CC BY
46
15. Sztajzel, J. Heart rate variability: a noninvasive electrocardiographic method to measure the autonomic nervous system. Swiss Med. Wkly., 2004, vol. 134, no. 35-36, pp. 514-522.
16. Venugopalan P., Nair P. M., Koul R. L. An infant with seizure-related bradycardia and asystole. J. Paediatr. Child. Health, 2001, vol. 37, no. 1, pp. 6-7.
17. Yang T. F., Wong T. T., Chang K. P., Kwan S. Y., Kuo W. Y., Lee Y. C., Kuo T. B. Power spectrum analysis of heart rate variability in children with epilepsy. Childs Nerv. Syst., 2001, vol. 17, no. 10, pp. 602-606.
УДК 576.851.214
© Ю.Н. Урбан, Е.А. Воропаева, С.С. Афанасьев, В.А. Алешкин, А.В. Караулов, Е.А. Егорова, М.С. Афанасьев, Ю.В. Несвижский, А.В. Алешкин, А.Н. Оганесян, А.Д. Воропаев, 2014
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ, ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ И ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ ШТАММОВ STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE В ОЦЕНКЕ ИХ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЙ РОЛИ
Урбан Юлия Николаевна, научный сотрудник лаборатории клинической микробиологии и биотехнологии, ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, Россия, 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10, тел. : 8-926-181-05-60, e-mail: urbanek@mail.ru.
Воропаева Елена Александровна, кандидат биологических наук, заведующая лабораторией клинической микробиологии и биотехнологии, ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, Россия, 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10, тел. : 8-916-532-03-22, e-mail: voropaevaea2011@gmail.ru.
Афанасьев Станислав Степанович, доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ, заместитель директора, ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, Россия, 125212,
г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10, тел. : 8-903-667-20-68, е-mail: afanasievss409.4@bk.ru.
Алешкин Владимир Андрианович, доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ, директор, ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, Россия, 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10, тел. : 8-985-998-01-22, е-mail: info@gabrich.com.
Караулов Александр Викторович, член-корреспондент РАМН, профессор, доктор медицинских наук, заведующий кафедрой клинической аллергологии и иммунологии, ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Минздрава России, Россия, 119991, г. Москва, 54, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2, тел. 8-903-515-71-36, е-mail: drkaraulov@mail. ru.
Егорова Екатерина Александровна, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории клинической микробиологии и биотехнологии, ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, Россия, 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10, тел. : 8-916-594-69-89, e-mail: anaerob.lab@mail.ru.
Афанасьев Максим Станиславович, доктор медицинских наук, профессор кафедры клинической аллергологии и иммунологии, ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Минздрава России, Россия, 119991, г. Москва, ул. Трубецкая,
д. 8, стр. 2, тел. : 8-916-685-52-38, е-mail: mafa78@inbox.ru.
Несвижский Юрий Владимирович, доктор медицинских наук, профессор, декан медико-профилактического факультета, ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Минздрава России, Россия, 119991, г. Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2, тел. : 8-903-557-50-51, е-mail: nesviz@mail.ru.
Алешкин Андрей Владимирович, доктор биологических наук, магистр делового администрирования, руководитель лаборатории клинической микробиологии и биотехнологии бактериофагов, ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, Россия, 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10, тел. : (495) 452-18-16, е-mail: ava@gabri.ru.
Оганесян Айк Наириевич, младший научный сотрудник лаборатории клинической микробиологии и биотехнологии, ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, Россия, 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10, тел.: 8-916-964-00-11, e-mail: oganesyan.ayk@gmail.com.
Воропаев Александр Дмитриевич, младший научный сотрудник лаборатории клинической микробиологии и биотехнологии, ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, Россия, 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10, тел. : 8-916-598-14-12, e-mail: advoropaev@gmail.com.
Установлено, что отнесение изолятов одного серотипа или серогруппы к разным секвенс-типам свидетельствует о происходящих мутационных изменениях внутри серотипа и, как следствие, об изменении аллель-ного профиля циркулирующих изолятов Streptococcus pneumoniae. Принадлежность изолятов S. pneumoniae к общей кластерной группе свидетельствует о тесной эволюционной связи между изолятами, полученными от больных с бактериальным менингитом, и изолятами, полученными от носителей. Изоляты S. pneumoniae, вызывающие бактериальный гнойный менингит и встречающиеся у носителей, относились как к ранее определяемым секвенс-типам, циркулирующим на территории России, так и к ранее не зарегистрированным в нашей стране. Это свидетельствует о миграции штаммов определенных секвенс-типов с территорий других стран мира, в которых они встречаются. Обращает на себя внимание тот факт, что все четыре штамма S. pneumoniae, характеризующиеся перекрестной резистентностью к пенициллинам и макролидам относятся к секвенс-типам, ранее не зарегистрированным на территории России. В силу того, что уровень резистентности пневмококков к бета-лактамам и другим антибиотикам определяется формированием и селекцией мутаций в генах с мозаичной структурой, а также экспансией резистентных клонов, необходим постоянный мониторинг чувствительности к антибактериальным препаратам.
Ключевые слова: серотип, секвенс-тип, пневмококки, гены домашнего хозяйства, антибиотикочувст-вительность, антибиотикорезистентность.
