Сочетание различных методов для определения лекарственных веществ при комбинированных отравлениях Текст научной статьи по специальности «Прочие медицинские науки»

ОБМЕН ОПЫТОМ

© В.А. Панов, А.Н. Лаврешин, Е.С. Мизелева, 2002 УДК 340.67

В.А. Панов, А.Н. Лаврешин, Е.С. Мизелева СОЧЕТАНИЕ РАЗЛИЧНЫХ МЕТОДОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ

ВЕ Щ ЕСТВ

ПРИ КОМБИНИРОВАННЫХ ОТРАВЛЕНИЯХ

Бюро СМЭ Комитета Здравоохранения г. Москвы (начальник бюро - профессор Жаров В.В.)

Из практики судебно-химических отделений известно, что значительные трудности при определении лекарственных веществ в биоматериале возникают при комбинированных отравлениях различными препаратами, особенно если они были приняты в больших количествах. В этих случаях использование традиционного метода ТСХ для разделения и идентификации веществ не всегда достаточно эффективно. Для надежного доказательства наличия нескольких лекарственных веществ в биологическом материале необходимо наряду с ТСХ использовать другие физико-химические методы. Ниже нами приводится случай из практики, в котором были использованы методы ТСХ в сочетании со спектрофотометрией, газовой хроматографией и хромато-масс-спектрометрией для судебно-химического доказательства комбинированного отравления анаприлином и дипразином.

По обстоятельствам дела известно, что гра жданин В., 23 лет, доставлен в больницу в бессознательном состоянии, где через некоторое время, не приходя в сознание скончался.

На судебно-химическое исследование были доставлены банки с частями внутренних органов умершего - желудок, печень, почка, тонкий кишечник. Были также присланы: флакон с кровью и флакон, в котором находилось 15 таблеток беловатого цвета без оболочек, округлой формы, извлеченные из желудка трупа В.

Изолирование лекарственных средств из доставленных внутренних органов проводилось ацетонитрилом с последующей экстракцией эфиром из водной фазы (РН 2- 3); далее проводили экстракцию хлороформом из водной фазы (РН 9-10), создаваемой 25% раствором гидроксида аммония. Подщелоченную водную фазу экстрагировали эфиром, установив РН 13 с помощью 50% раствора гидроксида натрия.

Изолирование лекарственных средств из доставленных таблеток проводилось подкисленной водой (РН - 2) с последующей экстракцией хлороформом;

далее проводили экстракцию хлороформом из водной фазы (РН 9-10), создаваемой 25% раствором гидроксида аммония.

По 5 мл щелочного и кислого хлороформных извлечений из таблеток об ъединялись и испарялись в фарфоровой чашке при комнатной температуре. Сухой остаток извлечения растворялся в 0.3 мл. этанола и исследовался хромато-масс-спектрометрическим методом. Исследование проводилось на газовом хроматографе HP 5890 с масс-селективным детектором HP 5971 А. Условия хроматографирования: кварцевая капиллярная колонка, 25м 0,2мм (привитая 5% фенил-метилсиликоновая фаза, 0,33 мкм). Скорость потока газа-носителя гелия 0.5мл/мин, без сброса. Температура термостата колонок -начальная 70 ?С (2 мин), программирование со скоростью 20 С/мин, конечная температура 280 С (17.5мин), температура термостатов испарителя - 280 С, детектора, интерфейса - 280 С. В испаритель хроматографа с помощью микрошприца вводился 1 мкл. исследуемого объекта. На хроматограмме наблюдался пик с временем удерживания 27,48мин. Идентификация наблюдаемых на хроматограмме пиков проводилась с использованием библиотек масс-спектров Wiley и PMW TOXR и пик с данным временем удерживания определен как индометацин.

При аналогичных условиях проводилось исследование 5мл. щелочного хлороформного извлечения (РН 10) и 5 мл щелочного эфирного извлечения (РН 13) из печени, объединенных и упаренных в фарфоровой чашке. Согласно полученным хромато-масс-спектрометрическим методом данным, на хроматограмме извлечения из печени пика индометацина не наблюдалось. Наблюдали пики с временами удерживания 14,75мин. и 16,18мин., которые идентифицированы по библиотеке масс-спектров соответственно как анаприлин (вероятность 95%) и дипразин (вероятность 93%).

Затем полученньїе извлечения из внутренних органов и таблеточной массьі исследовали методами ТСХ и УФ-спектрофотометрии. ТСХ проводили на стеклянних пластинках, размером 13 18 см, закреплен-ньім гипсом нейтральним слоем силикагеля марки ЛС 5/40 меш. (силикагеля - 6,08г, гипса - 0,34г., води дистиллированной - 10мл ) и на хроматографических пластинках "Silufol UV -254", размером 150 150мм.

Применяли следующие системи растворителей : ледяная уксусная кислота - хлороформ (5:95); зтила-цетат - хлороформ - 25% раствор гидроксида аммония (85:10:5); зтилацетат - метанол - 25% раствор гидроксида аммония (85:10:5); зтилацетат - ацетон - 25 % раствор гидроксида аммония - зтанол (50:45:2:2).

