CC BY
27
2005 ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА. Сер. 3. Вып. 4
ФИЗИОЛОГИЯ, БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА
УДК 594.382+612.821+812.822.3
П. К. Телушкин, А. Д. Ноздрачев, П. П. Потапов
ИЗМЕНЕНИЯ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО ОБМЕНА И ПОВРЕЖДЕНИЕ НЕРВНЫХ КЛЕТОК У КРЫС ПРИ МНОГОКРАТНОМ ВВЕДЕНИИ ВЫСОКИХ ДОЗ ИНСУЛИНА
Гипогликемия в результате гиперинсулинемии является частым осложнением терапии сахарного диабета и наблюдается при инсуломе поджелудочной железы. В конечном итоге она приводит к развитию постгипогликемической энцефалопатии [4, 13, 14]. Существенными элементами патогенеза постгипогликемической энцефалопатии могут быть нарушения энергетического метаболизма и изменения интенсивности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), вызывающие повреждение клеточных мембран и гибель клеток.
В настоящей работе проведено исследование активности ферментов основных путей использования глюкозы и катаболизма адениловых нуклеотидов, а также интенсивности цитолиза и показателей ПОЛ в мозгу крыс, неоднократно перенесших тяжелую инсулино-вую гипогликемию.
Материал и методы исследования. Опыты выполнены на белых беспородных крысах обоего пола массой 180-220 г. Все животные содержались на обычном рационе и перед опытом были лишены пищи в течение 18-24 ч. Воду получали без ограничения. Гипогликемическую кому (содержание глюкозы в крови около 1 ммоль/л) вызывали внутримышечной инъекцией инсулина в дозе 40 ед. на 1 кг массы, купирование проводили введением коматозным животным 3 мл 40%-ного раствора глюкозы в желудок. Подопытные животные перенесли 5—7 гипогликемических ком с интервалом 2 дня. Исследовали ткани больших полушарий и ствола мозга интактных животных (контроль) и крыс, дека-питированных на 2-е сутки после 5-7-й гипогликемической комы.
Цитоплазматическую и митохондриальную фракции отделов мозга получали путем дифференциального центрифугирования [1]. Интенсивность гликолиза в цитоплазматической фракции определяли по скорости накопления лактата в инкубационной среде, используя в качестве субстратов глюкозу и глюкозо-6-фосфат [8]. Активности НАД-изоцитратдегидрогеназы (НАД-ИЦДГ, КФ 1.1.1.41), НАДФ-изоцитратдегидрогеназы (НАДФ-ИЦДГ, КФ 1.1.1.42), НАД-малатдегидрогеназы (НАД-МДГ, КФ 1.1.1.37), НАДФ-малатдегидрогеназы (НАДФ-МДГ, КФ 1.1.1.40), глутаматдегидрогеназы (ГДГ, КФ 1.4.1.3), лактатдегидрогеназы (ЛДГ, КФ 1.1.1.27), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ, КФ 1.1.1.49) и глутатионредуктазы (ГР, КФ 1.6.4.2) оценивали спектрофотометрически [5]. Скорость НАДН-дегидрогеназной реакции (НАДН-ДГ, КФ 1.6.99.3.) определяли с помощью дихлорфенолиндо-фенола [19]. Супероксиддисмутазную активность (СОД) оценивали по торможению восстановления нитросинего тетразолия [2].
