CC BY
374
встречаться чаще, чем в виде ее защелачивания. Поэтому настороженность в выявлении лекарственного ацидоза должна быть выше.
Рассмотрим пример использования указанной выше информации при экспертизе причин госпитальной смерти пациента, возникшей в палате интенсивной терапии при чрезмерной кровопотере после хирургического вмешательства и развивающемся ацидозе на фоне транфузии. При судебно-медицинской экспертизе причины возможной лекарственной ятро-гении установлено, что за 20 часов до смерти в организм пациента введено 19 лекарственных средств из различных фармакологических групп. Перечень их соответствует базовым перечням (формулярам) лекарственных средств, протоколам и стандартам диагностики и лечения, а также клиническому состоянию пациента. Однако за период времени, не превышающий удвоенный период полувыведения каждого из
них до момента смерти, введенными в кровь оказались следующие растворы лекарственных средств:
Раствор глюкозы 5% - 400 мл.
Гемодез - 400 мл.
Реополиглюкин - 400 мл.
Раствор аминазина 2,5% - 2 мл.
Раствор димедрола 1% -1 мл.
Раствор гентамицина сульфата 4% - 2 мл.
Контрикал 10000 ЕД.
Анализ их кислотности свидетельствует о том, что все они являются кислыми. Так, величина рН раствора глюкозы оказалась равна 3,6, величина рН гемодеза -5,6, величина рН реополиглюкина - 5,5, величина рН аминазина - 3,5, величина рН димедрола - 5,2, величина рН гентамицина - 2,9, величина рН контрикала - 5,2. Следовательно, введенные лекарственные средства обладают выраженной зачисляющей активностью, способствующей развитию и усугублению ацидоза.
Литература.
1. ЛауренсД. Р., Бенитт П. Н. Клиническая фармакология: В 2-х т. Т. 2: Пер. с англ. - М. : Медицина, 1991-704с.
2. Витер В. И., ПоздеевА.Р., Закиров Т. Р. Опыт судебно-медицинской и фармакологической оценки синдрома избыточной инфузии при травматическом шоке // Труды Ижевской государственной медицинской академии. - Ижевск: Экспертиза, 2000. -Т. ХХХХШ1- с. 47-49.
3. Уроков А.Л., КоровяковА.Л, КорепановаМ. В., КравчукА.П., УраковаН.А Постмортальная клинико-фармакологическая оценка влияния инфузионно введенных в стационаре растворов лекарственных средств на процесс прижизненного развития гипо- или гиперосмотической комы //Проблемы экспертизы в медицине. 2001 - Т. 1. -№2. С. 22-24.
4. БабскийЕ. Б., Зубков АА„ КосицкийГ. И, ХодоровБ, И. Физиология человека. Ред. Е. Б, Бабский. -М,:Медицина. -19бб. -654 с.
5. Государственный реестр лекарственных средств. Т. 2. Типовые клинико-фармакологические статьи. - М.: ООО «Культурная инициатива». 2000. -749с.
6. Государственная фармакопея СССР: Вып. 1. Общие методы анализа/МЗ СССР, -11-е изд., доп. - М.; Медицина, 1987. -33 с.
© Козлова В. В., 2002 УДК 615.212.3.099.36:340.67:543
В. В. Козлова ОБНАРУЖЕНИЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПАРАЦЕТАМОЛА И П-АМИНОФЕНОЛА ПРИ ОСТРОМ ОТРАВЛЕНИИ
Краевое клиническое бюро судебно-медицинской экспертизы
(нач. бюро - Кильдишев К.И.) г. Ставрополь
Приведены методы изолирования парацетамола и его метаболита п-аминофенола, а также методики анализа, применяемые для обнаружения и идентификации (ТСХ, ГХ, ВЭЖХ). Полученные данные показывают различные возможности для проведения анализа с использованием широкого круга хроматографических методов.
Ключевые слова: Анализ, парацетамол, изолирование, хроматография.
V.V.Kozlova
PARACETAMOL AND P-ANINOFENOL REVEALING AND DETERMINATION IN THE CASES OF ACUTE POISONING Stavropol
The methods of paracetamol and p-aminofenol isolation, which can be used for their reveal ing and identification, are leaded. Received data show different possibilities for analysis with chromatographic methods usage.
Key words: analysis, paracetamol, isolation, chromatography.
В отечественной и зарубежной литературе обна- парата, методы доказательства присутствия его в био-
ружение и определение парацетамола предложено в логическом материале разработаны недостаточно.