Для детектирования полученних пятен на хроматографических пластинках в системе 1 использовали 0,02% раствор дифенилкарбазона в хлороформе, а затем 2% раствор сульфата ртути в серной кислоте. При зтом в области продвижения хлороформного раствора индометацина и извлечения из таблеток отмечались пятна синего цвета с Rf=0,51; в области продвижения исследуемих извлечений из внутренних органов окрашенних пятен не отмечалось.

Для детектирования полученних пятен на хроматографических пластинках в системах 2, 3, 4 использовали: реактив Драгендорфа по Шталю и 0,05 н. раствор серной кислоти; 50% раствор серной кислоти в зта-ноле (1:1) с последующим нагреванием пластинки в течении одной минути при температуре 100?С, а затем капельное проявление концентрированной серной кислотой; концентрированная азотная кислота. При зтом в области продвижения исследуемих извлечений из внутренних органов на всех ис пользуемих хроматографических пластинках наблюдались окра-шенние пятна, совпадающие по Rf со "свидетелями" дипразином и анаприлином.

Зони силикагеля, параллельние полученним пятнам в системе 4 с концентрированной серной кислотой, на уровне дипразина (пятно розового цвета Rf=0,47) и анап рилина (пятно зеленого цвета Rf=0,43) злюировали. При исследовании зони дип-разина злюирование проводилось смесью 25% раствора гидроксида аммония с зтанолом (1:9), с последующим випариванием досуха в фарфоровой чашке и растворением остатка в 0,5н растворе серной кислоти. Полученний раствор исследовался на спектрофотометре HP 8452A в диапазоне длин волн 200-500нм, при зтом отмечались характерние максимуми дипразина - 254 нм и 302 нм. При исследовании зони анаприлина злюирование проводилось смесью хлороформа с 25% раствором гидроксида аммония (9:1), с последующим випариванием досуха в фарфоровой чашке и растворением остатка в 0,1 н растворе соляной кислоти. Полученний раствор исследовался спектрофотометрически, при зтом отмечались характерние максимуми анапри-лина - 228 нм, 286 нм и 318 нм.

Для подтверждения обнаруженних в биоматериале дипразина и анаприлина и их количествен-

ного определения использовался газохроматографический метод. Исследование проводилось на газовом хроматографе Hewlett Packard 5890 серии 2 с ионизационно-пламенним детектором, на кварцевой колонке 25 м 0,2 мм (привитая фенилметилси-ликоновая фаза - 0,33 мкм). Температура колонки начальная - 70?С (2 мин), программирование температури со скоростью 20 С/мин, конечная температура 280?С, температура испарителя - 280?С, детектора - 200?С. Скорость потока газа-носителя гелия, проходящего через колонку - 0,5 мл/мин, водорода -40 мл/мин, воздуха - 400 мл /мин. Обьеми вводимих в испаритель проб - 1мкл. Предварительно исследовались стандартние раствори анаприлина (С=0,4 мг/мл) и дипразина (С=0,31 мг/мл), времена удерживания которих составили 15,28 мин и 16,54 мин соответственно.

По 5 мл щелочного хлороформного извлечения (РН10) и щелочного зфирного извлечения (РН13) из почки, печени, желудочно-кишечного тракта упаривались в трех стеклянних бюксах досуха. Сухие остатки извлечений порознь растворялись в 0,3 мл зтанола и исследовались. На хроматограммах фиксировались пики с временами удерживания: почка - 15,24 мин и 16,55 мин.; печень - 15,26 мин и 16,56 мин.; желудоч-но-кишечний тракт - 15,50 мин и 16,64 мин.

Количественное определение найденних во внутренних органах дипразина и анаприлина проводилось методом "внутреннего стандарта" с использованием спиртового раствора анестезина. Вибор в качестве внутреннего стандарта анестезина обусловлен несколькими причинами: спиртовой раствор анестезина устойчив при хранении; случаев смертельних отравлений анестезином в практике Московского Бюро СМЗ не наблюдалось; хроматографические параметри анестезина не совпадают с наиболее часто встречающимися в практике Бюро СМЗ лекарственними препаратами. Время удерживания анестезина, при описан-них више условиях - 11,51 мин.

В результате исследования, в пересчете на 100 г. органов определено анаприлина: в желудочно-кишечном тракте - 129,8 мг, в печени - 1,6 мг, в почке - 0,9 мг. Определено дипразина в пересчете на 100 г. органов: в желудочно-кишечном тракте - 7,2 мг, в печени - 0,3 мг, в почке - 0,1 мг.

Таким образом, сочетание методов ТСХ, УФ-спектрофотометрии, газовой хроматографии и хро-мато-масс-спектрометрии позволило зффективно и с достаточной степенью надежности доказать наличие в биологических обьектах трупа В. дипразина и анаприлина. Исследование показало наличие индо-метацина в таблеточной массе и его отсутствие в органах трупа. Использование газовой хроматографии позволило провести количественное определение анаприлина и дипразина при их совместном присутствии.