При изучении общей АТФазной активности обработку ткани и процедуру определения проводили, как описано в работе [12]. 5-нуклеотидазную активность (КФ 3.1.3.5) исследовали, внося в инкубационную среду АМФ в количествах, эквимолярных АТФ. Аденозинмонофосфатдезаминазную (АМФ-Д, КФ 3.5.4.6) активность оценивали по накоплению аммиака. Среда инкубации включала в себя 0,05 М калий-фосфатный буфер, рН 7,6, 10 мМ АМФ, 5 мМ АТФ и 0,1-0,2 мг белка цитоплазматичес-
© П. К. Телушкин, А. Д. Ноздрачев, П. П. Потапов, 2005
кой или митохондриальной фракции. Пробы инкубировали в течение 30 мин при 37 °С. Реакцию останавливали охлаждением проб до 0°С, белки осаждали трихлоруксусной кислотой с последующим центрифугированием. К 0,05-0,2 мл супернатанта прибавляли 5 мл безаммиачной воды, 0,1 мл реактива Несслера и регистрировали изменение оптической плотности при 400 нм в течение 15 с [3].
Интенсивность цитолиза исследовали по накоплению ЛДГ в среде инкубации [16]. Срезы больших полушарий мозга толщиной 0,35-0,40 мм готовили по описанию, приведенному в работе [17] и помещали в среду Кребса-Рингера следующего состава (мМ): 132 NaCI, 5 KCl, 1,2 NaH2P04, 1,3 MgCl2, 1,2 СаС12, 10,0 глюкозы, pH 7,4. Прединкубацию срезов проводили при 37 °С в течение 2 ч, затем срезы переносили в среду того же состава с уменьшенной вдвое концентрацией NaCI и инкубировали в течение 2 ч. В дальнейшем вносили в гипотоническую среду Fe2"'" и аскорбат в конечных концентрациях соответственно 10~5 М и 2 : 10^ М и продолжали инкубацию еще в течение 2 ч. По окончании опыта срезы гомогенизировали и оценивали в них уровень малонового диальдегида (МДА) [7].
Количество белка определяли по Лоури. Результаты экспериментов обрабатывали статистически с применением критерия Стьюдента.
Результаты исследований и их обсуждение. У крыс, перенесших серию гипоглике-мических ком, не выявлено изменений активности НАД-зависимых дегидрогеназ в больших полушариях (табл. 1). Но при этом в них обнаружено уменьшение активности Г6ФДГ и ГР соответственно на 7 и 12%. В стволе мозга наблюдается увеличение активности НАД-ИЦДГ на 20% и уменьшение активности митохондриальных НАДФ-ИЦДГ и НАД-МДГ соответственно на 37 и 9%, а также снижение НАДН-ДГ-активности на 15%. СОД-активность уменьшается в больших полушариях и стволе мозга подопытных животных соответственно на 51 и 39% (см. табл. 1).
Таблица 1. Активность дегидрогеназ (нмоль - мин 1 • мг белка"') и СОД (ЕД- мг белка"1) в мозге крыс, перенесших серию гипогликемических ком (М+ш)
Показатель Отдел мозга Контроль Опыт
НАД-ИЦДГ митохондриальной фракции Большие полушария Ствол 47,8+1,6 33,7+1,9 53,6+4,0 40,5+1,8'
НАДФ-ИЦДГ митохондриальной фракции Большие полушария Ствол 16,6+0,8 14,3+1,8 16,5+1,0 9,0+0,5'
НАД-МДГ митохондриальной фракции Большие полушария Ствол 416+6 388+8 432+6 354+7'
НАДФ-МДГ митохондриальной фракции Большие полушария Ствол 33,6+2,0 37,5+1,6 31,8+1,6 34,7+1,7
ГДГ митохондриальной фракции Большие полушария Ствол 267+18 264+15 265+11 250+18
НАДН-ДГ митохондриальной фракции Большие полушария Ствол 83,3+1,8 54,1+2,1 84,4+3,1 46,0+1,2'
ЛДГ цитоплазматической фракции Большие полушария Ствол 294+8 265+14 283+15 272+9
Г6ФДГ цитоплазматической фракции Большие полушария Ствол 12,2+0,3 17,0+0,4 11,3+0,2' 17,2+0,5
ГР цитоплазматической фракции Большие полушария Ствол 11,0+0,2 13,1 ±0,7 9,7+0,3' 13,0+0,6
СОД цитоплазматической фракции Большие полушария Ствол 210+11 220+12 102+12" 135+23"
Примечание. Здесь и в табл. 2 и 3: количество опытов в каждой серии 5-6; звездочкой обозначены статистически достоверные по сравнению с контролем изменения -р < 0,05.