MOLECULAR-GENETIC, PHENOTYPICAL AND PHYLOGENETIC PROPERTIES OF STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE STRAINS IN THE EXAMINATION OF THEIR EPIDEMIOLOGICAL ROLE
Urban Yuliya N., Research Associate, Moscow Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology n. a. N.G. Gabrichevsky, 10 Admiral Makarov St., Moscow, 125212, Russia, tel: 8-926-181-05-60, e-mail: urbanek@mail.ru.
Voropaeva Elena A., Cand. Sci. (Biol.), Head of Laboratory, Moscow Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology n. a. N.G. Gabrichevsky, 10 Admiral Makarov St., Moscow, 125212, Russia, tel: 8-916-532-03-22, e-mail: voropaevaea2011@gmail.ru.
Afanasiev Stanislav S., Dr. Sci. (Med.), Professor, Honored Scientist, Deputy Director, Moscow Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology n. a. N.G. Gabrichevsky, 10 Admiral Makarov St., Moscow, 125212, Russia, tel: 8-903-667-20-68, е-mail: afanasievss409.4@bk.ru.
Aleshkin Vladimir A., Dr. Sci. (Biol.), Professor, Honored Scientist, Director, Moscow Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology n. a. N.G. Gabrichevsky, 10 Admiral Makarov St., Moscow, 125212, Russia, tel: 8-985-998-01-22, е-mail: info@gabrich.com.
Karaulov Aleksandr V., Corresponding member of Russian Academy of Medical Sciences, Professor, Dr. Sci. (Med.), Head of Department, I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, 8 Trubetskaya St., bld. 2, Moscow, 119991, Russia, tel: 8-903-515-71-36, е-mail: drkaraulov@mail.ru.
Egorova Ekaterina A., Cand. Sci. (Med.), Senior Research Associate, Moscow Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology n. a. N.G. Gabrichevsky, 10 Admiral Makarov St., Moscow, 125212, Russia, tel: 8-916-594-69-89, e-mail: anaerob.lab@mail.ru.
Afanasiev Maxim S., Dr. Sci. (Med.), Professor of Department, I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, 8 Trubetskaya St., bld. 2, Moscow, 119991, Russia, tel: 8-916-685-52-38, е-mail: mafa78@inbox.ru.
Nesvizhsky Yury V., Dr. Sci. (Med.), Professor, Dean of the Faculty for Preventive Medicine, I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, 8 Trubetskaya St., bld. 2, Moscow, 119991, Russia, tel: 8-903-557-50-51, е-mail: nesviz@mail.ru.
Aleshkin Andrey V., Dr. Sci. (Biol.), MBA, Head of Laboratory, Moscow Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology n. a. N.G. Gabrichevsky, 10 Admiral Makarov St., Moscow, 125212, Russia, tel: (495) 452-18-16, е-mail: ava@gabri.ru.
Oganesyan Ayk N., Junior Research Associate, Moscow Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology n. a. N.G. Gabrichevsky, 10 Admiral Makarov St., Moscow, 125212, Russia, tel: 8-916-964-00-11, e-mail: oganesyan.ayk@gmail.com.
Voropaev Aleksandr D., Junior Research Associate, Moscow Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology n. a. N.G. Gabrichevsky, 10 Admiral Makarov St., Moscow, 125212, Russia, tel: 8-916-598-14-12, e-mail: advoropaev@gmail.com.
The article establishes that the assignment of isolates of one serotype or serogroup to the different sequence types indicates mutation changes inside the serotype, and, as a result, the change of allelic profile of Streptococcus pneumoniae circulating isolates. S. pneumoniae isolates belong to the general cluster group and it shows a close evolution connection between isolates, obtained from patients with bacterial meningitis and from carriers. S. pneumoniae isolates, causing bacterial purulent meningitis and sometimes occurring in carriers, belong to previously defined sequence types, circulating in Russia, and to the previously unregistered ones in Russia. This indicates strain migration of the certain sequence types from territories of other countries, where they occur. The most conspicuous fact is that all 4 S. pneumoniae strains characterized by cross-resistance to the penicillins and macrolides belong to sequence types previously unregistered in Russia. Since the pneumococcus resistance level to the betalactam and other antibiotics is determined by the formation and selection of mutations in the genes with exon-intron organization as well as expansion of the resistive clones it is necessary to regularly monitor antibiotic sensitivity to the antimicrobial medicines.
Key words: serotype, sequence-type, pneumococci, housekeeping genes, antibiotic susceptibility, antibiotic resistance.
