CC BY
49
SNP-полиморфизм в геномах изолятов Streptococcus pneumoniae CC320, устойчивых к бета-лактамным антибиотикам
И. А. ЦВЕТКОВА', М. О. ВОЛКОВА', О. С. КАЛИНОГОРСКАЯ', С. С. БЕЛАНОВ2, В. В. ГОСТЕВ', С. В. СИДОРЕНКО'3
' НИИ детских инфекций ФМБА России, Санкт-Петербург, Россия
2 Университет Хельсинки, Институт Биотехнологии, Хельсинки, Финляндия
3 Северо-Западный Государственный Медицинский Университет им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
SNP Polymorphism in Genomes of CC320 Isolates of Streptococcus pneumoniae Resistant to Beta-Lactams
I. A. TZVETKOVA', M. O. VOLKOVA', O. S. KALINOGORSKAYA', S. S. BELANOV2, V. V. GOSTEV', S. V. SIDORENKO'3
' Institute of ^Ndrens Infections FMBA of Russia, Saint-Petersburg, Russia
2 University of Helsinki, Institute of Biotechnology, Helsinki, Finland
3 North-Western State Medical University named after I. I. Mechnikov, Saint-Petersburg, Russia
В результате биоинформационного анализа данных полногеномного секвенирования изолятов Streptococcus pneumoniae клонального комплекса СС320, циркулирующих в Российской Федерации, а также данных об изолятах СС320 из открытых источников у резистентных к пенициллину изолятов было обнаружено 139 миссенс-мутаций в 45 генах. Кроме мутаций в генах основных пенициллин-связывающих белков (ПСБ — PBP1A, PBP2B и PBP2X) высокая частота мутаций обнаружена в генах, входящих в состав dcw-кластера (division and cell wall), а также в белке RegR, который относится к регуляторам транскрипции, принадлежащим к семейству LacI/GalR. Формирование резистентности к бета-лактамным антибиотикам у S.pneumoniae определяется не только модификацией ПСБ, но и адаптационными изменениями в метаболических путях участвующих в росте делении бактериальной клетки.
Ключевые слова: Streptococcus pneumonia, мутации, резистентность, бета-лактамы.
Bioinformatic analysis of the data on the genome sequencing of the isolates of the Streptococcus pneumoniae clonal complex SS320 from the Russian Federation, as well as the data on SS320 isolates from public sources in the penicillin resistant isolates resulted in detection of 139 missense mutations in 45 genes. In addition to the mutations in the genes of the main penicillin-binding proteins (PSB - PBP1A, PBP2B and PBP2X) there was detected high frequency of mutations in the genes of the (division and cell wall) dcw-cluster, as well as in RegR protein belonging to the transcription regulators of the LacI/GalR family. Development of resistance to beta-lactams in S.pneumoniae is defined not only by modification of the PSB, but also by adaptive changes in the metabolic pathways involved in the bacterial cell growth and division.
Key words: Streptococcus pneumonia, missense mutations, resistance, beta-lactams.
Введение
Streptococcus pneumoniae является комменсаль-ным микроорганизмом, входящим в состав назо-фарингеальной микробиоты. В то же время пневмококки являются возбудителями ряда инвазивных и мукозальных инфекций. Современная стратегия сдерживания пневмококковых инфекций основана на их профилактике с помощью полисахаридных и конъюгированных вакцин, а также на лечении развившихся инфекций с помощью антибиотиков различных групп, среди последних наибольшее значение имеют бета-лак-тамы. Первые резистентные к в-лактамам штам-
© Коллектив авторов, 2016
Адрес для корреспонденции: 197022, Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, д. 9. НИИДИ
мы S.pneumoniae появились в 40-х годах, с тех пор распространенность этого явления нарастает [1, 2]. Доказанным механизмом резистентности является снижение аффинности к бета-лактамам мишеней их действия — мембраносвязанных транс-пептидаз (пенициллин-связывающих белков — ПСБ), катализирующих синтез и ремоделирова-ние пептидогликана.
Снижение аффинности в свою очередь, является результатом мутаций в генах ключевых ПСБ, pbp2x, pbp2b, [3]. В то же время показано, что помимо генов, кодирующих белки РВР1А, РВР2В и РВР2Х, для развития резистентности критичны мутации в генах, отвечающих за синтез пептидог-ликана (mraW и mraY), клеточное деление (ftsL, gpsB), кодирующих шапероны (clpL, clpX), обеспечивающих процесс генетической рекомбина-
ции (recU) [4], а также в других. Однако детали механизмов резистентности напрямую не связанных с ПСБ не известны. Значительные перспективы в этом направлении связаны с биоинформа-тическим анализом накопленных к настоящему времени данных о структуре ПСБ и других белков, участвующих в процессах роста микробной клетки.
