CC BY
30
Чувствительность к антибиотикам, клональное и серотиповое разнообразие пневмококков у детей с острым средним отитом в г. Москве
Н.А. Маянский1, 2, Н.М. Алябьева1, М.А. Лазарева1, А.М. Иваненко3, О.А. Пономаренко1, А.В. Лазарева1, Л.К. Катосова1, Т.В. Куличенко1, 2
1 Научный центр здоровья детей, Москва, Россия
2Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова, Москва, Россия 3Морозовская детская городская клиническая больница, Москва, Россия
Цель. Анализ штаммов Streptococcus pneumoniae — ведущего возбудителя острого среднего отита (ОСО) у детей. Изучение чувствительности к антибиотикам,клональной и серо-типовой структуры пневмококков, выделенных из жидкости среднего уха (ЖСУ) у детей с ОСО.
Материал и методы. Образцы ЖСУ у детей <5 лет с ОСО собирали в четырех детских клиниках г. Москвы в 2011-2013 гг. Выделение и идентификацию пневмококка проводили стандартными микробиологическими методами; чувствительность к антибиотикам определяли с помощью диско-диффузионного метода, минимальную подавляющую концентрацию (МПК) пенициллина и амоксициллина оценивали Е-тестом. Серотипирование осуществляли с помощью пневмококковых антисывороток Staten Serum Institut (Дания). Мультилокусное сиквенс-типи-рование проводили согласно общепринятому протоколу.
Результаты. Всего было проанализировано 107 штаммов пневмококка. Нечувствительными к пенициллину (МПК >0,06 мкг/мл) были 45% (48/107) изолятов, резистентными к макролидам — 34% (36/107) штаммов, причем 92% (33/36) макролидорезистентных пневмококков были носителями гена ermB, что наделяло их кон-
ститутивным MLSB-фенотиопм, т.е. одновременной устойчивостью ко всем макролидам, линко-замидам, стрептограмину В. Множественной устойчивостью к антибиотикам обладали 30% (32/107) изолятов, однако все исследованные штаммы были чувствительны к амоксициллину (МПК <2 мкг/мл). Десять из 32 (31%) штаммов с множественной лекарственной устойчивостью относились к клональному комплексу (СС) 320, остальные принадлежали к 7 различным СС. В общей выборке из 107 штаммов доминировали серотипы ^ (27%), 3 (12%), 6В (11%), 14 (11%), 19А (9%) и 23F (8%). Доступные пневмококковые конъюгированные вакцины (ПКВ) охватывают от 93% (ПКВ-13) до 66 и 67% (ПКВ-7 и ПКВ-10 соответственно) этиологически значимых серотипов пневмококка при ОСО.
Выводы. Популяция пневмококков, ассоциированных с ОСО, характеризуется выраженным снижением чувствительности к антибиотикам и высокой клональностью. Серотиповой состав циркулирующих пневмококков предполагает преимущество ПКВ с расширенным спектром серотипов.
Ключевые слова: пневмококк, чувствительность к антибиотикам, сиквенс-тип, серотип, острый средний отит, дети.
Контактный адрес: Николай Андреевич Маянский Эл. почта: mayansky@nczd.ru
Antimicorbial Susceptibility, Clonal and Serotype Diversity of Streptococcus pneumoniae Isolated from Children with Acute Otitis Media in Moscow
N.A. Mayanskiy1, 2, N.M. Alyabieva1, M.A. Lazareva1, A.M. Ivanenko3, O.A. Ponomarenko1, A.V. Lazareva1, L.K. Katosova1, T.V. Kulichenko1, 2
1 Scientific Center for Children's Health, Moscow, Russia
2I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Moscow, Russia
3Morozovskaya Children's Hospital, Moscow, Russia
Objective. Streptococcus pneumoniae (pneumococ-cus) is the leading cause of acute otitis media (AOM) in children. Hereby, we describe antibiotic susceptibility, clonality, and serotype distribution of pneumococci isolated from the middle ear fluid (MEF) in children with AOM.
Material and methods. MEF specimens from children <5 years of age with AOM were collected in 4 pediatric hospitals in Moscow in 2011-2013. Isolation and identification of pneumococcus was performed using standard microbiological procedures. Antibiotic susceptibility was tested by means of the disk diffusion method, minimal inhibitory concentration (MIC) for penicillin and amoxicillin was determined by the E-test. Serotyping was performed using pneumococcal antisera from the Staten Serum Institut (Denmark). For the multilocus sequence typing, a conventional protocol was used.