Введение. Вид Streptococcus pneumoniae является одним из широко распространенных бактериальных патогенов, вызывающих как неинвазивные (отит, синусит, трахеит, бронхит, пневмония), так и инвазивные клинические формы инфекции (бактериальный менингит, первичная бактериемия у детей, спонтанный бактериальный перитонит, сепсис, перикардит, эндокардит, миозит, остеомиелит и др.) [12]. У детей доля пневмококковых менингитов составляет от 5 до 26 % всех случаев гнойных бактериальных менингитов [2]. При этом около 40 % населения являются носителями пневмококков. Уровень носительства S. pneumoniae в целом у населения варьирует в зависимости от эпидемических условий от 10 до 80 %, а у детей - от 20 до 50 %, но в условиях скученности и формирования новых детских коллективов может достигать 80 %. Высок уровень носительства в детских садах (до 70 %) и интернатах (до 86 %). Дети первых лет жизни являются основным резервуаром пневмококковой инфекции [3]. У S. pneumoniae описаны факторы вирулентности: полисахаридная капсула, протеаза секреторного иммуноглобулина (sIgA), пневмолизин, тейхоевые кислоты, фрагменты пептидогликана, поверхностный клеточный адгезин и аутолизин. Полисахаридная капсула (кодируется геном cpsA) проявляет антифагоцитарную активность, препятствующую комплемент-зависимому лизису бактерий, а также индуцирует воспалительный процесс. Различают более 90 серотипов S. рneumoniae (только около 15 серотипов являются причиной инвазивных заболеваний). Штаммы различных серотипов отличаются по способности вызывать различные формы инфекции, серотипы коррелируют с тяжестью клинических проявлений и летальностью при заболевании [14]. Пневмолизин (кодируется геном ply) - токсин, способный вызывать лизис клеток бронхиального эпителия, поражающий эндотелий легочных артерий, способный активировать систему комплемента по классическому пути, подавляющий «дыхательный взрыв» при фагоцитозе. Не связан с серотипом изолята [4]. Аутолизин (пеп-тидогликангидролаза) представляет собой холинсвязывающий протеин, нековалентно связанный с фосфорилхолином тейхоевой кислоты клеточной стенки (кодируется геном LytA). Основное участие аутолизина в патогенезе пневмококковой инфекции заключается в высвобождении пневмолизина и других агентов, повреждающих клеточную стенку. Поверхностные адгезины: пневмококковый адгезин A (рsаA), поверхностный пневмококковый протеин (pspA) - холинсвязывающий белок и пневмококковые поверхностные антигены А и С. Наличие в составе генома генов, кодирующих синтез факторов вирулентности: пневмолизина, аутолизина, капсулы и поверхностного протеина А (ply, lytA, cpsA и psaA, соответственно), указывает на принадлежность исследуемого изолята к виду S. pneumoniae. Эти гены являются специфическими маркерами видовой принадлежности [3, 4, 5, 12, 14].
Развитие у S. рneumoniae резистентности к препаратам пенициллинового ряда, а также к цефа-лоспоринам связывают со снижением аффинности пенициллин-связывающих белков (ПСБ) - ферментов (трансгликозилазы и транспептидазы). Различают шесть ПСБ: ПСБ с высокой молекулярной массой класса А (HMW class A - PBP1a, PBP1b и PBP2a), с высокой молекулярной массой класса B (HMW class B - PBP2x и PBP2b) и с низкой молекулярной массой (LMW PBPP3). Все перечисленные ПСБ имеют в своей структуре N-концевой пенициллин-связывающий домен, мутации в котором вы-
зывают снижение аффинности ПСБ к бета-лактамам и повышению их минимальных подавляющих концентраций (МПК) [12]. Наиболее выраженное снижение чувствительности клинических изолятов к бета-лактамам ассоциируется с мутационными изменениями PBPla, PBP2x и PBP2b, кодирующихся соответствующими генами: pbpla, pbp2x и pbp2b [12, 14]. У пенициллин-устойчивых (ПУ) или пенициллин-промежуточно-устойчивых (ППУ) штаммов S. рneumoniae имеется мозаичная структура генов pbpla, pbp2x и/ или pbp2b, которая является нормальной у пенициллин-чувствительных (ПЧ) изолятов. Наличие мутации в генах pbpla, pbp2x свидетельствует не только о принадлежности штамма к ППУ, но и о его сниженной чувствительности к цефалоспоринам третьего поколения [9]. У большей части клинических изолятов пневмококков, относящихся к ПУ, в геноме присутствуют аллели указанных генов с мозаичной структурой, содержащие фрагменты соответствующих генов родственных видов рода Streptococcus, в частности, Streptococcus mitis, что свидетельствует о возможности межвидового переноса генетического материала [14]. Резистентность к макролидам, регистрируемая у S. рneumoniae, обусловлена наличием в геноме островков ermA, ermB, mefA, а также мутациями в генах, кодирующих рибосомальные белки L4 и L22, а также в А2058 и А2059 домена V консервативного региона 23S rRNA [3, 7, 8, 12].
Цель: молекулярно-генетическая, фенотипическая и филогенетическая характеристика штаммов S. рneumoniae, выделенных от больных менингитами и от носителей.
Материалы и методы исследования. Исследовали 30 изолятов S. pneumoniae (16 изолятов были выделены у больных бактериальным менингитом из спинномозговой жидкости (СМЖ), 9 изолятов - у носителей из носоглотки, 5 штаммов взяты из музейной коллекции ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора). Контролями в проведении бактериологического теста на чувствительность к оптохину и теста на растворимость в желчи служили штаммы S. pneumoniae ATCC 49619 и S. mitis ATCC 49456.
Определение чувствительности изолятов к оптохину и тест на растворимость в присутствии солей желчных кислот, определение их серогрупп и серотипов, выделение ДНК для молекулярно-генетических исследований, выявление в составе генома генов факторов вирулентности, проведение типирования пневмококков, МЛСТ-анализ S. pneumoniae проводили согласно ранее описанной методологии [1].