Актуальной и практически важной проблемой является также влияние антипневмококковой иммунизации на распространение в популяции S.pneumoniae антибиотикорезистентности. Внедрение в 2000 г. в США, а затем и в других странах, массовой иммунизации семивалентной пневмококковой конъюгированной вакциной (ПКВ7) привело к существенному изменению популяционной структуры S.pneumoniae, за счёт уменьшения распространённости «вакцинных» серотипов и увеличения «невакцинных». Наиболее значительное распространение получил се-ротип 19А [5]. При этом в Азии и США распространение получили множественноустойчивые штаммы пневмококка серотипа 19A, принадлежащие к CC320 (Clonal Complex 320) [6—8], а в Норвегии доминировали штаммы СС199 [9], сохранявшие чувствительность к антибиотикам. Последующее внедрение в ряде стран 13 валентной конъюгированной вакцины (ПКВ13), в состав которой входит полисахарид серотипа 19А, привел к снижению распространения этого серотипа. Генетическая линия СС320, представленная как чувствительными, так и устойчивыми изолятами, широко распространена в России.
Настоящее исследование было направлено на изучение роли мутаций в генах ПСБ и других белков в формирования резистентности генетически линии S.pneumoniae CC320 к бета-лактамным антибиотикам.
Материал и методы
Идентификация и типирование S.pneumoniae. Выделение, идентификацию и оценку антибиотикочувствительности S.pneumoniae из респираторных образцов осуществляли классическими микробиологическими методами. Определение серотипов изолятов выполняли с помощью ПЦР в соответствии с рекомендациями CDC (Centers for Disease Control and Prevention, США). Мультилокусное сиквенс-типирование (MLST) проводилось по стандартной схеме (www.mlst.net).
Полногеномное секвенирование. Полногеномное секвени-рование изолятов, выделенных в ФГБУ «НИИ Детских инфекций ФМБА России» (штаммы 3733, 1950_231, 148_87 и 438_198), было выполнено на платформах IonTorrent, LifeTechnologies (штамм PGM2), и MiSeq, Illumina.
Открыпые источники данных. Данные полногеномного секвенирования (короткие риды, HiSeq, Illumina) 41 штамма S.pneumoniae, относящихся к клональной группе CC320, из базы данных European Nucleotide Archive (ENA), результаты серотипирования и оценки антибиотикочувствительности этих изолятов были получены из публикаций [4, 10]. Геном референсного штамма S.pneumoniae TW31 (Taiwan19F-
14/PMEN14, Пневмококковая молекулярная эпидемиологическая сеть; ATCC700905, Американская коллекция типовых культур) из базы данныгх GenBank (NC_012469.1).
Методы биоинформатики. Сборка геномов de novo и аннотация. Качество коротких ридов их процессинг выполнялись с помощью программ FASTQC и Trimmomatic v.0.32. Сборка геномов de novo была выполнена с помощью программ SPAdes v.3.5.0 и SSPACE v.3.0. Качество сборки геномов de novo оценивалось с помощью программы QUAST. Геномы быши аннотированы с помощью программного интерфейса myRAST и RAST сервера (Rapid Annotations using Subsystems Technology).
Детекция однонуклеотидных полиморфизмов (SNP). Короткие риды каждого изолята быши картированы на рефе-ренсный геном S.pneumoniae TW31 с помощью программ Samtools и Bowtie2, параметры были установлены по умолчанию. Потенциальные SNP быши идентифицированы с использованием программы samtools mpileup. SNP быши отфильтрованы для удаления сайтов, в который: качество SNP замены составило ниже 20 по шкале Phred. SNP в сайтах с гетерогенным картированием были отфильтрованы для удаления сайтов, в которых SNP-замена присутствовала менее чем в 66% коротких ридов.
Сравнение изолятов по консервативной части генома. Идентификация и множественное выравнивание консервативной части геномов изучаемых изолятов было выполнено с помощью программного пакета Harvest tools parsnp [11].
Оценка полиморфизма индивидуальных белков. Для каждого изолята исследуемой популяции кодирующие последовательности были транслированы в протеиновые последовательности и экстрагированы из сборки de novo. Сравнение аминокислотных последовательностей, ассоциированных с высокой степенью полиморфизма у резистентных к пенициллину штаммов S.pneumoniae, бышо выполнено путем множественного выравнивания набора последовательностей с помощью алгоритма MUSCLE. В качестве референсных последовательностей использовали протеиновые последовательности, принадлежащие двум диким штаммам из исследуемой популяции S.pneumoniae (ERR057872 и ERR047995).
Оценка распределения аллелей Pbp2X в пределах исследуемой популяции. Распределение выфовненныгх аминокислотных последовательностей белка Pbp2X было получено с помощью программного обеспечения BAPS [12]. Оценка распределения аллелей в программе BAPS основана на алгоритме односторонней стохастической оптимизации. Заданный уровень значимости соответствовал p=0,05.