АТФазная активность, определяемая в митохондриальной фракции, не изменяется, а в цитоплазматической фракции, полученной из больших полушарий и ствола мозга, увеличивается соответственно на 16 и 31%. АМФ-Д-активность в исследованных отделах мозга увеличивается в цитоплазматической фракции на 30—46% и в митохондриальной фракции на 20-27%; активность 5'-нуклеотидазы не изменяется (табл. 2).
Таблица 2. АТФ-азна«?, 5'-нуклеотидазная и АМФ-дезаминазная активность (нмоль - мин 1 • мг белка"1) в мозге крыс, перенесших серию гипогликемических ком (М+ш)
Показатель Субклеточная фракция Отдел мозга Контроль Опыт
АТФазная активность ЦФ Большие полушария Ствол 839+39 1063+105 973+42' 1389+72'
МФ Большие полушария Ствол 2926+200 1968+137 2895+200 2284+63
5'-нуклеотидазная активность ЦФ Большие полушария Ствол 3895+284 6484+453 4084+295 6179+421
МФ Большие полушария Ствол 1105+116 1221±63 1010+63 1211+74
АМФ-дезаминазная активность ЦФ Большие полушария Ствол 30,2+1,4 28,5+1,1 39,4+2,2' 41,3+2,5'
МФ Большие полушария Ствол 32,5+1,6 29,3+1,2 39,6+1,9" 37,3+1,5'
Примечание. ЦФ - цитоплазматическая фракция, МФ - митохондриальная фракция.
Таблица 3. Скорость образования лактата при использовании в качестве субстрата глюкозы и глюкозо-6-фосфата (нмоль • мин"1- мг белка"1) в мозге крыс, перенесших серию гипогликемических ком (М+ш)
Субстрат Отдел мозга Контроль Опыт
Большие полушария 46,7±1,5 45,8±2,0
Глюкоза
Ствол 41,5+1,9 39,8±2,5
Глюкозо-6-фосфат Большие полушария Ствол 47,3±1,9 62,1 ±2,2 48,8±1,4 63,5+1,5
Накопление ЛДГ в процессе преинкубации срезов мозга подопытных и контрольных животных в изотонической среде было одинаковым. Обнаружено увеличение выхода ЛДГ в гипотоническую среду из срезов мозга крыс, перенесших серию гипогликемических ком по сравнению с интактными животными на 7%, р < 0,05 (контроль 74,4±1,1, опыт 79,8±1,7 мкмоль ■ мин-1 ■ мг белка"1). Еще большей (18 %, р < 0,05) оказалась разница в выходе ЛДГ из срезов мозга контрольных животных и крыс, неоднократно перенесших гипогликемию при добавлении в среду Ре2+ и аскорбата (контроль 44,1 ±2,3, опыт 52,1±3,5 мкмоль • мин-1 • мг белка-1). Уровень МДА в срезах мозга подопытных животных в конце инкубации оказался на 47% (р < 0,05) больше, чем у интактных животных: контроль 0,85±0,06, опыт 1,12+0,07 нмоль ■ мг белка"1.
Глюкоза является главным энергетическим субстратом в мозгу, основным путем ее использования является гликолиз, потокоформируюшим ферментом которого в нервной ткани
служит гексокиназа [6]. Изменений интенсивности гликолиза при использовании в качестве субстратов глюкозы и глюкозо-6-фосфата у крыс, неоднократно перенесших гипогликемию, не выявлено (табл. 3). Не обнаружено также изменений интенсивности гликолиза в состоянии собственно гипогликемической комы и в ранние сроки купирования однократной ги-погликемической комы [9]. Полученные результаты согласуются с представлениями о том, что основным фактором, лимитирующим потребление глюкозы головным мозгом, в целом является не столько активность ферментов гликолиза, сколько скорость поступления глюкозы из крови к нейронам при изменении уровня гликемии [6, 13, 14].