Для определения чувствительности пневмококка к бета-лактамам проводили «скрининг» диско-диффузионным методом с дисками, содержащими 1 мкг оксациллина, а к эритромицину использовали аналогичный тест с дисками, содержащими 15 мкг эритромицина. Диаметры зон задержки роста измеряли с помощью линейки. Полученные результаты интерпретировали согласно международному стандарту CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute, USA) [6]. Для обнаружения трех генов ПСБ, генов mefA и ermB использовали праймеры и пробы, разработанные К. Ubukato и соавторами [13]. При наличии детекции всех трех генов ПСБ (pbp1a; pbp2x и pbp2b) штаммы считались генетически пенициллин-чувствительными (гПЧ); при отсутствии детекции всех трех генов штаммы считались генетически пенициллин-устойчивыми штаммами (гПУ); при отсутствии детекции одного или двух генов, из указанных, штаммы считались генетически пенициллин-промежуточно устойчивыми (гППУ). Наличие гена mefA и/или ermB свидетельствовало о генетической резистентности штаммов к макролидам [13].
Обработку полученных данных секвенирования проводили с использованием программы Sequence Output доступной на странице интернет-проекта Multi Locus Sequence Typing (MLST). Для построения филогенетического дерева использовался метод присоединения соседей (NJ) [11]. Построение дендеграммы осуществлялось с помощью программы MEGA5. Дополнительно проводился eBURST-анализ, позволяющий определить взаимоисключающие группы родственных генотипов в популяции и идентифицировать основателя группы генотипов.
Результаты исследования и их обсуждение. При культивировании изолятов на кровяном агаре наблюдался характерный S. pneumoniae рост в виде мелких, серых, плоских колоний с вдавленной центральной частью, окруженных характерной зоной а-гемолиза зеленого цвета. При окрашивании культур по Граму регистрировали грамположительные ланцетовидные диплококки, одиночные кокки или кокки в виде коротких цепочек.
Определение чувствительности к оптохину позволило предположительно идентифицировать 22 изолята из 23 как вид S. pneumoniae (табл. 1). Один изолят был устойчив к оптохину при зоне задержки роста < 14 мм. Зона задержки роста положительного контроля S. pneumoniae ATCC 49619 превышала 14 мм. Зона задержки роста у отрицательного контроля S. mitis ATCC 49456 равнялась 6 мм (диаметр диска). Мутность в пробирках с дезоксихолатом натрия исчезала в течение 10 мин у
всех 23 изолятов, что указывало на принадлежность всех изолятов к виду S. pneumoniae. В пробирке с суспензией культуры штамма S. pneumoniae ATCC 49619 (положительный контроль) наблюдалось исчезновение мутности, а в пробирке с суспензией штамма S. mitis ATCC 49456 (отрицательный контроль) мутность сохранялась. По результатам серотипирования/группирования шести изолятов S. pneumoniae принадлежали к группе 6 (6A/6B/6C), из них 3 изолята из СМЖ (серотипа 6A), 3 изоля-та из носоглотки (один серотипа 6А и два - 6B), 7 изолятов серотипа 19F (3 - из носоглотки, 4 - из СМЖ), 2 изолята серотипа 9N и 2 - серотипов 14 и 17F (по одному из СМЖ и носоглотки), 2 изолята серотипов 18С и 4 (из СМЖ). Музейные штаммы S. pneumoniae относились к серотипам 1, 4, 17F, 14 и 19F. Результаты молекулярно-генетического типирования изолятов S. pneumoniae с помощью мультиплексных ПЦР (полимеразная цепная реакция) были полностью сопоставимы с результатами типирования с применением классических методов. ПЦР-амплификация эпитопов генов пневмолизина (ply), аутолизина (lytA), поверхностного клеточного адгезина А (psaA) и полисахарида капсулы (cpsA) выявила один изолят отрицательный по ply (7515-серотип 6В) и один изолят отрицательный по psaA (19426-серотип 14). Отрицательные результаты ПЦР, вероятно, свидетельствуют либо об отсутствии указанных эпитопов у данных изолятов, либо о наличии мутационных изменений в эпито-пах, на участки которых ориентированы используемые в реакции олигонуклеотидные праймеры [14].