Результаты исследования
Идентификация однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), ассоциированных с резистентностью к пенициллину. Исследуемая популяция была сформирована генетически близкими изолятами пневмококка, относящимися к клональной группе CC320 и представляющими собой двуло-кусные варианты референсного штамма S.pneumoniae TW31 (ST236, ST271, ST320 и т.д.). Однородность отобранной популяции способствовала снижению фонового SNP полиморфизма, не обусловленного наличием резистентности. Характеристики включенных в исследование штаммов приведены в табл. 1.
В результате анализа частоты SNP-полимор-физма в геномах исследуемых изолятов было обнаружено 139 миссенс-мутаций в 45 генах у резистентных к пенициллину штаммов пневмококка. Поскольку не все обнаруженные SNP могут ассо-
Таблица 1. Штаммы S.pneumoniae СС320, включенные в данное исследование
ST Серотип _МПК, мг/л__Источник
PEN CTX TMP ERY TET CHL
ERR057872 236 19F S S S 2009, [13]
ERR047995 236 19F S S S 2008, [13]
ERR089630 236 19F S S S 2009, [13]
ERR064097 236 19F S S S 2010, [13]
ERR054377 236 19F 0,25 R 2009, [13]
ERR065314 236 19F 2,00 0,5 >2 >0,5 >4 2 2004, [10]
ERR129078 236 19F 3,00 1,5 6 4 2007, [10]
S.pneumoniae TW31 236 19F 2,00 3 32 0,75 GenBank
438 198 236 19F 2,00 64 8 2011, НИИДИ
ERR069793 236 19F 2,00 1 >4/76 >1 >8 2001, [10]
ERR069842 236 19F 4,00 1 >4/76 >1 >8 2001, [10]
ERR069791 236 19F 2,00 0,5 >4/76 0,25 >8 2001, [10]
ERR054445 236 19F 0,50 R 2009, [13]
ERR060014 236 19F 1,00 R 2009, [13]
ERR050055 236 19F 1,00 R 2009, [13]
ERR054374 236 19F 0,50 R 2009, [13]
ERR054285 236 19F 0,50 R 2009, [13]
ERR054441 236 19F 0,50 R 2009, [13]
ERR056842 236 19F 0,50 R 2009, [13]
ERR060002 236 19F 0,50 R 2009, [13]
ERR056791 236 19F 0,50 R 2009, [13]
ERR069699 236 19F 2,00 1 1 >0,5 >4 2 2004, [10]
ERR067999 236 19F 2,00 1 1 >0,5 >4 2 2004, [10]
ERR124222 320 19A 6,00 6 6 >256 2007, [13]
ERR124233 320 19A 4,00 1,5 6 >256 2007, [13]
ERR124255 1451 19A 4,00 2 4 >256 2007, [13]
ERR129031 320 19A 3,00 2 6 >256 2007, [13]
ERR129036 320 19A 3,00 2 3 >256 2007, [13]
ERR129049 320 19A 3,00 1,5 12 >256 2007, [13]
ERR129075 320 19A 6,00 8 3 4 2007, [13]
ERR129193 320 19A 4,00 1,5 6 >256 2007, [13]
PGM2 320 19A R R 2011, НИИДИ
ERR069720 320 19A >4 >2 >2 >0,5 >4 2004, [13]
ERR129062 3292 19F 1,00 0,5 >32 >256 2007, [13]
148 87 320 19F 4 0,5 64 2011,НИИДИ
1950 231 1464 19F 8 64 2011,НИИДИ
ERR068003 1941 19F 1,00 <0,25 >2 >0,5 >4 2004, [13]
3733 271 19F 8 64 32 2011,НИИДИ
ERR065973 320 19F >4 2 >4/76 >1 >8 2001, [13]
ERR067990 271 19F 4,00 >2 >2 >0,5 >4 2004, [13]
ERR068035 1937 19F 4,00 1 >2 >0,5 >4 2004, [13]
ERR068036 271 19F 4,00 1 >2 >0,5 >4 2004, [13]
ERR069843 320 19F 4,00 2 >4/76 >1 >8 2001, [13]
ERR069706 1943 19F 2,00 1 0,5 >0,5 >4 2004, [13]
ERR069762 1945 19F 2,00 1 >4/76 <0,03 0,12 2001, [13]
циироваться с возникновением резистентности, была проведена оценка полиморфизма индивидуальных продуктов идентифицированных генов и исключены сайты 8МР, предположительно не связанные с развитием устойчивости к пенициллину. В табл. 2 представлен перечень генов и кодируемых ими продуктов, а также выявленные аминокислотные замены, которые могут быть связаны с развитием резистентности к бета-лактамам.