Гипогликемическая кома является энергодефицитным состоянием и сопровождается нарушением ионных градиентов [13, 14], восстановление которых требует работы АТФаз. Na+, К+-АТФаза плазматических мембран клеток мозга может потреблять до 40% всей АТФ, образуемой в нервной ткани и после фракционирования определяется преимущественно в цитоплазматической фракции [20], поэтому заманчиво предположить, что выявленные в настоящем эксперименте изменения АТФазной активности, обнаруживаемые в цитоплазматической фракции, связаны с Na+, К+-АТФазой.
Увеличение потребления АТФ неизбежно приводит к нарастанию уровня АМФ в мозгу, что может способствовать распаду АМФ в дальнейшем [13]. Катаболизм АМФ осуществляется двумя путями - дезаминированием АМФ и его дефосфорилированием. При этом дезаминирование АМФ в АМФ-дезаминазной реакции является одним из механизмов поддержания энергетического заряда клетки. Отсутствие измений активности 5'-нуклеоти-дазы и увеличение активности АМФ-Д (см. табл. 2) свидетельствует о том, что в описанных условиях опыта дальнейший распад АМФ осуществляется преимущественно путем его де-заминирования. Таким образом, обнаруженное в настоящем эксперименте увеличение активности АМФ-Д свидетельствует об увеличении катаболизма адениловых нуклеотидов в мозгу крыс, неоднократно перенесших гипогликемию. Последуещее окисление гипоксанти-на и ксантина в ксантиноксидазной реакции сопровождается продукцией супероксиданион-радикала, что может явиться одним из факторов, способствующих инициации процессов ПОЛ в мозгу крыс, перенесших серию гипогликемических ком. Кроме того, увеличение скорости катаболизма адениловых нуклеотидов происходит на фоне уменьшения активности Г6ФДГ (см. табл. 1), что может затруднять синтез адениловых нуклеотидов de novo.
НАД-ИЦДГ является одним из потокоформирующих ферментов цикла Кребса [6]. Увеличение ее активности, вероятно, отражает возросшие энергопотребности клеток мозга, обусловленные работой ионных насосов при гипогликемии и в восстановительном периоде. Уменьшение активности митохондриальной НАДФ-ИЦДГ (см. табл. 1) также может способствовать перераспределению потока изоцитрата по пути НАД-зависимого окисления. Активность НАД-ИЦДГ и Na+, К+-АТФазы увеличена, а НАДФ-ИЦДГ снижена также в состоянии гипогликемической комы и в ранние сроки восстановления; однако через 30 мин после введения глюкозы происходит нормализация активности ферментов [9, 12]. У животных, перенесших серию ком, подобные изменения активности этих ферментов наблюдаются на 2-е сутки после купирования последней комы. Таким образом, возникающие в ходе глубокой гипогликемии и раннего восстановительного периода изменения сохраняются продолжительное время у крыс, перенесших серию ком, возможно, представляя собой адаптацию обмена мозга к повторяющейся гипогликемии.
В срезах мозга подопытных животных не наблюдается значительных изменений устойчивости мембран клеток в средах с нормальным и пониженным осмотическим давлением. Последнее является косвенным свидетельством относительной сохранности процессов энергопродукции и достаточной работы ионных насосов в мозгу крыс, перенесших серию гипогликемических ком. Внесение в гипотоническую среду инкубации срезов Fe2+ и аскор-бата приводило к существенному увеличению интенсивности цитолиза и сопровождалось нарастанием уровня МДА. Выявленные изменения свидетельствуют о том, что существен-
ным повреждающим фактором в патогенезе постгипогликемической энцефалопатии является снижение способности клеток бороться с активными формами кислорода. О снижении уровня системы антиоксидантной зашиты в мозгу крыс, подвергнутых гиперинсулинизации, свидетельствуют также уменьшение активности супероксиддисмутазы, НАДФ-зависимых глюкозо-6-фосфат-, малат-, изоцитратдегидрогеназ и глутатионредуктазы (см. табл. 1). С одной стороны, эти ферменты обеспечивают работу системы антиоксидантной зашиты, с другой - уменьшение их активности считают результатом развития окислительного стресса [15].