Таблица 1
Фенотипическая и молекулярно-генетическая характеристика изолятов S. pneumoniae_
П/н Штамм Место выделения Серотип Опто хин Соли желчных кислот Гены патогенности
ПЦР Сероти-пирова-ние ply lytA psaA cpsA
1 794/1 носоглотка 19F 19F + +
2 55/1 носоглотка 6А/6В/6С 6В + + + + + +
3 264 носоглотка 17F 17F + + + + + +
4 48/4 носоглотка 9N/9L 9N + + + + + +
5 7515 носоглотка 6А/6В/6С 6B - + - + + +
6 20336 носоглотка 6А/6В/6С 6A + + + + + +
7 19426 носоглотка 14 14 + + + + - +
8 8997 носоглотка 19F 19F + + + + + +
9 9804 носоглотка 19F 19F + + + + + +
10 10 СМЖ 17F 17F + + + + + +
11 1934 СМЖ 19F 19F + + + + + +
12 118 СМЖ 18A/B/C/F 18C + + + + + +
13 143 СМЖ 9N/9L 9L + + + + + +
14 12.28 СМЖ 19F 19F + + + + + +
15 12.26 СМЖ 4 4 + + + + + +
16 12.29 СМЖ 14 14 + + + + + +
17 12.23 СМЖ 6А/6В/6С 6A + + + + + +
18 12.21 СМЖ 6А/6В/6С 6A + + + + + +
19 12.19 СМЖ 4 4 + + + + + +
20 12.24 СМЖ 7B 7B + + + + + +
21 12.27 СМЖ 20 20 + + + + + +
22 97 СМЖ 1 1 + + + + + +
23 140 СМЖ 6А/В/С 6А + + + + + +
24 69 СМЖ 19F 19F + + + + + +
25 72 СМЖ 19F 19F + + + + + +
26 ST 1 музей 1 1 + + + + + +
27 ST 4 музей 4 4 + + + + + +
28 ST 17F музей 17F 17F + + + + + +
29 ST 14 музей 14 14 + + + + + +
30 ST 19F музей 19F 19F + + + + + +
Примечания: СМЖ - спинномозговая жидкость; ply - ген пневмолизина; lytA - ген аутолизина; psaA - ген поверхностного пневмококкового адгезина А; cpsA - ген полисахарида капсулы; ПЦР - полимеразная цепная реакция
По результатам определения генетической пенициллин-устойчивости было определено, что 4 штамма являются гПУ, при этом 3 штамма были выделены из носоглотки, а 1 штамм был выделен из СМЖ (табл. 2). Эти штаммы также являлись позитивными по mefA и ermB. Одновременное наличие генов ermB и mefA приводит к перекрестной резистентности к макролидам, линкозамидам и стрептограминам В (MLSb - фенотип) [8, 10]. К гППР относились 7 штаммов: 3 штамма были негативны по pbpla + pbp2x (выделены из СМЖ), 4 штамма были негативны по pbp2x (2 штамма были выделены из СМЖ, а 2 штамма были взяты из коллекции). Однако 3 штамма (12.24, St 1, St 14), негативные по pbp2x, оказались чувствительными при исследовании in vitro к оксацилину. Возможно, наличие мутации в этом гене не всегда определяет устойчивость к антибиотикам пенициллинового ряда. Все штаммы, охарактеризованные как генетически резистентные к макролидам, оказались устойчивы к эритромицину при проведении оценки чувствительности стандартным дискодиффузион-ным методом и относились к серотипам 6А, 14 и 19 F, наиболее ассоциированным с антибиотико-устойчивостью. Следовательно, среди исследованных изолятов нет широкого распространения пенициллин-устойчивых штаммов, так как они составляют 13 % от их общего числа. Более распространенными являются изоляты с промежуточной пенициллин-устойчивостью, их доля составляет 23 %.
Таблица 2
Определение серогрупп/серотипов, секвенс-типов и антибиотикочувствительности изолятов S. pneumoniae_
Штамм Место выделения Серотип Сек-венс-тип Чувствительность к пенициллинам Чувствительность к макролидам
Генетическая чувствительность Диски с ок-саци-лином (ДДМ) Генетическая резистентность Диски с эрит-роми-цином (ДДМ)
1 2 3 4 5 6 7 8
794/1 носоглотка 19F 423 гПЧ Ч Ч Ч
55/1 носоглотка 6А/6В/6С 490 гПЧ Ч Ч Ч
264 носоглотка 17F 7196 гПЧ Ч Ч Ч
48/4 носоглотка 9N 3104 гПЧ Ч Ч Ч
7515 носоглотка 6B 146 гПЧ Ч Ч Ч
20336 носоглотка 6A 473 гПУ (не выявлены pbp 1 a-pbp2x-pbp2b) У У (выявлены ermB+mefA) У
19426 носоглотка 14 1227 гПУ (не выявлены pbp 1 a-pbp2x-pbp2b) У У (выявлены ermB+mefA) У
8997 носоглотка 19F 423 гПЧ Ч Ч Ч
9804 носоглотка 19F 320 гПУ (не выявлены pbp 1 a-pbp2x-pbp2b) У У (выявлены ermB+mefA) У
10 СМЖ 17F 4841 гППУ (не выявлены рbp1a-pbp2x) У Ч Ч
1934 СМЖ 19F 320 гПУ (не выявлены pbp 1 a-pbp2x-pbp2b) У У (выявлены ermB+mefA) У
118 СМЖ 18C 3750 гПЧ Ч Ч Ч
143 СМЖ 9L 517 гПЧ Ч Ч Ч
12.28 СМЖ 19F 239 гПЧ Ч Ч Ч
12.26 СМЖ 4 246 гПЧ Ч Ч Ч
12.29 СМЖ 14 2436 гПЧ Ч Ч Ч
12.23 СМЖ 6A 473 гПЧ Ч Ч Ч
12.21 СМЖ 6A 473 гПЧ Ч Ч Ч
12.19 СМЖ 4 246 гПЧ Ч Ч Ч
12.24 СМЖ 7B 1176 гППУ (не выявлены pbp2x) Ч Ч Ч