Оценка полиморфизма индивидуальных белков. В табл. 2 перечислены аминокислотные замены, встречающиеся у резистентных к пенициллину изолятов S.pneumoniae СС320.
Фермент ундекапринилфосфат фосфо-М-аце-тилмурамоил-пентапептид-трансфераза (МгаУ) вовлечён в первый (цитоплазматический) этап би-
осинтеза клеточной стенки пептидогликана. Белок МгаУ является компонентом клеточной мембраны, он содержит 10 трансмембранных областей (www.uniprot.org). У всех резистентных к пенициллину штаммов S.pneumoniae идентифицированы мутации Т60А; 873К(М); Б75Ь; У1701; 1213У.
В сравниваемых последовательностях белка РВР2Х идентифицировано 54 аминокислотные замены. В области транспептидазного домена (позиции 266-616) обнаружена 31 замена. В С-терминальной области идентифицировано 20 замен. В пенициллин-связывающей области найдены 3 замены. Из приведённых замен ранее были охарактеризованы мутации: Т338А (связана с изменением активности серина активного центра); Я3840 (приводит к конформационному измене-
Таблица 2. Гены пенициллинорезистентных штаммов S.pneumoniae, мутации в которых могут быть ассоциированы с резистентностью к пенициллину
Ген Продукт Функция Аминокислотные замены у большинства резистентных штаммов
mraY Ундекапринилфосфат фосфо^-ацетилмура-моил-пентапептид-трансфераза Синтез пептидогликана Т60А; S73K(N); F75L; У1701; 1213У
pbp2x РВР2Х А172Т/А172Б; R254Q; М256У; D301N; Т338А; A346S; A347S; G354S; У358Y; L364F; 1371Т; G382T; R384G; S389L; T401S; N417K; N444S; I462L; Р486Т; D488N; T490S; А491У; У5161; У523L; S530Y; Т5361; У5371; L546У; У565S; D567N; S574T; S576N; N605T; D616E; T622S; Т623Р; А62Ш; E628D; S631T; Q632T; Q633E; P635S; Р637А; Y641I; Е652А; L657I; N671E; S672T; А674У; I688L; А693У; У6961; L710F; Q721E
pbp2b РВР2В S412P; N422^ Т426К; Q427L; Q438E; Т446А; Ь4551
FtsL Клеточное деление K4R
gpsB GpsB А2Т; N24S; K65Q; К65 Р66 insУSSA; У69S; Q70H; А71Р; E72D; L74I; E75D; А76У; 178А; T79S; S107T; F109L
mapZ Срединно расположенный белок Т A13G; F75L; K94E; L110P; D127E; D148E; 1161У; У164А; A184N; У257А; L273P; Q327E; K343E; Р344Т
engB YsxC/EngB C96R у некоторых высокорезистентных изолятов серотипа 19F
Резолваза Кееи У8^ Т14Р; Q60R; H89N; У97А; У1221; F147Y; E165G
rlmL Гипотетическая N6-аденин-специфичная метилаза ДНК Метилирование ДНК 1235У
rpiR Регулятор утилизации сиаловой кислоты, семейство RpiR Метаболизм фруктозы и маннозы
8РТ 0166 (8.р.Т^31) Белок семейства MutT/Nudix Репарация ДНК E124Q; D125N
8РТ 0376 Гепариназа-П/Ш-по- Метаболизм углево- G172S; D206E; D385G
(8.р.Т^31) добный белок дов, одноуглеродный
regR Репрессор утилизации метаболизм, модуля- N79T; Q151R; S216R; D238N; 1247У; L254P; S295A; R313L;
гиалуроната и дезок- ция экспрессии фак- N327S (у всех S.pneumoniae ST236, ST271 и других
сикетоглюконат кина-зы RegR торов вирулентности однолокусных вариантов ST236)
8РТ 0384 (S.p.TW31) Метилтрансфераза Н малой субъединицы рибосомальной РНК Процессинг РНК
8РТ 0555 Нуклеотид-связываю- Т108А
(S.p.TW31) щий белок с гистиди-новой триадой
SPT 0872 тРНК и рРНК цито-
(S.p.TW31) зин-С5-метилаза
SPT 1551 Гипотетическая
(S.p.TW31) тРНК-т1А22 метилаза
SPT 0382 Гипотетический белок Не известна S78A; D133G
(FIG01114714)
ypsA Гипотетический белок (НЮ005686) Не известна S51T; E164Q
нпю петли, прилегающей к поверхности активного центра); замены Я3840, Б567М и N6051 связаны с изменением кинетики взаимодействия РВР2Х с в-лактамами [14].