Results. A total of 107 pneumococcal isolates were analyzed. Penicillin nonsusceptibility (MIC >0.06 |ig/L) was found in 45% (48/107) isolates, macrolide resistance had 34% (36/107) pneumococci. The vast majority of macrolide-resistant isolates (92%, 33/36) carried the
ermB gene conferring a constitutive MLSB-phenotype, i.e. simultaneous resistance to all macrolides, lincos-amides, streptogramin B. A multidrug resistant (MDR) phenotype displayed 30% (32/107) pneumococci, however all isolates were susceptible to amoxicillin (MIC <2 ig/mL). Ten of 32 (31%) MDR isolates belonged to clonal complex (CC) 320, the rest were distributed among 7 different CC. In the serotype distribution, isolates with serotype 19F (27%), 3 (12%), 6B (11%), 14 (11%), 19A (9%), and 23F (8%) predominated. Available polysaccharide pneumococcal conjugated vaccines (PCV) cover the majority of AOM serotypes (PCV7, 66%; PCV10, 67%; PCV13, 93%).
Conclusion. AOM pneumococci circulating in Moscow are characterized by a substantial reduction in antimicrobial susceptibility and pronounced clonality. Pneumococcal serotype distribution suggests advantage of a PCV with the extended coverage.
Key words: pneumococcus, acute otitis media, serotype, sequence type, antimicrobial susceptibility, children.
Введение
Streptococcus pneumoniae (пневмококк) является широко распространенным условно патогенным микроорганизмом, который может вызывать разнообразный спектр инфекционных болезней, начиная от мукозальных инфекций, пневмонии и заканчивая тяжелыми, нередко жизнеугрожающими заболеваниями (бактериемия, менингит) [1]. Пневмококк является ведущим этиологическим агентом одной из наиболее распространенных инфекций детского возраста — острого среднего отита (ОСО), составляя в структуре бактериальных отопатогенов 30-80% [2-4]. Более 80% детей переносят по меньшей мере один эпизод ОСО в течение первых трех лет жизни, а у 40% к 7-летнему возрасту ОСО возникает шесть и более раз [5]. Ведущая роль пневмококка в этиологии ОСО сочетается с глобальным ростом его устойчивости к антибиотикам. Так, во многих странах Европы распространенность штаммов со сниженной чувствительностью к пенициллину достигает 25-50%, а глобальная доля нечувствительных к пенициллину пневмококков оценивается
в 33% [6-8]. Более 20% пневмококков обладают резистентностью к макролидам, а в отдельных регионах, например в странах Азии и особенно в Китае, макролидорезистентные пневмококки встречаются с частотой 50-100% [6-9]. Кроме того, получили распространение штаммы с множественной устойчивостью к антибиотикам, доля которых в общей популяции пневмококков может достигать 40% и более.
Несмотря на разнообразие капсульных типов пневмококка (их описано более 90), антибиотикоре-зистентность не распределяется равномерно среди всех серотипов. Резистентные пневмококки принадлежат к ограниченному числу клонов (или кло-нальных линий), которые включают лишь несколько серотипов. С другой стороны, отдельный серотип может быть представлен в составе разных клонов, не являющихся родственными и отличающихся по степени резистентности [7, 10, 11]. Семивалентная пневмококковая конъюгированная вакцина (ПКВ-7) оказала выраженный эффект на сероэпидемиологию пневмококка, практически прекратив циркуляцию вакцинных серотипов и существенно снизив забо-
леваемость пневмококковыми инфекциями, в том числе ОСО, в тех странах, где она применяется [10, 12-14].
Вместе с тем, в последние годы стали появляться сообщения о распространении в поствакцинальный период резистентных не-ПКВ-7 серотипов, в первую очередь серотипа 19А, принадлежащего к клональному комплексу (clonal complex — СС) 320 [13, 15, 16]. Этот феномен замещения сероти-пов может реализовываться через механизм переключения капсулы и экспансии резистентных генотипов, существовавших до внедрения ПКВ [10, 11, 15, 17, 18]. В связи с этим выявление и молекулярная характеристика клонального разнообразия устойчивых к антибиотикам пневмококков представляется более перспективным подходом для прогнозирования эволюции и распространения резистентности, чем простое серотипирование отдельных штаммов.
Цель работы. В настоящей работе мы описываем чувствительность к антибиотикам, серотиповой состав, а также клональную структуру изолятов пневмококка, полученных из жидкости среднего уха (ЖСУ) пациентов с ОСО. Эти данные могут быть полезными для мониторирования изменений сероэпидемиологии и резистентности пневмококка после начала массовой вакцинации ПКВ, включенной в российский Национальный календарь профилактических прививок в 2014 г. [19].
Материал и методы
Изоляты пневмококка, включенные в исследование, были получены в период с августа 2011 г. по апрель 2013 г. из четырех педиатрических стационаров г. Москвы в ходе проспективного исследования [20]. Все штаммы выделены из образцов ЖСУ, собранной путем тимпаноцентеза или через отверстие в барабанной перепонке при спонтанной оторее у пациентов с ОСО в возрасте <5 лет.