12.27 СМЖ 20 235 гПЧ Ч Ч Ч
97 СМЖ 1 2779 гПЧ Ч Ч Ч
1 2 3 4 5 6 7 8
140 СМЖ 6А 473 гППУ (не выявлены pbp2x) У Ч Ч
69 СМЖ 19F 230 гППУ (не выявлены pbp1a-pbp2x) У Ч Ч
72 СМЖ 19F 230 гППУ (не выявлены pbp1a-pbp2x) У Ч Ч
ST 1 музей 1 5633 гППУ (не выявлены pbp2x) Ч Ч Ч
ST 4 музей 4 244 гПЧ Ч Ч Ч
ST 17F музей 17F 392 гПЧ Ч Ч Ч
ST 14 музей 14 124 гППУ (не выявлены pbp2x) Ч Ч Ч
ST 19F музей 19F 5661 гПЧ Ч Ч Ч
Примечания: СМЖ - спинномозговая жидкость; гПЧ - генетическая пенициллин-чувствительность; гПУ - генетическая пенициллин-устойчивость; гППЧ - генетическая пенициллин-промежуточная устойчивость; ДДМ - диско-диффузионный метод; СТ - секвенс-тип; Ч - чувствительный; П - промежуточно устойчивый; У - устойчивый
В результате проведенного МЛСТ участков семи генов «домашнего хозяйства» aroE, gdh, gki, recP, spi, xpt и ddl исследуемых изолятов S. pneumoniae были сформированы аллельные профили и определены СТ по каждому профилю (табл. 2). Для 30 изолятов были определены 23 СТ. На основании различий аллельных профилей полученных СТ была построена дендрограмма для исследуемых изолятов с использованием метода связывания ближайших соседей (NJ), отображающая истинное эволюционное расстояние между штаммами (рис.). Все 30 изолятов S. pneumoniae являлись близкородственными и составляли единую дендрограмму. Внутри данной дендрограммы изоляты были распределены на 5 кластеров. За исключением кластера III, во все другие кластеры входили как ПУ штаммы, так и ПЧ штаммы. Кластер I являлся самым многочисленным (n = 10), его можно было охарактеризовать как разнородный, в который входили штаммы 12.23, 12.21 из СМЖ, а также пенициллин и макролидоустойчивый изолят 20336 из носоглотки, которые были отнесены к единому сероти-пу 6А и единому СТ 473. Также к данному кластеру относились изолят 12.24 из СМЖ (СТ 1176) и музейный штамм ST 1 (СТ 5633), которые были охарактеризованы как ППУ. Изоляты из носоглотки 794/1 и 8997 (СТ 423) и изоляты из СМЖ 12.28 (СТ 239), 12.24 (СТ1176), 97 (СТ 2779) были отнесены к ПУ. Кластер III был характерен тем, что в него входили изоляты как из СМЖ, так и из носоглотки с различной степенью пенициллин-устойчивости. Изолят 1934 из СМЖ и штамм 9804 из носоглотки, относящиеся к единому серотипу 19F и CT 320, были охарактеризованы как ПУ и макролидоустой-чивые штаммы, а изоляты 69 и 72 из СМЖ, относящиеся к СТ 230, и штамм 10 (СТ 4841) являлись ППУ. Следует отметить, что кластер III имел общий узел как с кластером I, так и кластером II, в который входили штаммы 4-го серотипа из СМЖ - 12.26, 12.19 (СТ 246) и ST4 (СТ244), для которых была характерна ПЧ. Кластер V был расположен на отдельной ветви, что свидетельствует о его эволюционном расхождении с другими кластерами. В данный кластер входили как штамм из СМЖ 12.27 (СТ 235), так и изолят из носоглотки 19426 (СТ 1227), который являлся ПУ и макролидоустойчивым, а также и ПЧ штамм 7515 (СТ 146). Дополнительное проведение анализа аллельного профиля СТ в алгоритме eBURST позволило сформировать 2 клональных комплекса. В первый клональный комплекс входили СТ 31044 (штамм 48/4 из носоглотки) и СТ 517 (штамм 143 из СМЖ). Во второй кло-нальный комплекс были включены СТ 246 (штаммы 12.26 и 12.29 из СМЖ) и СТ 244 (музейный штамм ST 4). При анализе базы данных MLST и ранее полученных СТ в сравнении с выявленными СТ S. pneumoniae установлено, что в России ранее встречались только 7 СТ из идентифицированных (423, 3104, 4841, 2724, 2729, 230 и 239 СТ), причем 3 из них (2724, 3104 и 4841) регистрировались только в России (табл. 3). СТ 7196 серотипа 35С был выявлен ранее только в Дании, СТ 1227 серотипа 14 - в Швейцарии, СТ 3750 серотипа 20 - в Египте и СТ 2436 серотипа 14 - в Великобритании. Встречаемость других СТ представлена повсеместно в разных странах мира как СТ разных сероти-пов, так и СТ определенного серотипа при различных патологиях дыхательных путей, менингитах, бактериемиях, заболеваниях глаз и ушей. Часть выявленных СТ (490, 146, 7196, 473, 1227, 1176, 235, 320, 3750, 517, 246 и 2436) ранее не были зарегистрированы в России.