Аминокислотные последовательности белка РВР2В отличались от чувствительных штаммов наличием 7 мутаций в области транспептидазно-го домена, между высококонсервативными мотивами 8386УУК и 84438К Мутация Т446А была охарактеризована ранее, она приводит к снижению аффинности к пенициллину на 60%, по сравнению со штаммом дикого типа [15]. Мутации вблизи консервативного мотива К615ТО могут модифицировать гибкость в3-спирали, грани-
чащей с активным центром, и изменять кинетику связывания РВР2В белка с бета-лактамами [15]. Аминокислоты Азп659, 01у660 и 8ег664 находятся в С-терминальной области спирали а 11. Возможно, мутации в данных областях могут индуцировать конформационные изменения в области активного центра, создающие препятствия для связывания с антибиотиками [15].
Белок клеточного деления регулирует поперечный рост клетки и участвует в формировании комплекса белков клеточного деления FtsQ и Р18В/И8Ь: его периплазматический домен взаимодействует с белком FtsQ, трансмембранный домен взаимодействует с белком FtsB, цитоплазматичес-
кий домен взаимодействует с трансмембранным белком FtsW [16, 17]. У большинства резистентных к пенициллину штаммов S.pneumoniae обнаружена мутация в коротком ^концевом цитоплазматиче-ском домене (K4R).
Белок GpsB консервативен у всех грамполо-жительных бактерий, он взаимодействует с белками клеточного деления РВР1, МгеС и EzгA [18, 19]. Предполагают, что белок GpsB играет роль в переключении между синтезом клеточной стенки в периферическом направлении и синтезом перегородки, посредством релокализации белка РВР1. У всех резистентных к пенициллину штаммов S.pneumoniae мы обнаружили мутации в области ^концевого домена, гомологичного белку БМУА (А2Т; N24S; K65Q), а также мутации в области С-концевого домена.
ГТФ-связывающий белок EngB (YsxC/EngB) контролирует клеточное деление, клеточный цикл, сигнальную трансдукцию, сборку рибосом и синтез белка, способствуя чередованию неактивной ГДФ-связанной и активной ГТФ-связанной формы белков [18]. У некоторых штаммов S.pneumoniae ST236 серотипа 19F, отличающихся высокой резистентностью, была обнаружена мутация С96Я
Срединно-расположенный белок MapZ формирует кольцо на экваторе вновь поделившихся клеток. После начала клеточного деления, во время периферического роста, сформированное белком MapZ кольцо расщепляется на два кольца, которые перемещаются к полюсам клетки [20]. Белок имеет три основных домена: ^концевой, локализованный в цитоплазме, трансмембранный домен, С-концевой внеклеточный домен. У всех резистентных к пенициллину изолятов S.pneumoniae были идентифицированы мутации как в цитоплазматическом (A13G; F75L; K94E; Ы10Р; D127E; D148E), так и во внеклеточном домене (1161У; У164А; А184^ У257А; Ь273Р; Q327E; K343E; Р344Т). Мутации в С-концевом домене белка MapZ локализуются между многочисленными областями формирования спиралей, в-цепей и серин-обогащённого участка.
Резолваза RecU участвует в сегрегации хромосом во время клеточного деления, рекомбинации ДНК и репарации ДНК. Фермент содержит четыре металл-связывающих сайта (позиции 81, 83, 96, 115), а также сайт, стабилизирующий состояние транзиции (98). Аллостерическая транзиция обеспечивает гибкую систему регуляции активности ферментов. У всех резистентных к пенициллину штаммов S.pneumoniae были обнаружены мутации У8Ь; Т14Р; Q60R; Н89^ У97А; У1221; F147Y; E165G. При этом аминокислотная замена У97А локализуется рядом с сайтом, стабилизирующим состояние аллостерической транзиции.
Структура гипотетической ^-аденин-специ-фичной метилазы ДНК представлена двумя до-
менами: N-концевой THUMP-домен (АМК-ос-татки 45-159) и C-концевой UPF0020 домен (собственно, метилаза). Считают, что происхождению гена данного фермента предшествовало слияние генов эндонуклеазы рестрикции и ме-тилтрансферазы [21]. Метилирование ДНК является ключевым механизмом, контролирующим экспрессию генов, поддержание целостности генома клетки, защиту от встраивания ДНК фагов и транспозонов. АМК-замены в белке №-аде-нин-специфичной метилазы ДНК могут быть связаны с изменением специфичности метил-трансферазы. У всех резистентных к пенициллину штаммов S.pneumoniae мы обнаружили мутацию I235V в C-концевом домене метилтрансферазы.
Охарактеризованные белки суперсемейства MutT/Nudix гидролизуют нуклеозид дифосфат, связанный с каким-либо другим фрагментом. Гидролазы семейства Nudix могут быть необходимы для защиты клеток от потенциально опасных метаболитов и для снижения накопления промежуточных продуктов ключевых биохимических процессов. У резистентных штаммов обнаружены две аминокислотные замены в C-терминальной области (E124Q; D125N). Идентифицированные замены локализованы вне области Nudix-мотива, считается, что они определяют субстратную специфичность фосфогидролазы.
