CC BY
14
УДК 616.24 - 002.363
ПРИМЕНЕНИЕ МУЛЬТИЛОКУСНОГО СЕКВЕНСТИПИРОВАНИЯ ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА ШТАММОВ STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE, ВЫДЕЛЕННЫХ У ПАЦИЕНТОВ ПОЖИЛОГО ВОЗРАСТА С ВНЕБОЛЬНИЧНЫМИ ПНЕВМОНИЯМИ
А.В. Мартынова1, Л.А. Балабанова, О.А. Чулакова
1 Мартынова Алина Викторовна, кафедра эпидемиологии и военной эпидемиологии ТГМУ. Тел.: +8-914701-69-08. E-mail clinmicro@yandex. ru.
Тихоокеанский государственный медицинский университет, Дальневосточный федеральный университет,
Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова
Внебольничные пневмонии у лиц пожилого возраста являются значимой эпидемиологической проблемой для здравоохранения практически всех стран. Особенно актуальна проблема микробиологического мониторинга и эпидемиологического надзора за штаммами S.pneumoniae как одного из убиквитарных (повсеместных) возбудителей, вызывающих внебольничные пневмонии и другие инфекции дыхательных путей. Мультилокусное сиквенс-типирование является перспективным методом молекулярно-эпидемиоло-гического мониторинга, позволяющего идентифицировать эпидемически опасные клоны такого возбудителя, как S.pneumoniae. Все штаммы, выделенные у пациентов с внебольничной пневмонией, ХОБЛ и у носителей пожилого возраста, представляют собой родственные изоляты вида Streptococcus pneumoniae, большинство из которых обладают уникальным генотипом, определяющим наличие одного секвенс-типа для каждого штамма. Мультило-кусное сиквенстипирование позволяет идентфицировать новые генотипы и дать прогноз относительно появления эпидемически опасных штаммов с новыми свойствами.
Ключевые слова: мультилокусное сиквенстипирование, пневмококковые пневмонии, внебольничные пневмонии, S.pneumoniae
APPLICATION OF MULTILOCUS SEQUENCING FOR MOLECULAR EPIDEMIOLOGICAL MONITORING STRAINS STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE, ISOLATED ELDERLY PATIENTS WITH CAP
А.V. Маrtynova1, LA. Balabanova, О.А. Chulakova
1 Martynova Älina Victorovna, Department of Epidemiology and Military Epidemiology of Pacific State Medical University. Tel.: +8-914-701-69-08. E-mail: clinmicro@yandex.ru.
Pacific State Medical University, Far Eastern Federal University,
Pacific Institute of Bioorganic Chemistry named after G.B. Elyakov
Community-acquired pneumonia in the elderly are an important epidemiological health problem of almost all countries. Particularly urgent is the problem of microbiological monitoring and surveillance for strains S.pneumoniae, as one of the ubiquitous (everywhere) pathogens causing community-acquired pneumonia and other respiratory infections. Multilocus sequencing is a promising method for molecular epidemiological monitoring to identify epidemiologically dangerous pathogen clones such as S.pneumoniae. All strains isolated from patients with community-acquired pneumonia, COPD and in carriers older age represent isolates related species Streptococcus pneumoniae, most of which have a unique genotype determines the presence of a Sequence type for each strain. Multilocus sequencing allows new genotypes have been identified, and to forecast the relative occurrence of infectious strains with new properties. Key words: streptocc pneumonia, multilocus sequence
Несмотря на все возрастающее внимание к проблеме инфекций дыхательных путей, вне-больничные пневмонии до сих пор занимают лидирующие позиции в структуре заболеваемости органов дыхания практически во всех возрастных группах населения. Нельзя не отметить чрезвычайную актуальность этой проблемы у лиц пожилого возраста [1-3]. Распространенность внебольничных пневмоний среди лиц пожилого и старческого возраста в Москве составляет 17,4%о, а в США - 20-400. По данным американских и европейских врачей, у пожилых людей заболеваемость внебольничной пневмонией в 2 раза выше, чем у лиц молодого возраста; частота госпитализаций при этом заболевании с возрастом увеличивается более чем в 10 раз. Летальность при пневмонии среди больных старше 60 лет в 10 раз выше, чем в других возрастных группах, и достигает 10-15% при пневмококковых пневмониях [4]. Учитывая тот факт, что S.pneumoniae является одним из основных возбудителей внебольничных пневмоний в других возрастных группах, а носительство этого возбудителя чрезвычайно распространено, значимость эпидемиологических исследований в отношении именно пневмококковых пневмоний у лиц пожилого возраста представляется более чем актуальной [5-7].