Таблица 3
Данные о встречаемости выявленных секвенс-типов S. pneumoniae в странах мира_
№ изо- Серотип Секвенс- Встречаемость в странах мира
тип изолята
лята изолята Страна Cеротип Место выделения
1 2 3 4 5 6
Польша 19F носоглотка, СМЖ
Чехия 19F СМЖ, кровь, носоглотка
794/1 и 8997 9N кровь
19F 423 Германия 19F мокрота, кровь
19A кровь
Великобритания 19F носоглотка
Россия 19F СМЖ, носоглотка
Германия кровь, носоглотка, плевра, мокрота
Греция носоглотка, ухо
Польша СМЖ, носоглотка, кровь
55/1 6А/6В/6С 490 Финляндия 6A носоглотка, ухо
Болгария носоглотка
Гренландия носоглотка
США кровь
Исландия 6В не установлено
264 17F 7196 Дания 35С не установлено
48/4 9N/9L 3104 Россия 9N носоглотка
США ухо, кровь, носоглотка
Чехия кровь, легочный аспират
7515 146 Новая Зеландия 6В кровь
Исландия кровь
Германия носоглотка
Великобритания СМЖ
Австралия 6А, 6В кровь, СМЖ
6B/ 6А Великобритания носоглотка
Греция носоглотка
20336, 12.23 12.21 140 Венгрия 6А плевра
Италия носоглотка, СМЖ
473 Индия не установлено
США 6B, 6C, 19A ухо, кровь, носоглотка
Германия 6A, 15B, 10A, 23F кровь
Литва 6B не установлено
19426 14 1227 Швеция 14 носоглотка
Австралия кровь
Гонконг 19F мокрота
Корея кровь
Польша глаз, мокрота, СМЖ
Германия 19F, 19A мокрота, среднее ухо, плевральная жидкость, аспират трахеи, кровь
Китай мокрота
9804 и 19F 320 Южная Корея ухо, аспират из трахеи, мокрота, зев, кровь
1934 США носоглотка, легкое, перитонеальный аспират
Китай 19A носоглотка, мокрота, глаз, СМЖ
Венесуэла носоглотка
Италия кровь, носоглотка
Испания ухо, глаз, кровь, СМЖ, плевральная
жидкость, синовиальная жидкость
Малайзия кровь, плевральная жидкость, ухо
Греция ухо, нос
1 2 3 4 5 6
10 17F 4841 Россия 23F мокрота
118 18C 3750 Египет 20 СМЖ
Финляндия 9 N носоглотка
143 9L 517 Германия СМЖ
Чехия 9V кровь
Великобритания 6 кровь
Венгрия 9V плевральный аспират
Польша СМЖ, мокрота
12.28 19F 239 Польша 20 СМЖ
Россия 9V/9A аспират околоносовых пазух
Россия 22 СМЖ
Чехия 9V кровь
12.26 12.19 Великобритания СМЖ
4 246 Франция 4 кровь
Япония кровь
12.29 14 2436 Великобритания 14 кровь
12.24 7B 1176 США 12F кровь
Германия 7F кровь
Испания 20 СМЖ
12.27 20 235 Польша
Австрия 7С мокрота
97 1 2724 Россия 6 носоглотка
69 и 72 19F 230 Россия 19F кровь
Strain 12.27
Рис. М дендрограмма попарных различий в аллельных профилях, с суммой длины ветви равной 0,07796872. Бустрэп анализ равен 100. Эволюционные расстояния были рассчитаны с использованием метода максимального правдоподобия
V
0.001
Заключение. Таким образом, МЛСТ-анализ выявил принадлежность изолятов к 22 секвенс-типам. Отнесение изолятов одного серотипа или серогруппы к разным СТ свидетельствует о происходящих мутационных изменениях внутри серотипа и, как следствие, об изменении аллельного профиля циркулирующих изолятов S. pneumoniae. Принадлежность изолятов S. pneumoniae к общей кластерной группе свидетельствует о тесной эволюционной связи между изолятами, полученными от больных с бактериальным менингитом и от носителей. Изоляты S. pneumoniae, вызывающие бактериальный гнойный менингит и встречающиеся у носителей, относились как к ранее определяемым СТ, циркулирующим на территории России, так и к ранее не зарегистрированным в России. Это свидетельствует о миграции штаммов определенных СТ с территорий других стран мира, в которых они встречаются. Обращает на себя внимание тот факт, что все 4 штамма S. pneumoniae, характеризующиеся перекрестной резистентностью к пенициллинам и макролидам, относятся к СТ, ранее не зарегистрированным на территории России. В силу того, что уровень резистентности пневмококков к бе-та-лактамам и другим антибиотикам определяется формированием и селекцией мутаций в генах с мозаичной структурой, а также экспансией резистентных клонов, необходим постоянный мониторинг их чувствительности к антибактериальным препаратам.
Список литературы
1. Алешкин, В. А. Молекулярно-генетическая и филогенетическая характеристика штаммов Streptococcus pneumoniae, выделенных от больных менингитом и носителей / В. А. Алешкин, А. В. Караулов, В. В. Слободенюк, С. С. Афанасьев, Ю. Н. Урбан, Е. А. Воропаева // Журнал микробиологии, эпидемиологии и имунобиологии. - 2013. - № 5. - С. 53-60.
2. Белошицкий, Г. В. Пневмококковые менингиты в Российской Федерации / Г. В. Белошицкий, И. С. Королева, Н. И. Кошкина // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2009. - № 21. - C. 6-10.
3. Козлов, Р. С. Пневмококки : прошлое, настоящее и будущее / Р. С. Козлов. - Смоленск : Смоленская государственная медицинская академия. - 2005. - 128 c.
4. Костинов, М. П. Вакцинопрофилактика пневмококковых инфекций и гриппа при аутоиммунных заболеваниях / М. П. Костинов, А. А. Тарасова. - М. : Издательско-полиграфическая группа «МДВ», 2009. -250 с.
5. Balachandran, P. The autolytic enzyme Lyt A of Streptococcus pneumoniae is not responsible for realizing pneumolysin / P. Balachandran, S. K. Hollingshaed, J. C. Paton, D. E. Briles // J. Bacteriol. - 2001. - Vol. 183, № 10. -Р. 3108-3116.
6. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance Standards for Antimicrobial susceptibility testing. Twenty-third Informational Supplement. (CLSI document M100-S23) - Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2013.