основном для различных лекарственных препаратов Парацетамол в организме претерпевает изменения с
и биологических жидкостей (крови, плазмы, сыворот- образованием ряда метаболитов [2,4, 5]. Однако в доски крови, мочи) [1,2,3,6]. Несмотря на токсичность пре- тупной литературе не описаны методики обнаруже-
ния парацетамола и п-аминофенола при совместном присутствии. Проведенные исследования определения парацетамола в трупном материале, могут расширить границы судебно-медицинской экспертизы, и позволить судебно-следственным органам иметь более веские доказательства при решении вопроса об отравлении.
Целью настоящего исследования явился поиск оптимальных условий изолирования и определения парацетамола и п - аминофенола из биологического материала. Проведено исследование по выходу парацетамола и п- амино-фенола при общем ходе судебно-химического исследования. Oбнaружeно, что методом Baсильeвой парацетамол и п-аминофенол определяются в концентрациях 40% и 27% соответственно. Методом Cтaсa-Oтто обнаруживаются оба веществав концентрацияхдо 10%, т. е. для определения парацетамола и его основного метаболита п-аминофенола следует использовать другие методы изолирования.
Изолирование из биологического материала нативного парацетамола:
100г печени заливали в стакане 50 мл смеси ацетон-вода (1:1), подкисленной до рH 2-3 (по универсальному индикатору) 10% спиртовым раствором щавелевой кислоты и оставляли при комнатной температуре в течение часа. HaCTa-
ивание повторяли 2 раза при тех же условиях. Извлечения объединяли, центрифугировали 20 минут при 5000 об/мин. Надосадочную жидкость сливали в фарфоровую чашку, испаряли до исчезновения запаха ацетона. Водное извлечение насыщали сульфатом аммония до 10% содержания, экстрагировали смесью эфир- этилацетат (1:1) по 3 минуты 3 раза порциями по 50 мл. Водное извлечение подщелачивали 25% раствором аммиака до рН 7,0-8,0 (по универсальному индикатору) и экстрагировали смесью эфир-этилацетат (1:1) по 3 минуты, 3 раза порциями по 50 мл. В случае загнившего трупного материала рекомендуется реэкстракция кислой фракции гексаном 3 раза порциями по 10 мл.
Предложенная методика позволяет изолировать также главный метаболит парацетамола -п-аминофенол.
Изолирование из биологического материала п-аминофенола
100г печени заливали 50 мл 10% раствором соляной кислоты, гидролизовали с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение I часа. Холодильник промывали 10 мл 3% раствора соляной кислоты. Горячий гидролизат фильтровали через ватма-новский фильтр. Остаток на фильтре 3 раза промывали 3% раствором соляной кислоты. К фильтрату
Таблица 1.
Состав систем растворителей для обнаружения и идентификации парацетамола и п-аминофенола методом ТСХ
№ п/п Состав системы растворителей Парацетамол Rf П- Аминофе- нoл,Rf
1. Этилацетат-10% раствор гидрооксида натрия-дист. вода -25% р-р аммиака (9:2,7:0,1:0,2) 0,б7 0,25
2. Хлороформ-ацетон (9:1) 0,3б 0,54
3. диэтиловый эфир- диметилформамид-бензол (4:1:2) 0,б0 0,79
4. метиленхлорид-ацетон-муравьиная кислота (90:9:1) 0,11 0,25
5. метанол-25% р-р аммиака (100:1,5) 0,43 0,5б
б. бензол-диоксан-25% р-р аммиака (17:2:1) 0,75 0,93
7. Хлороформ-бутанол- 25% раствор аммиака (70:40:5) 0,78 0,5
8. Хлороформ-бутанол (9:1) 0,15 0,2
9. н-бутанол-уксусная кислота-бензол-дист. вода (2:2:10:1) 0,85 0,21
10 Хлороформ-ацетон (4:1) 0,1б 0,23
11. этилацетат-метанол - 25% р-р аммиака (17:2:1) 0,45 0,59
12 Этилацетат 0,34 0,40
13 Хлороформ-ацетон-толуол (65:25:10) 0,15 0,73
14 Хлороформ-диоксан-ацетон-25%раствор аммиака (22,5:24:2,5:1,25) 0,80 0,53
15 Бензол 0,0 0,0
1б Циклогексан-ацетон (4:5) 0,б5 0,89
добавляли сульфат аммония до 10% содержания. После подщелачивания гидролизата 25% раствором аммиака производили экстракцию смесью эфир-этила-цетат (1:1) 3 раза по 3 минуты порциями по 50 мл.