Основными проблемами, наиболее значимыми в практическом здравоохранении и требующими практической доработки, в отношении пневмококковых пневмоний у пожилых лиц являются организация контроля за распространением антибиотикорезистентных изолятов, а также молекулярно-эпидемиологический мони-
торинг выделяемых изолятов, основанный на ге-нотипировании, так как именно он позволяет получить стандратизованную информацию о распространении того или иного изолята, сравнить полученную информацию о выявляемых штаммах. S.pneumoniae и соответственно планировать профилактические мероприятия в отношении пневмококковой инфекции.
Одним из методов молекулярно-эпидемиоло-гического мониторинга является мультилокус-ное секвенстипирование, которое будучи более дискриминирующим методом по сути (так как основано на исследовании вариабельности фрагментов (по 500 кб) 7 пар аллельных генов пневмококка), позволяет создать фактически индивидуальный аллельный профиль каждого штамма, и в том числе охарактеризовать эпидемическую значимость штаммов пневмококка в развитии внебольничной пневмонии [8].
Цель: оценить при помощи метода мультило-кусного секвенстипирования распространение эпидемически значимых штаммов Streptococcus pneumoniae у пациентов пожилого возраста с внебольничной пневмонией и определить доминирующий генотип.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Поскольку одной из наиболее значимых эпидемических характеристик является устойчивость возбудителей к антибактериальным химиопрепаратам, в том числе и полирезистентность, в исследование были взяты полирезистентные штаммы и штаммы пневмококка, выделенные у пациентов пожилого возраста с внебольничными пневмониями (1-я группа, 14 штаммов: 7 полирезистентных и 7 чувствительных к антибиотикам). В качестве контроля были
полирезистентные штаммы, выделенные у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких (2-я группа,8 штаммов, поровну чувствительных и полирезистентных) и у носителей (n = 4). Полирезистентность - устойчивость штаммов пневмококка к пенициллину и эритромицину.
Мультилокусное секвенстипирование проведено согласно методике M.C. Enright и B.G. Spratt (1998). Праймеры, использованные в исследовании: ddl-up, 5' TGCC/TCAAGTTCCTTATGTGG, и ddl-dn, 5' CACTGGGTG/AAAACCA/TGGCAT;
gdh-up, 5' ATGGACAAACCAGCNAGC/TTT, и gdh-dn, 5' GCTTGAGGTCCCATG/ACTNCC;
gki-up, 5' GGCATTGGAATGGGATCACC, и gki-dn, 5' TCTCCCGCAGCTGACAC;
recP-up, 5' GCCAACTCAGGTCATCCAGG, и recP-dn, 5' TGCAACCGTAGCATTGTAAC;
spi-up, 5' TTATTCCTCCTGATTCTGTC, и aspi-dn, 5' GTGATTGGCCAGAAGCGGAA;
xpt-up, 5' TTATTAGAAGAGCGCATCCT, и xpt-dn, 5' AGATCTGCCTCCTTAAATAC.
В связи с общепринятым в мировой практике эпидемиологического надзора за пневмококковой инфекцией использованием метода серотипирования, мы применили эту методику с целью получения контрольных данных для сопоставления с данными, полученными при мультилокусном секвенстипировании. Все штаммы были серотипированы согласно общепринятой методике с использованием Pneumotest panel (Statens Seruminstitut, Копенгаген, Дания); се-ротипы, не включенные в панель, были идентифицированы в институте Statens Seruminstitut (Дания) [9].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для изучения возможности формирования госпитального полирезистентного штамма S. pneumoniae, происходящего из единого клона, мы провели мультилокусное секвенстипирование популяций штаммов пневмококка, выделенных в различных биотопах и обладающих различной антибактериальной резистентностью, и сравнили популяции полирезистентных и в равном количестве взятых изолятов, выделенных при вне-больничных пневмониях (всего 14 штаммов: 7 штаммов, устойчивых к пенициллину и эритромицину, а также 7 штаммов, чувствительных к антибактериальным химиопрепаратам), штаммов, выделенных у пациентов с хроническим об-структивным бронхитом (8 штаммов: 4 штамма, устойчивые к пенициллину и эритромицину, и 4 штамма, чувствительные к антибактериальным химиопрепаратам), штаммов, выделенных
ST-1.1
_ST-4
__ST-13
- -ST-3.1
---ST-10
---ST-7
-ST-14
ST-2
- _ST-8.1
__ST-11.1
_ST-5.1
-ST-6.1
-ST-12
-ST-9.1
Рис. 1. Результаты мультилокусного секвенстипиро-вания (MLST) штаммов S.pneumoniae, выделенных у пациентов с внебольничной пневмонией (нумерация штаммов «.1» — полирезистентные штаммы, без расширения «.1» — чувствительные к антибиотикам штаммы), всего 14 штаммов.