НАДН-ДГ-комплекс также чувствителен к окислительному повреждению [18]. Уменьшение активности НАДН-ДГ обнаруживается в состоянии гипогликемической комы, активность фермента нормализуется через 30 мин после купирования однократной гипогликемии глюкозой [9] и оказывается сниженной на 2-е сутки после купирования последней комы из серии гипогликемических ком (см. табл. 1). Уменьшение НАДН-ДГ-активности, обнаруженное в настоящем эксперименте, может быть связано с окислением FeS-центров комплекса активными формами кислорода и азота [18], образующимися в нервной ткани при гипогликемии.
Необходимо отметить, что наиболее выраженные изменения активности ферментов сосредоточены в стволе мозга. При этом нарушения гликогенолиза и обмена медиаторных аминокислот при гиперинсулинизации также наблюдаются в стволе мозга [10, 11]. Нарушения обмена, возникающие при неоднократном воздействии гипогликемии на мозг, а именно уменьшение уровня ГАМК, интенсивности гликогенолиза и НАДН-дегидрогеназной активности, являются общими для ряда патологических состояний, в частности, их рассматривают как характерные для болезни Паркинсона [15, 18]. Подобное сходство патохимических проявлений свидетельствует об общем механизме, их индуцирующем. Таким механизмом может быть эксайтотоксичность глютамата и аспартата и связанная с ней активация процессов перекисного окисления [14, 18].
Комплекс патохимических изменений, возникающий при однократной гипогликемии, сравнительно быстро разрешается после купирования комы глюкозой [8, 12, 13, 14], но оказывается более выраженным и наблюдается более продолжительное время у крыс, перенесших серию тяжелых гипогликемических состояний. Существенным элементом патогенеза постгипогликемической энцефалопатии, таким образом, может быть фактор неоднократности воздействия гипогликемии на мозг, приводящий к нарушениям энергетического обмена и стимуляции процессов ПОЛ в нервной ткани.
Summary
Telushkin Р. К., Nozdratchev A. D., Potapov P. P. Changes in energy metabolism and alterations of neurons after continious treatment of high doses of insulin.
Increasing of NAD-isocitrate dehydrogenase, adenine nucleotides catabolism and reducing of NADH-dehydrogenase, mitochondrial NADP-depended isocitrtate dehydrogenase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, glutathione reductase, superoxide dismutase activiti were revealed in the rat brain after 5-7 comas on the second day after the last coma. The rate of glycolysis did not change under such condition. Lactate dehydrogenase outcome from brain slices to the incubation medium increased in rats after replacing of slices into the hypoosmolar medium with Fe2+ and ascorbate. In this case concentration of malonate dialdehyde in the rat brain slices was highly increased accordingly to intact animals. The data obtained indicates join participation of energy metabolism disturbance and activation of lipid peroxidation in posthypoglycemic encephalopathy pathogenesis.
Литература
1. Глебов P. H., Дмитриева H. M. Свойства Ыа+-К+АТФазы из коры головного мозга крыс // Биохимия. 1975. Т. 40, №4. С. 882-887. 2. Гуревич В. С., Конторщикова К. Н., Шатилина Л. В. Сравнительный анализ двух методов определения активности супероксиддисмутазы // Лаб. дело. 1990.