Доказательство обнаружения парацетамола и п-аминофенола основано на использовании тонкослойной хроматографии(ТСХ), для чего были использованы пластинки "Сорбфил иУ-254". Порог чувствительности обоих веществ определяли по отношению к 14 проявителям в 16 системах растворителей (табл. 1, 2). Оптимальными оказались системы № 1, 9,14.
Обнаружение парацетамола и п-аминофенола основано на получении окрашенных продуктов реакции
возможности определения другими хроматографическими методами. Площадь пятна (Б) рассчитывали по радиусу его зон. Прямую пропорциональную зависимость площади пятна от концентрации веществ наблюдали в пределах 1 - 6 мкг в пробе для парацетамола и п-аминофенола. Ошибка определения составила ± 14%.
Идентификацию парацетамола и п-аминофенола подтверждали спектрофотометрическим методом. Для этого спектр абсорбции элюатов исследуемых веществ, полученных после проведения тонкослойной хроматографии, измеряли в различных растворителях в диапазоне длин волн X 220-350 нм на спектрофотометре Спекорд (табл. 4).
Таблица 2.
Реагенты проявители для идентификации парацетамола и п-аминофенола
№ п/п Реагент Парацетамол (мкг)* П- Аминофенол (мкг)*
1. Лигниновая проба Желтая Коричневая
2. Образование индофенола Фиолетовая Фиолетовая
3. Реактив Фреде Васильковая -фиолетовая (10) Филетовая (10)
4. Реактив Марки Фиолетовая (10) Фиолетовая -синефиолетовая (10)
5. Иодид калия Желтая Желтая
6. 5% раствор калия перманганата в серной кислоте Белые пятна на розовом фоне (1) Белые пятна на розовом фоне (1)
7. Реактив Либермана Желтая Черная
8. 3% раствор хлорида железа (III) Малиновая-фиолетовая (1) Фиолетовая (1)
9. Концентрированная азотная кислота Красная Желтая - коричневая
10. Образование азокрасителя Красная (10) Красная (5)
11. Реакция Браттона-Маршалла Синяя- фиолетовая (50) Фиолетовая (3)
12. Нингидрин в 1% растворе серной кислоты Синяя- фиолетовая(5) Синяя- фиолетовая(5)
13. Реактив Шталя Желтая-оранжевая (30) Желтая (10)
14. Реактив Драгендорфа Оранжевая(1) Оранжевая-коричневая (1)
с кислотами (серной и азотной), раствором хлорида железа (III), хромового ангидрида, на реакциях получения азокрасителя и индофенолового красителя, реактивом Драгендорфа. Кроме реагентов (табл. 2) п-ами-нофенол можно обнаружить по собственно-коричневой окраске при концентрации в пятне более 1 мкг.
В системе № 5 обнаружению парацетамола и п-аминофенола не мешают наркотические вещества, их синтетические заменители и другие лекарственные средства (табл. 3).
Методом ТСХвозможно проведение полуколичествен-ного определения парацетамола и п-аминофенолапланимет-рическим методом. Методика рекомендуется в случае не-
Газохроматографическое определение парацетамола и п-аминофенола проводили на хроматографе 3700 и Цвет-550М и детекторе ДИП, на стеклянных колонках 1мх0,2 см заполненныххроматоном -Ы-АШ зернением 0,16x0,2 мм с нанесенной жидкой фазой 5% 0\/-17, скорость газа - носителя азота 30 мл/мин., водорода-30 мл/мин., воздуха - 300 мл/мин. Температура детектора 280°С, испарителя 250°С, колонки 200°С. Объем вводимой пробы 1 мкл. Разделение данной смеси возможно в режиме двухступенчатого программирования. Время выдержки температуры 3 минуты, скорость программирования 10°С в минуту до температуры 185°С с последующей выдержкой температу-
Таблица 3.