у носителей (2 штамма, чувствительные к антибактериальным химиопрепаратам, и 2 штамма, не чувствительные к антибактериальным химиопрепаратам). Всего исследовано 26 штаммов.
Таким образом, при анализе изучаемой нами популяции микроорганизмов, возбудителей пневмококковых инфекций, выделенных у больных 1-й группы (штаммы, выделенные у пациентов с внебольничными пневмониями), 2-й группы (штаммы, выделенные у пациентов с хроническим обструктивным бронхитом) и 3-й группы (штаммы, выделенные у носителей) — методом мультилокусного секвенстипирования было выявлено, что штаммы всех трех популяций представляют собой родственные изоляты вида Streptococcus pneumoniae, большинство из которых (18 из 26) обладают уникальным генотипом, определяющим наличие одного секвенстипа для каждого штамма.
При этом можно выделить 6 кластерных групп, которые содержат штаммы, выделенные у разных больных, обладающие различной моле-кулярно-эпидемиологической характеристикой (серотип, устойчивость к антибактериальным химиопрепаратам) и генетически близкородственные.
Полирезистентные штаммы формируются при внебольничных пневмониях путем горизонтального переноса генетического материала (рис. 1):
это подтверждается наличием двух клональных комплексов, в одном из них присутствует один полирезистентный штамм (клональный комплекс, содержащий ST-1.1, ST-4,ST-13), в другом — два (ST-2, ST-8.1, ST-11.1). Все это показывает возможность формирования полирезистентности у штаммов пневмококка, выделенных у пациентов с внебольничной пневмонией.
Анализ распространения близкородственных в генетическом отношении штаммов показывает, что из 4 полирезистентных, выделенных нами изолятов пневмококка у носителей, 2 являются представителями единого клонального комплекса; а это значит, что и у носителей, в обычных
Молекулярно-эпидемиологическая характеристика полирезистентных к антибиотикам штаммов S.pneumoniae
Данные MLST Резистентность Штаммы
Серотип
aroE gdh gki recP spi xpt dd1 MLST тип пен эрит клин МИК (мг/мл)
Штаммы, выделенные в 1 -й группе (п = 14, внебольничная пневмония)
7 11 10 1 6 8 14 162 Ч у у 1,4 9
9V 7 11 10 1 6 8 14 158 Уч у 0,2 10
^ 1 5 4 12 5 3 8 423 Ч у у 0,5 22
6В 20 28 1 1 15 14 14 315 Ч уу 0,2 20
^ 4 4 2 4 4 1 1 81 Ч у у 0,2 5
23F 7 5 1 1 13 31 14 440 Ч у 0,2 23
14 1 5 4 5 5 1 8 9 Ч уу у 0,3 1
н/т 1 5 4 5 5 1 8 9 у уу у 0,5 2
14 7 5 1 8 14 11 14 124 у уу у 0,2 8
18С 7 2 1 1 10 1 21 113 у уу 0,2 6
6А 2 7 4 10 10 1 27 176 у уу у 1 12
15В 8 13 14 4 17 4 14 95 уу уу у 0,5 14
15С 8 13 14 4 17 4 14 201 у уу 0,15 15
н/т 8 13 14 4 17 4 14 199 у у у 1 16
Штаммы, выделенные в 2-й группе (п = 8, ХОБЛ)
9V 7 11 10 1 6 8 14 162 уу уу 0,2 11
3 7 15 2 10 6 1 22 180 уу уу у 0,2 13
^ 1 8 9 1 6 4 6 311 уу у у 0,8 18
6А 2 7 4 10 10 1 27 65 у у у 1 4
19F 1 8 4 1 1 4 6 36 у уу 2 3
23F 1 8 9 1 6 4 6 311 уу уу 2 19
18С 7 2 1 1 10 1 21 113 у у у 1 7
23F 7 13 8 1 10 6 37 272 уу уу 0,5 17
Штаммы у носителей (п = 4)
19F 1 8 10 4 9 1 3 341 уу 1 21
19А 12 14 11 2 6 17 22 785 Уу уу У 1 24
6В 8 37 9 29 2 12 53 344 уу Уу у 0,02 4
6А 2 13 9 1 6 19 14 490 уу 0,04 5
_| БТР-1
I I8ТР-4
\-8ТР-3
г -вТН-Ю
- -8ТС-12
---8ТС-13
- 8ТР-7
8ТР-2
_ _8ТН-8
__8ТН-11
---8ТР-5
---8ТР-6
-8ТН-9
Рис. 2. Результаты мультилокусного секвенстипиро-ания полирезистентных штаммов пневмококка, выделенных в 3 группах.
условиях протекают процессы внутригеномной перестройки штаммов, что может привести к формированию госпитального изолята и что соответственно требует профилактических мер.