Сравниваемые аминокислотные последовательности гепариназа-П/Ш-подобного белка отличались у всех резистентных штаммов наличием трёх замен в области N-терминального домена (G172S; D206E; D385G). Известно, что а-спира-ли N-терминального домена гепариназы III у Bacteroides thetaiotaomicron участвуют в формировании туннеля, содержащего каталитический активный центр [22]. Гепариназа является фактором инвазии. Ген, кодирующий гепариназа-II/III подобный белок, является частью RegR-регуло-на, который включает три граничащих друг с другом транскрипционные единицы.
Белок RegR относится к регуляторам транскрипции семейства LacI/GalR, характеризующимся наличием мотива спираль-петля-спираль в N-концевом домене, вовлечённом в связывание этим белком ДНК, а также мотива в С-концевом домене, связывающего белки и углеводы и выполняющего регуляторные функции [23]. У всех резистентных к пенициллину изолятов S.pneumoniae, принадлежащих ST236, ST271, мутации в последовательностях белка RegR были локализованы в С-концевом домене (N79T; Q151R; S216R; D238N; I247V; L254P; S295A; R313L; N327S).
Обсуждение
Мутации в первичных мишенях в-лактам-ных антибиотиков имеют критическое значение для развития резистентности. Показано, что
большая часть значимых мутаций локализуется рядом с активными центрами ферментов [24]. Предполагается, что кумулятивный эффект подобных мутаций можно интерпретировать как «калибровку» активного центра первичной мишени, который будет эффективнее различать субстрат от в-лактамного блокатора. Как уже отмечалось синтез пептидогликана — это компонент процесса роста клеточной стенки, управляемого белком FtsZ, который является гомологом тубулина, а также другими белками раннего клеточного деления [19], объединёнными в один комплекс [6].
Гены, отвечающие за синхронизацию процессов синтеза пептидогликана и клеточного деления, входят в состав dcw-кластера (division and cell wall). Эта область имеет похожую организацию у различных видов грамположительных микроорганизмов и содержит гены, кодирующие белки, которые участвуют в сегрегации хромосомы, поддержании клеточной морфологии и клеточном делении, а также неохарактеризованные гены [1, 20, 22, 25—31]. Полученные результаты показывают, что у резистентных к пенициллину штаммов S.pneumoniae наблюдается высокая частота полиморфизма в генах, входящих в состав данного кластера.
У всех резистентных к пенициллину штаммов S.pneumoniae, являющихся однолокусными вариантами ST236, мы обнаружили мутации в белке RegR, который относится к регуляторам транскрипции, принадлежащим к семейству LacI/GalR. Ген regR включён в 15.5-kb область, предшествующую региону dcw-кластера и содержащую открытые рамки считывания, кодирующие гипотетическую глютатион пероксидазу
ЛИТЕРАТУРА
1. Hulten K.G., Kaplan S.L., Lamberth L.B., Barson W.J., Romero J.R., Lin P.L., Bradley J.S., Givner L.B., Tan T.Q., Hoffman J.A., Mason E.O. Changes in Streptococcus pneumoniae Serotype 19A Invasive Infections in Children from 1993 to 2011. J Clin Microbiol 2013; 51: 1294—1297.
2. Sauerbier J., Maurer P., Rieger M, Hakenbeck R. Streptococcus pneumoniae R6 interspecies transformation: genetic analysis of penicillin resistance determinants and genome-wide recombination events. Mol Microbiol 2012; 86: 692—706.
3. Albarracin Orio A.G., Pinas G.E., Cortes P.R., Cian M.B., Echenique J. Compensatory evolution of pbp mutations restores the fitness cost imposed by beta-lactam resistance in Streptococcus pneumoniae. PLoS Pathog 2011; 7: e1002000.
4. Chewapreecha C, Marttinen P., Croucher N.J., Salter S.J., Harris S.R., Mather A.E., Hanage W.P., Goldblatt D., Nosten F.H., Turner C. et al. Comprehensive identification of single nucleotide polymorphisms associated with beta-lactam resistance within pneumococcal mosaic genes. PLoS Genet 2014; 10: e1004547.
5. Reinert R, Jacobs M.R., Kaplan S.L. Pneumococcal disease caused by serotype 19A: review of the literature and implications for future vaccine development. Vaccine 2010; 28: 4249—4259.
6. Shin J., Baek J.Y., Kim S.H., Song JH., Ko K..S. Predominance of ST320 among Streptococcus pneumoniae serotype 19A isolates from 10 Asian countries. J Antimicrob Chemother 2011; 66: 1001—1004.