Пневмококк идентифицировали с помощью оптохинового теста и латекс-агглютинации (набор Slidex Pneumo-kit, bioMerieux, Франция). Серотипирование проводили с использованием пуловых латексных антисывороток и факторных/ типовых антисывороток в реакции набухания капсулы по Нейфельду (Staten Serum Institut, Дания).
Минимальные подавляющие концентрации (МПК) пенициллина и амоксициллина определяли с помощью Е-тестов (bioMerieux), другие антибиотики тестировали диско-диффузионным методом (Bio-Rad, США).
Результаты интерпретировали согласно обновленным рекомендациям EUCAST (2013 г.) [21]. Изоляты с МПК пенициллина
>0,06 мкг/мл считали нечувствительными к пенициллину. Чувствительными считали штаммы с диаметром зоны подавления роста >20 мм для диска с оксациллином, >21 мм для эритромицина, >19 для клиндамицина и триметоприма/ сульфа-метоксазола.
Для определения генов ermB и mef у макроли-дорезистентных пневмококков использовали ПЦР, как было описано ранее [22].
Мультилокусное сиквенс-типирование (МЛСТ) пневмококков с множественной устойчивостью к антибиотикам (т.е. устойчивостью к 3 или 4 исследованным группам антибиотиков) проводили согласно протоколу [23]. Внутренние фрагменты генов aroE, gdh, gki, recP, spi, xpt и ddl амплифицирова-ли путем ПЦР с помощью описанных праймеров, а затем полученные ампликоны секвенировали. Аллели и сиквенс-типы ^Т) определяли с помощью программного обеспечения на web-странице пневмококка [24]. Сиквенс-типы анализировали и относили к клональным комплексам после их сравнения со всеми сиквенс-типами, имеющимися в онлайн-базе данных, используя программу eBURST [24]. Сиквенс-типы, имеющие 6 одинаковых аллельных вариантов из 7 исследованных локусов, относили к одному клональному комплексу.
Результаты
Всего в исследование включено 107 штаммов пневмококка, выделенных из ЖСУ у пациентов с ОСО.
Определение чувствительности к антибиотикам. Чувствительность к антибиотикам определили у всех полученных изолятов. Результаты представлены в табл. 1. Для всех тестированных антибиотиков доля нечувствительных штаммов превышала 30%. Наиболее высокой была резистентность к три-метоприму/сульфаметоксазолу (59%, 63/107).
Чувствительность к пенициллину и амоксицил-лину оценивали путем скринингового тестирования чувствительности к оксациллину (1 мкг) с помощью диско-диффузионного метода. Резистентностью к оксациллину обладали 46% (49/107) изолятов пневмококка. Последующий анализ с использованием Е-теста показал, что все оксациллино-резистентные пневмококки, кроме одного (45%, 48/107), были нечувствительны к пенициллину (МПК >0,06 мкг/мл) (см. табл. 1). МПК пенициллина >2 мкг/мл наблюдалась у 5% (5/107) штаммов. Распространенность нечувствительных к пенициллину изолятов была особенно высока среди главных серотипов, включая серотипы 14 (10/12, 83%), 19А (8/10, 80%), ^ (19/29, 66%) и 23F (5/9, 56%) (см. табл. 1).
Таблица 1. Распределение серотипов по отношению к их охвату ПКВ-13 и устойчивость к антибиотикам штаммов S. pneumoniae, выделенных из ЖСУ
Серотипы n (%) Нечувствительные штаммы, n
PEN ERY CLI TMP/SMX МУА)
19F 29 (27) 19 15 14 23 14
3 13 (12) 0 0 0 0 0
6B 12 (11) 3 9 8 6 6
14 12 (11) 10 6 5Б) 8 6
19A 10 (9) 8 5 4Б) 9 5
23F 9 (8) 5 1 1 5 1
6A 5 (5) 2 0 0 5 0
18C 5 (5) 0 0 0 0 0
9V 3 (3) 1 0 0 3 0
4 1 (1) 0 0 0 0 0
7F 1 (1) 0 0 0 0 0
Не-ПКВ-13В) 7 (7) 0 0 0 4 0
Все серотипы, n (%) 107 (100%) 48 (45%)Г) 36 (34%) 32 (30%) 63 (59%) 32 (30%)
Примечание. Здесь и в табл. 2: PEN — пенициллин; ERY — эритромицин; CLI — клиндамицин; TMP/SMX — триметоприм/ сульфаметоксазол.
A) Множественная устойчивость (устойчивость к 3 или 4 исследованным группам антибиотиков). Б) Индуцибельная резистентность (i-MLSB фенотип) у 1 штамма.