Разделение веществ в системе метанол-25% раствор аммиака
Препарат Rf Препарат Rf Препарат Rf
Сульфадимезин 0,13 Метаболит метадона 0,15 Кодеин 0,33
Морфин 0,37 Парацетамол 0,43 Метадон 0,48
Хинин 0,51 Никотин 0,54 Димедрол 0,50
Кокаин 0,65 Анальгин 0,66 Темазепам 0,66
Метаболит декстропропок- сифена 0,70 Фенциклидин 0,72 Диазепам 0,75
П-амнофенол 0,76 Промедол 0,74 Кетамин 0,79
Просидол 0,80 Папаверин 0,81 Амидопирин 0,84
ры 6 минут и скоростью программирования 25°С в минуту до температуры 225°С с последующей выдержкой этой температуры 10 минут. Чувствительность детектора 64x10-12. Белковые вещества при данных условиях не мешают определению парацетамола и п-аминофенола. В случае проведения анализа в изотермическом режиме скорость газа-носителя азота 30 мл/ мин, воздуха 250 мл/мин, водорода 25 мл/мин, температура колонки 230°С, чувствительность 8 х 10-12.
Количественное определение проводили с использованием метода внутреннего стандарта. В качестве стандартного вещества использовали анестезин и кофеин, с временем удерживания 5 мин. 15 сек и 10 мин 10 сек. При выбо-
ре соотношений руководствовались правилом наименьшего отличия площади пиков анализируемого вещества и стандарта. Содержание парацетамола и п-аминофенола определяли по площадям пика, принимая при этом площадь пика анестезина и кофеина за 100%. Порог чувствительности во вводимой пробе (1мкл) составлял 0, 1мг парацетамола и
0.05мг п-аминофенола, время удерживания 7 мин. 50 сек. и 3 мин 25 сек. соответственно. Линейность наблюдалась в диапазоне концентрации 0,2-1,5мг для парацетамолаи 0.05-1.0 мг для п-аминофенола. Селективность разделения хрома-тографическихпиков равна 7,66.
Проведение БЭЖХ анализа требует предварительной очистки проб методом ТСХ. Определение парацетамола и п-аминофенола проводили на микроколо-ночном хроматографе "Милихром -4", оснащенном УФ-детектором с перестраиваемой длиной волны, атак-же с компьютерной системой сбора и обработки дан-
ных Echrom с программой Chrom. При проведении анализа использовали стандартные колонки Ках-4: 64x3мм, Ках-6: 80x3мм. Оптимальные условия хроматографирования достигали при использовании обра-щенно-фазового сорбента "Сепарон - С16 " и "Сепа-рон - С18". B качестве подвижной фазы использовали систему растворителей ацетонитрил-фосфатный буфер рН 3 (30:70), профильтрованный через мембранный фильтр, продегазированный в течение 10 минут на ультразвуковой бане. Скорость подачи элюента составляет 100 мкл/мин. Масштаб регистрации находится в пределах - 0,40x01.00. Эффективность хроматографической колонки составляет для парацетамола I600
Таблица 4.
теоретических тарелок, дпя п-аминофенола 1800 теоретических тарелок. Объем вводимой пробы 5мкл, время измерения 0,4 сек, время анализа при использовании колонок КАХ 4 - 7 минут, КАХ 6 - 4 минуты, границы спектра 190-360 нм, масштаб регистрации-0,40;01,
00. Максимальная чувствительность детектора к парацетамолу наблюдалась при длине волны 244 нм. П-аминофенол обладает максимальным поглощением при 272 нм. Смесь обоих веществ определяли при опорной длине волны 272 нм.
Предел обнаружения - 2,3 мкг/мл для парацетамола и 1 мкг/ мл для п-аминофенола. Установлено, что в области рабочих концентраций от 20до 190 мкг/мл для парацетамола и от 2 до 30 мкг/мл для п-аминофенола наблюдается линейная зависимость площади пика от содержания веществ в испытуемом биологическом материале. Методика определения: Сухой остаток,
Спектрофотометрические характеристики по данным [5]
Препарат Растворитель
Метанол Вода 0,1 н раствор хлористоводородной кислоты 0,1 н раствор натрия гидроксида Этанол
нм Е -^см % нм Е см % нм Е см % нм Е см % нм Е см %
Параце- тамол 249 -* 243 - 243 - 255, 273 715 245 -
П-Амино- фенол 233 303 587 1776 243 - 271 133 6 266 - 245 -
полученный после элюирования, растворяют в 100 мкл растворителя ацетонитрила - фосфатного буфера рН 3, вводят в уравновешенную хроматографическую систему и хроматографируют при описанных выше условиях. Идентификацию парацетамола и п-аминофе-нола проводили по времени удерживания пиков на хроматограмме исследуемого раствора и смешанного стандарта (Б1Б). Степень разделения между пиками парацетамола и п-аминофенола составаяет 1,4 (рис 2). Количественное определение исследуемых веществ проводили методом внешнего стандарта. В качестве стандартного образца использовали парацетамол и п-аминофенол в концентрациях 500 мкг/мл (Б1:), с временем удерживания 1,92 и 2,65 мин соответственно. Концентрация контрольного раствора должна быть близка к концентрации определяемого вещества в растворе экстракта. Расчет количественного содержания каждого компонента проводили по площади пика с использованием компьютерной программы.