Сопоставив результаты мультилокусного сек-венстипирования всех полирезистентных штаммов (рис. 2), мы пришли к выводу, что наиболее высока вероятность к осуществлению событий горизонтального переноса в полирезистентных штаммах, выделенная у лиц пожилого возраста с хроническим обструктивным бронхитом, а также в штаммах, выделенных у пациентов с вне-больничной пневмонией (таблица).
Таким образом, анализ генетического разнообразия штаммов Streptococcus pneumoniae показал, что среди изученных нами 26 чувствительных и нечувствительных (т. е. умеренно-устойчивых и устойчивых) к пенициллину и эритромицину штаммов было выделено 22 различных секвенстипа и 4 клональных комплекса. При этом 2 комплекса были представлены более чем одним изолятом.
Необходимо отметить, что из 14 штаммов, выделенных у лиц пожилого возраста с внеболь-ничной пневмонией, 6 относились к профилю Taiwan 19F-14, из них 4 обладали одинаковым профилем резистентности: были устойчивыми/промежуточными к пенициллину, эритромицину, тетрациклину и клиндамицину. Геноти-пическая характеристика проанализированных штаммов также показала высокую степень однородности выборки: все изоляты имели детерминанты резистентности к макролидным антибиотикам — гены mefE и ermB (что согласуется с фенотипическими данными). Основной характеристикой штаммов S. pneumoniae генотипа Taiwan19F-14 является то, что независимо от географической области выделения, эти микроорганизмы полирезистентны прежде всего по отношению к бета-лактамам и макролидам. Данный секвенстип распространен в основном в Южной Корее, Вьетнаме и Гонконге.
Среди штаммов, вызвавших у лиц пожилого возраста ХОБЛ, методом мультилокусного сек-венстипирования было идентифицировано 2 различных секвенстипа, при этом каждый из них был представлен 5 и 3 изолятами.
Несмотря на небольшую выборку, штаммы, выделенные у носителей, оказались фенотипи-чески неоднородными: 2 штамма были умеренно-
устойчивы к пенициллину и 2 штамма чувствительны. При этом все 4 штамма были не чувствительными к эритромицину. В исследуемой группе оба штамма принадлежали к секвенстипу, идентичному штамму R6, который является авиру-лентным штаммом и может рассматриваться как условно-патогенная микрофлора.
ВЫВОДЫ
Таким образом, MLST в настоящее время рассматривается как наиболее точный метод дифференцировки стрептококков и идентификации S.pneumoniae [8] и один из важнейших инструментов микробиологического мониторинга штаммов этого микроорганизма, что позволяет провести типирование и прогнозировать появление штаммов с новыми свойствами, которые в перспективе могут стать госпитальными изолятами и потребовать совершенно новых мер в отношении эпидемиологического надзора.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бачинская Е.Н. Возбудители внебольничных пневмоний на пороге нового тысячелетия // Антибиотики и химиотерапия. 2000. Т. 45. С. 21-28.
2. Богданов М.Б., Черненькая Т.В. Микробиологическая оценка антибактериальных препаратов, используемых для эмпирической терапии внебольничных инфекций нижних дыхательных путей // Антибиотики и химиотерапия. 2000. Т. 10. С. 15-19.
3. Жильцов И.В., Семёнов В.М. Бета-лактамазная активность мокроты и ее влияние на эффективность антибактериальной терапии // Туберкулез и болезни легких. 2012. Т. 4. С. 18-26.
4. Новиков Ю.К. Диагностика и лечение внебольничных пневмоний // РМЖ. 2001. Т. 1. С. 11-16.
5. Об унификации микробиологических (бактериологи -ческих) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений. Приказ МЗ СССР № 535 от 22 апреля 1985 г.
6. Семенов В.М., Дмитраченко Т.И., Жильцов И.В. Микробиологические аспекты резистентности к антимикробным препаратам // Туберкулез и болезни легких. 2012. Т. 4. С. 18-26.
7. Синопальников А.И., Страчунский Л.С Новые рекомендации по ведению взрослых пациентов с внеболь-ничной пневмонией // Клин. микробиол. и антимик-робн. химиотер. 2001. Т. 1. С. 18-21.
8. Enright M.C., Spratt B.G. A multilocus sequence typing scheme for Streptococcus pneumoniae identification of clones association with serious invasive disease // Microbiology. 1998. Vol. 14. P. 5049-5060.
9. Streptococcus pneumoniae. Textbook in Serotyping, Virulence Factors and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) for Measuring Pneumococcal Antibodies. — Stat-ens Serum Institute, Copenhagen, Denmark. — 2013. 34 p.
Поступила 10.04.2014