7. Klugman, K. P. The successful clone : the vector of dissemination of resistance in Streptococcus pneumonia / K. P. Klugman // Antimicrob Chemother. - 2002. - Vol. 50. - Р. 1-5.
8. Leclercq, R. Mechanisms of resistance to macrolides and lincosamides: nature of the resistance elements and their clinical implications / R. Leclercq // Clin. Infect. Dis. - 2002. - Vol. 34, № 4. - P. 482-492.
9. Leggiadro, R. J. Penicillin-nonsusceptible Pneumococcus / R. J. Leggiadro // Int. J. Antimicrob. Agents. -2000. - Vol. 14, № 2. - P. 123-127.
10. McGee, L. Serotype 19F multiresistant pneumococcal clone harbouring two erythromycin resistance determinants (erm(B) and mef(A)) in South Africa / L. McGee, K. P. Klugman, A. Wasas T. Capper, A. Brink // Antimicrob. Agents Chemother. - 2001. - Vol. 45, № 5. - P. 1595-1598.
11. Saitou, N. The neighbor-joining method : a new method for reconstructing phylogenetic trees / N. Saitou, M. Nei // Mol. Biol. Evol. - 1987 - Vol. 4, № 4. - P. 406-425.
12. Tuomanen, E. I. The Pneumococcus / E. I. Tuomanen, T. J. Mitchell, D. A. Morrison, B. G. Spratt. - Washington : D.C. ASM PRESS, 2004. - 427 p.
13. Ubukato, K. Application of the Real-Yime PCR Method for genotypic identification of ß-lactam risistance in isolates from invasive pneumococcal diseases / K. Ubukato, M. Morozum, N. Chiba // Microbial Drug Risstance. -2011 - Vol. 10 - P. 1-8.
14. WHO MANUAL, 2nd EDITION. Laboratory Methods for the Diagnosis of Meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenza // WHO/IVB. 11.09. -2011.
References
1. Aleshkin V. A., Karaulov A. V., Slobodenyuk V. V., Afanasiev S. S., Urban Yu. N., Voropaeva E. A. Mole-kuljarno-geneticheskaja i filogeneticheskaja harakteristika shtammov Streptococcus pneumoniae, vydelennyh ot bol'nyh meningitom i nositelej [Molecular-genetic and phylogenetic characteristics of Streptococcus pneumonia strains isolated from meningitis patients and carriers]. Zhurnal microbiologii, epidemiologii i immunobiologii [Jounal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology], 2013, no. 5, рр. 53-60.
2. Beloshitsky G. V., Koroleva I. S., Koshkina N. I. Pnevmokokkovye meningity v Rossijskoj Federacii [Pneumococcus meningitis in the Russian Federation]. Jepidemiologija i vakcinoprofilaktika [Epidemiology and Vaccinal Prevention], 2009. no. 21, pp. 6-10.
3. Kozlov, R. S. Pnevmokokki: proshloe, nastojashhee i budushhee [Pnuemococcus: past, present and future]. Smolensk, Smolensk State Medical Academy, 2005, 128 p.
4. Kostinov M. P. Vakcinoprofilaktika pnevmokokkovyh infekcij i grippa pri autoimmunnyh zabolevanijah [Vaccine prevention of pneumococcal infections and influenza for autoimmune diseases]. Moscow, Izdatel'sko-poligraficheskaja gruppa "MDV" [Publications and Printing group "MDV"], 2009, 250 p.
5. Balachandran P., Hollingshaed S. K., Paton J. C., Briles D. E. The autolytic enzyme Lyt A of Streptococcus pneumoniae is not responsible for realizing pneumolysin. J. Bacteriol, 2001, vol. 183, no. 10, pp. 3108-3116.
6. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance Standards for Antimicrobial susceptibility testing. Twenty-third Informational Supplement. (CLSI document M100-S23). Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2013.
7. Klugman K. P. The successful clone: the vector of dissemination of resistance in Streptococcus pneumonia. Antimicrob Chemother, 2002, vol. 50, pp. 1-5.
8. Leclercq R. Mechanisms of resistance to macrolides and lincosamides: nature of the resistance elements and their clinical implications. Clin. Infect. Dis., 2002, - vol. 34, no. 4, pp. 482-492.
9. Leggiadro R. J. Penicillin-nonsusceptible Pneumococcus. Int. J. Antimicrob. Agents, 2000, vol. 14, no. 2, pp. 123-127.
10. McGee L., Klugman K. P., Wasas A., Capper T., Brink A. Serotype 19F multiresistant pneumococcal clone harbouring two erythromycin resistance determinants (erm(B) and mef(A)) in South Africa. Antimicrob. Agents Chemother, 2001, vol. 45, no. 5, pp. 1595-1598.
11. Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol, 1987, vol. 4, no. 4, pp. 406-425.
12. Tumanen E. I., Mitchel T. J., Morrison D. A., Spratt B. G. The Pneumococcus. Washington, D.C. ASM PRESS, 2004, 427 p.
13. Ubukato K., Morozum M., Chiba N. Application of the Real-Yime PCR Method for genotypic identification of ß-lactam risistance in isolates from invasive pneumococcal diseases. Microbial Drug Risstance, 2011, vol. 10, pp. 1-8.
14. WHO MANUAL, 2nd EDITION. Laboratory Methods for the Diagnosis of Meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenza. WH0/IVB.11.09. 2011.