Относительная ошибка отдельного результата определения по разработанной методике составляет: для парацетамола ±2,2%, для п-аминофенола ±1,85%. Относительное стандартное отклонение результатов не превышает 2%.
Выводы:
1. Предложена методика изолирования парацетамола и п-аминофенола из биологического материала, которая позволяет определять указанные вещества в биологическом материале. Парацетамол и п-аминофе-нол, добавленные к 100г печени в количестве 10 мг определяются в пределах 63% и 67% соответственно.
2. Разработаны условия анализа (ТСХ, ГЖХ, ВЭЖХ) парацетамола и п-аминофенола, которые позволяют одновременно подтверждать подлинность, производить количественное определение, обладают большой разрешающей способностью, а также обеспечивают необходимую точность при проведении химико-токсикологического анализа и получение воспроизводимых результатов анализа. Примеси белковых веществ и продукты их разложения находятся вне зоны определения парацетамола и п-аминофенола (методом тонкослойной хроматографии) а также не мешают их обнаружению другими хроматографическими методами
3. Заключение о наличии парацетамола и п-ами-нофенола в биологическом материале дают по совокупной оценке полученных результатов методами тонкослойной хроматографии, газовой хроматографии и высокоэффективной хроматографии.
Литература
1. Жан-Хирц. // Аналитические методы исследования метаболитов лекарственных веществ. - М., 1975. - С. 39-40.
2. Козлова В. В., Вергейчик Т.Х., Шабалин С. В. Состояние вопроса по изучению парацетамола в химико-токсикологическом отношении (Депонир. ВИНИТИ 1996.)
3. Фартушный А. Ф. //Суд. -мед. Эксперт. -1999. -N 4. -С. 16-19.
4. Bales L. R.,Bell J. D.Nicholson J. K.,Sadler P. J.,Timbreu J. A.,Hughes R. D. Bennett P. N.,Williams R. I. //Magn. Resonan. Med. -1988. -Vol. 6, N3. -P. 300-306.
5. Clarke• s. //Isolation and identification of drugs. -2 Ed. - London, 1986. - P. 428-429.
6. Nachi C. F. B., Habane T., Satumba P., Kasilo O. M. J. //Hum. And exp. toxicol. -1992. - Vol. 11, N5. -P. 329-333.
© Г.И. Авходиев, O.B. Кузьмина, 2002 УДК 546.23:547.262:61:34
Г.И. Авходиев, О.В. Кузьмина СОДЕРЖАНИЕ СЕЛЕНА В НЕКОТОРЫХ ОРГАНАХ И ТКАНЯХ ПРИ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ
Кафедра судебной медицины (зав. кафедрой - доц. Г.И. Авходиев)
Читинской государственной медицинской академии
Изучается влияние алкогольной интоксикации на концентрацию селена в крови, печени, почках, сердечной и скелетной мышечной ткани при различных причинах смерти. Обнаружено снижение содержания селена во всех изученных органах, наиболее низкие величины данного вещества наблюдались при отравлении этанолом и острой коронарной недостаточности.
Ключевые слова: селен, алкогольная интоксикация, судебная медицина
G.I.Avhodiev, O.V.Kuzmina SELENIUM CONTENT IN SOME ORGANS AND TISSUES IN THE CASES OF ALCOHOL INTOXICATION Chita
Influence of alcohol intoxication on selenium concentration in blood,liver,kidneys,in cardial and skeletal muscular tissue in the different cases of death is studied. There was discovered decreasing of selenium concentration in studied organs. In the cases of alcohol poisoning and acute coronary deficiency the lowest selenium concentration was defined.
Keywords: selenium, alcohol intoxication, forensic medicine.
В настоящее время выявлены регионы, в которых ратуре данным можно сделать вывод о многообразии
отмечается снижение уровня селена в почве, воде, рас- повреждений, развивающихся у животных и человека
тениях. К подобному селенодефицитному району от- в этих условиях [4]. Наиболее общим признаком мно-
носится и Читинская область. По имеющимся в лите- гие авторы считают нарушение репродукции: уве-
