митохондриальных мембран с тио-барбитуровой кислотой [3]. Для оценки изменения концентрации восстановленного глютатиона использовали метод Эллмана [3]. Содержание белка в суспензии митохондрий определяли по методу Лоури.
Результаты исследования. Данные по хемилюми-нисценции суспензии митохондриальных мембран показали, что к моменту развития шокового состояния концентрация гидроперекисей в них по сравнению с контролем несколько увеличивалась (табл. 1).
Примечательно, что накопление ГПЛ в мембранах митохондрий в условиях опытов проявлялось на фоне, по существу, неизмененной антиоксидант-ной активности, которую проявляли эти органеллы. Исключением явилась лишь серия эксперимента спустя 1 час после купирования шока глютаматом в сочетании с СО2, при котором было отмечено снижение АОА почти в 2 раза.
Исследование уровня МДА (табл. 2) показало, что развитие судорожного состояния у животных приводит к некоторому увеличению уровня этого метаболита в митохондриях, но не достигающего грани достоверности. Через час после купирования шока как глюкозой, так и глютаматом уровень МДА возвращался к норме.
Таблица 1. Содержание ГПЛ и АОА митохондриальных мембран (отн. ед.)
Контроль, п=8 Инсулиновый шок, п=7 Купирование глюкозой, п=8 Купирование глю-таматом + СО2, п=8 Купирование глюкозой (1-е сутки), п=8 Купирование глю-таматом + СО2 (1-е сутки), п=8
ГПЛ 37,4±6,5 43,2±6,91 51,8±3,51 99,8±9,73 Р4-1<0,05 Р4-2<0,05 66,6±9,12 Р5-1<0,05 Р5-2<0,05 64,3±7,41 Р6-1<0,05 Р6-4<0,05
АОЕ 38,1±7,2 30,86 39,0 19,75 38,89 41,78
Таблица 2. Содержание МДА в митохондриальных мембранах (нмоль/мг белка)
Контроль Инсулино-вый шок Купирование глюкозой Купирование глютаматом + СО2 Купирование глюкозой (1-е сутки) Купирование глютаматом+СО2 (1-е сутки)
1,6±0,16 1,6±0,19 1,5±0,16 0,9±0,09
МДА 1,9±0,386 2,5±0,35 Р3-2<0,05 Р4-2<0,05 Р5-2<0,05 Р6-2<0,05
Р6-4<0,05
Через сутки после купирования судорожного состояния глюкозой содержание МДА в митохондриях оставалось неизмененным, тогда как после купирующего эффекта глютаматом в сочетании с СО2, спустя также сутки, уровень МДА оказался даже ниже контрольных значений.
Исследование содержания восстановленного глютатиона в митохондриальной фракции головного мозга проводилось в тех сериях, где был выявлен наибольший прирост ГПЛ, а именно через сутки после купирования либо глюкозой, либо глютаматом. Достоверных различий в концентрации глютатиона в исследованных экспериментальных сериях выявлено не было (табл. 3).
Таблица 3. Изменение содержания восстановленного глютатиона в митохондриальной фракции головного мозга
Контроль Купирование глюкозой (1-е сутки) Купирование глю-таматом+СО2 (1-е сутки)
GSH 15,5 14,73 15,7
Таким образом, полученные данные показывают, что под влиянием высоких доз инсулина, приводящих к шоку и развитию судорожного состояния, несмотря на купирующее действие примененных веществ, в митохондриальных мембранах интенсифицируются процессы ПОЛ, о чем свидетельствует увеличение содержания предобразованных ГПЛ. Однако анти-оксидантные возможности этих органелл (восста-
новленный GSH, АОЕ), как это следует из приведенных данных, в указанные временные сроки остаются неисчерпанными, что позволяет им терминировать ПОЛ на уровне первичных продуктов, о чем косвенно свидетельствует тот факт, что концентрация конечных продуктов ПОЛ (МДА) в экспериментальных условиях не отличается от контрольных значений.
литература
1. Лопухин Ю. М., Владимиров Ю. А. Регистрация хемилюминисценции составных частей сыворотки крови в присутствии двухвалентного железа // Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 1983. - Т. 95. -С. 61-63.
2. Телушкин П. К., Потапов П. П. Взаимодействие активных форм кислорода и азота в развитии патологии у человека // Новости медицины и фармакологии Яринвест медикал. - 1997, №2. - С. 33-35.
3. Медицинские лабораторные технологии и диагностика / Под ред. А. И. Карпищенко. - СПб: Интермедика, 1999 - с. 100.
4. Ballesteros J. R., Mishra O. P., McGowan J. E., Alterations in Cerebral Mitochondria during Acute Hypoglycemia - 2003. - Biol. Neonate, 84, 159-163.
5. Hino K., Nishikawa M., Sato E., Inoue M. L-carnitine inhibits hypoglycemia-induced brain damage in the rat. // Brain Res. - 2005. - 1053 (1-2). - Р. 77-87.
6. Patocková J., Marhol P., Túmová E., Krsiak M., Rokyta R., Stípek S., Crkovská J., Andel M. Oxidative stress in the brain tissue of laboratory mice with acute post insulin hypoglycemia. // Physiol Res. - 2003. - 52 (1). -Р. 131-5.