7. Moore M.R., Gertz R.E., Jr., Woodbury R.L., Barkocy-Gallagher G.A., Schaffner W., Lexau C., Gershman K., Reingold A., Farley M., Harrison L.H. et al Population snapshot of emergent Streptococcus pneumoniae serotype 19A in the United States, 2005. J Infect Dis 2008; 197: 1016—1027.
(gpx), гиалуронидазу (hyl), белки, участвующие в метаболизме 2-кето-3-дезоксиглюконата (kdg оперон), белки углевод-фосфотрансферазной транспортной системы (PTS оперон), а также гипотетические белки.
RegR снижает уровень экспрессии гиалуро-нидазы в клетке, являющейся фактором вирулентности, активирует адгезивную функцию у растущих бактерий при pH 7 и позитивно регулирует компетенцию [23]. Уменьшение активности гиалуронидазы ассоциируется с ослаблением вирулентности мутантов S.pneumoniae [18]. Таким образом, RegR может выполнять функцию настройки экспрессии генов вирулентности и компетентности, кульминацией данного процесса является оптимизированный ответ бактерии на специфические условия окружающей среды. Возможно, процесс развития резистентности к в-лактамам связан с изменением вирулентности S.pneumoniae. Для оценки этой гипотезы требуются дополнительные исследования.
Формирование резистентности к бета-лак-тамным антибиотикам у S.pneumoniae определяется не только модификацией ПСБ, но и адаптационными изменениями в метаболических путях, участвующих в росте делении бактериальной клетки. Дальнейший анализ изменений структуры белков, связанных с устойчивостью к бета-лактамам позволит выявить новые мишени для антибактериальных препаратов и пути преодоления резистентности.
Уведомление: Исследование выполнено за счёт гранта Российского научного фонда (проект №15-15-00185)
8. Beall B.W., Gertz R.E., Hulkower R.L., Whitney C.G., Moore M.R., Brueggemann A.B. Shifting genetic structure of invasive serotype 19A pneumococci in the United States. J Infect Dis 2011; 203: 1360—1368.
9. Vestrheim D.F., Steinbakk M, Aaberge I.S., Caugant D.A. Postvaccination increase in serotype 19A pneumococcal disease in Norway is driven by expansion of penicillin-susceptible strains of the ST 199 complex. Clin Vaccine Immunol 2012; 19: 443—445.
10. Croucher N.J., Finkelstein J.A., Pelton S.I., Mitchell P.K., Lee G.M., Parkhill J., Bentley S.D., Hanage W.P., Lipsitch M. Population genomics of post-vaccine changes in pneumococcal epidemiology. Nat Genet 2013; 45: 656—663.
11. Treangen T.J., Ondov B.D., Koren S, Phillippy A.M. The Harvest suite for rapid core-genome alignment and visualization of thousands of intraspe-cific microbial genomes. Genome Biol 2014; 15: 524.
12. Corander J., Marttinen P., Siren J., Tang /.Enhanced Bayesian modelling in BAPS software for learning genetic structures of populations. BMC Bioinformatics 2008; 9: 539.
13. Chewapreecha C, Harris S.R., Croucher N./., Turner C, Marttinen P., Cheng L, Pessia A., Aanensen D.M., Mather A.E., Page A./. et al. Dense genomic sampling identifies highways of pneumococcal recombination. Nat Genet 2014; 46: 305—309.
14. Mouz N, Di Guilmi A.M., Gordon E, Hakenbeck R, Dideberg O, Vernet T. Mutations in the active site of penicillin-binding protein PBP2x from Streptococcus pneumoniae. Role in the specificity for beta-lactam antibiotics. J Biol Chem 1999; 274: 19175—19180.
15. Pagliero E, Chesnel L, Hopkins /., Croize /., Dideberg O, Vernet T, Di Guilmi A.M. Biochemical characterization of Streptococcus pneumoniae penicillin-binding protein 2b and its implication in beta-lactam resistance. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48: 1848—1855.
16. De la Iglesia R, Valenzuela-Heredia D, Pavissich J.P., Freyhoffer S, Andrade S, Correa J.A., Gonzalez B. Novel polymerase chain reaction primers for the specific detection of bacterial copper P-type ATPases gene sequences in environmental isolates and metagenomic DNA. Lett Appl Microbiol 2010; 50: 552-562.
17. Noirclerc-Savoye M, Le Gouellec A., Morlot C, Dideberg O, Vernet T, Zapun A. In vitro reconstitution of a trimeric complex of DivIB, DivIC and FtsL, and their transient co-localization at the division site in Streptococcus pneumoniae. Mol Microbiol 2005; 55: 413—424.
18. Land A.D., Tsui H.C., Kocaoglu O, Vella S.A., Shaw S.L., Keen S.K., Sham L.T., Carlson E.E., Winkler M.E. Requirement of essential Pbp2x and GpsB for septal ring closure in Streptococcus pneumoniae D39. Mol Microbiol 2013; 90: 939—955.