№ 4. С. 44-47. 3. Лебедева I И.. Ьерезов Т. Т.. Орехович В. И. Глутамин(аспарагин)аза из Pseudomonas aurantiaca ВКМВ-548 // Биохимия. 1981. Т. 46, № 1. С. 85-91. 4. Лукьянчиков В. С., Бстаболкин М. И. Гипогликемический синдром: Этиология, патогенез, диагностика, лечение. М., 1987. 5. Методы биохимических исследований: Липидный и энергетический обмен / Под ред. М. И. Прохоровой. Л., 1982. 6. Нейрохимия / Под ред. И. П. Ашмарина и П. В. Стукалова. М., 1996. 7. Никушкин Е. В., Крыжанов-ский Г. А., Михалева Л.И. и др. Взаимосвязь процессов пероксидного окисления и фосфолипидного гидролиза липидов в синаптосомах // Бюл. экспер. биол. и мед. 1989. Т. 83, №2. С. 174-177. 8. Панин Л. Е., Третьякова Т. А., Русских Г. С., Войцеховская Е. Э. Особенности регуляции ключевых ферментов гликолиза и пентозофосфатного пути в тканях с различной функциональной специализацией // Вопр. мед. химии. 1982. Т. 28, №2. С. 26-30. 9. Телушкин П. К. Активность окислительных ферментов, содержание субстратов цикла Кребса, свободного и пептидносвязанного глутамата в мозге крыс при гипогликемическом нервном синдроме: Автореф. канд. дис. Челябинск, 1988. 20 с. 10. Телушкин П. К., Потапов П. П. Интенсивность гликолиза и активность ферментов энергетического обмена в мозге крыс при многократном воздействии гипогликемических доз инсулина // Пробл. эндокринол. 1994. Т. 40, № 5. С. 53-54. 11. Телушкин.П. К., Шидловская Т. Е. Активность ферментов и содержание субстратов ГАМК-шунта в мозге крыс при многократном воздействии гипогликемических доз инсулина // Вопр. мед. химии. 1996. Т. 42, № 4. С. 306-308. 12. Филиппов С. П. АТФазная активность мик-росомальной и синаптосомальной фракций отделов мозга крыс при инсулиновой гипогликемии и ее купировании глюкозой // Пробл. эндокринол. 1991. Т. 37, №5. С. 52-54. ХЪ.Аиег R. N. Hypoglycemic brain damage // Stroke. 1986. Vol. 17, N 4. P. 699-708. 14. Auer R. N., Siesjo В. K. Hypoglycaemia: brain neurochemistry and neuropathology // Baillieres. Clin. Endocrinol. Metab. 1993. Vol.7, N3. P. 611-625. 15. Cadet J. L., Brannock C. Free radicals and the patology of brain dopamine systems // Neurochem. Int. 1998. Vol.32, N2. P. 117-131. 16 .ErdoS.L., Michler A., WoljfJ.R. GABA accelerates excitotoxic cell death in cortical cultures: protection by blockers of GABA-gated chloride channels // Brain Res. 1991. Vol. 542. P. 254—258. 17. Fitzpairick S. M., Cooper A. J. L„ Duffy Т. E. Use of methylene-D,L-aspartate to assess the role of aspartate aminotransferase in cerebral oxidative metabolism // J. Neurochem. 1983. Vol. 41. N 5. P. 1370-1383. 18. Gerlach M. Ben-Shachar D„ Riederer P., Youdim M. В. H. Altered brain metabolism of iron as a cause of neurodegenerative diseases? // J. Neurochem. 1994. Vol.63, N3. P. 793-807. 19. Kirk J. E. A procedure for quantitative determination of the diaphorase activity of connective tissue // Clin. Chem. 1963. Vol. 9, N 6. P. 776-779. 20. MourekJ. The effect of hypoglycemia on Na+, K+ and Mg2+ stimulated ATPase activity in the brain of rats of various ages// Sb. lek. 1984. Vol. 86, N 10. P. 289-297.
Статья поступила в редакцию 29 сентября 2005 г.