19. Massidda O, Novakova L, Vollmer W. From models to pathogens: how much have we learned about Streptococcus pneumoniae cell division? Environ Microbiol 2013; 15: 3133—3157.
20. Massidda O, Anderluzzi D, FriedliL, Feger G. Unconventional organization of the division and cell wall gene cluster of Streptococcus pneumoniae. Microbiology 1998; 144 ( Pt 11): 3069—3078.
21. Miner Z, Schlagman S.L., Hattman S.Single amino acid changes that alter the DNA sequence specificity of the DNA-[N6-adenine] methyltransferase (Dam) of bacteriophage T4. Nucleic Acids Res 1989; 17: 8149—8157.
22. Fadda D, Santona A, D Ulisse V., Ghelardini P., Ennas M.G., Whalen M.B., Massidda O. Streptococcus pneumoniae DivlVA: localization and interactions in a MinCD-free context. J Bacteriol 2007; 189: 1288—1298.
23. Chapuy-RegaudS, OgunniyiA.D., DialloN, HuetY, Desnottes J.F., Paton J.C., Escaich S, Trombe M.C. RegR, a global Lacl/GalR family regulator,
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:
Цветкова Ирина Анатольевна — младший научный сотрудник отдела медицинской микробиологии и молекулярной эпидемиологии, Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт детских инфекций Федерального медико-биологического агентства», Санкт-Петербург Волкова Марина Олеговна — к.м.н., научный сотрудник отдела медицинской микробиологии и молекулярной эпидемиологии, Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт детских инфекций Федерального медико-биологического агентства», Санкт-Петербург
Калиногорская Ольга Серафимовна — к.м.н., научный сотрудник отдела медицинской микробиологии и молекулярной эпидемиологии, Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт детских инфекций Федерального медико-биологического агентства», Санкт-Петербург Беланов Сергей Сергеевич — научный сотрудник Института Биотехнологии Университета Хельсинки, Хельсинки, Финляндия
modulates virulence and competence in Streptococcus pneumoniae. Infect Immun 2003; 71: 2615-2625.
24. Contreras-Martel C, Dahout-Gonzalez C, Martins Ados S., Kotnik M, Dessen A. PBP active site flexibility as the key mechanism for beta-lactam resistance in pneumococci. J Mol Biol 2009; 387: 899—909.
25. Fadda D, Pischedda C, Caldara F., Whalen M.B., AnderluzziD, Domenici E, Massidda O. Characterization of divIVA and other genes located in the chromosomal region downstream of the dcw cluster in Streptococcus pneumoniae. J Bacteriol 2003; 185: 6209—6214.
26. Flardh K. Essential role of DivIVA in polar growth and morphogenesis in Streptomyces coelicolor A3(2). Mol Microbiol 2003; 49: 1523—1536.
27. Hamoen L.W., Meile J.C., de Jong W, Noirot P., Errington J. SepF, a novel FtsZ-interacting protein required for a late step in cell division. Mol Microbiol 2006; 59: 989—999.
28. Kabeya Y, Nakanishi H, Suzuki K, Ichikawa T, Kondou Y, Matsui M. Miyagishima S.Y. The YlmG protein has a conserved function related to the distribution of nucleoids in chloroplasts and cyanobacteria. BMC Plant Biol 2010; 10: 57.
29. Miyagishima S.Y., Wolk C.P., Osteryoung K.W. Identification of cyanobacterial cell division genes by comparative and mutational analyses. Mol Microbiol 2005; 56: 126—143.
30. Ramirez-Arcos S, Liao M, Marthaler S, Rigden M, Dillon J.A.. Enterococcus faecalis divIVA: an essential gene involved in cell division, cell growth and chromosome segregation. Microbiology 2005; 151: 1381—1393.
31. Ramos A., Honrubia M.P., Valbuena N, Vaquera J., Mateos L.M, Gil J.A. Involvement of DivIVA in the morphology of the rod-shaped actinomycete Brevibacterium lactofermentum. Microbiology 2003; 149: 3531—3542.
Гостев Владимир Валерьевич — к.б.н., научный сотрудник отдела медицинской микробиологии и молекулярной эпидемиологии, Федерального государственного бюджетного учреждения «НИИ детских инфекций Федерального медико-биологического агентства», Санкт-Петербург
Сидоренко Сергей Владимирович — д.м.н., профессор, ведущий научный сотрудник отдела медицинской микробиологии и молекулярной эпидемиологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт детских инфекций Федерального медико-биологического агентства»; профессор кафедры медицинской микробиологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Северо-Западного государственного медицинского университета имени И. И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской федерации, Санкт-Петербург.