B) Не-ПКВ-13 серотипы (n=7): 15C — n=2; 8, 12B, 13, 15B, 39 — n=1 каждый. Г) Пенициллин: МПК50= 0,023 мкг/мл, МПК90=1,5 мкг/мл.
МПК амоксициллина была определена для всех 49 оксациллинорезистентных изолятов. Для большинства исследованных штаммов (80%, 39/49) МПК амоксициллина составила <0,5 мкг/мл, у 9 штаммов МПК была 1 мкг/мл и у 1 изолята МПК равнялась 2 мкг/мл. Ни одного амоксицил-линорезистентного штамма пневмококка (МПК >2 мкг/мл) обнаружено не было.
Уровни резистентности к эритромицину и клин-дамицину были близки (34%, 36/107 и 30%, 32/107 соответственно). Основным молекулярным механизмом резистентности к макролидам была модификация мишени за счет наличия гена ermB. Этот ген присутствовал более чем у 90% (33/36) эритро-мицинорезистентных штаммов как единственная детерминанта резистентности (у 16/36 изолятов) или в сочетании с геном эффлюкса mef (у 17/36 изолятов). Лишь 2 из 36 эритромицинорезистентных пневмококков имели только ген mef. Большинство макролидорезистентных штаммов обладали также устойчивостью к клиндамицину (89%, 32/36). Из 32 клиндамицинорезистентных изолятов 2 штамма обладали наведенной резистентностью (устойчивость к клиндамицину в присутствии эритромицина), т. е. индуцибельным MLSB-фенотипом (одновременная устойчивость ко всем макролидам, линкозамидам, стрептограмину В) [21]. Большая часть изолятов серотипа 6В была резистентной как к эритромицину, так и к клиндамицину (см. табл. 1).
Множественная устойчивость к антибиотикам, т.е. нечувствительность к 3 или 4 исследованным классам антибиотиков, наблюдалась у 30% (32/107) исследованных штаммов пневмококка (см. табл. 1). К числу серотипов с множественной устойчивостью относились серотипы 6В, 14, 19А и 19F, при этом доминировали представители серогруппы 19 (59%, 19/32). Примечательно, что именно к этой серогруп-пе принадлежали изоляты с высокой МПК пенициллина (>2 мкг/мл) и амоксициллина (>1 мкг/ мл) (табл. 2). Пневмококки серотипов 3 и 18С были чувствительны ко всем тестированным антибиотикам. Ни один из не-ПКВ-13 серотипов не обладал множественной устойчивостью к антибиотикам.
МЛСТ штаммов пневмококка с множественной устойчивостью к антибиотикам. Выявленные штаммы пневмококка с множественной устойчивостью к антибиотикам (n=32) генотипиро-вали с помощью МЛСТ. Клональная структура этих штаммов с указанием серотипа и профиля резистентности представлена в табл. 2. Всего было обнаружено 13 известных сиквенс-типов, принадлежащих к 8 клональным комплексам, а также 3 новых сик-венс-типа, имеющих связь с СС320, и 1 синглетон (генотип-«одиночка», не принадлежащий ни к одному из известных клональных комплексов).
В нашей выборке преобладали представители СС320 (31%, 10/32). Они включали 3 изолята с ST320, 6 однолокусных вариантов (single locus
Таблица 2. Клональная структура штаммов S. pneumoniae с множественной устойчивостью к антибиотикам, выделенных из ЖСУ, их серотиповая принадлежность и чувствительность к антимикробным препаратам
№ Клональный комплекс (глобальный клон -родоначальник комплекса) ST Серотип PEN AMX МПК, мкг/мл ERY CLI TMP/ SMX erm/mef
1 СС320 (Taiwan19F-14) 320 19A 1,5 2 Н/ч Н/ч Н/ч erm+/mef+
2 320 19F 4 1 Н/ч Н/ч Н/ч erm+/mef+
3 320 19F 1 1 Н/ч Н/ч Н/ч erm+/mef+
4 320 SLVA) 19F 2 1 Н/ч Н/ч Н/ч erm+/mef+
5 320 SLVA) 19F 1 1 Н/ч Н/ч Н/ч erm+/mef+
6 320 SLVA) 19F 1,5 1 Н/ч Н/ч Н/ч erm+/mef+
7 320 SLVA) 19F 1,5 1 Н/ч Н/ч Н/ч erm+/mef+
8 320 SLVA) 19F 1,5 1 Н/ч Н/ч Н/ч erm+/mef+
9 320 SLVB) 19A 2 1 Н/ч Н/ч Н/ч erm+/mef+
10 320 DLVB) 19F 4 1 Н/ч Ч Н/ч mef+
11 Синглетон НовыйГ) 19F 4 1 Н/ч Н/ч Н/ч erm+/mef+
12 СС236 (Taiwan19F-14) 236 19F 0,19 0,25 Н/ч Н/ч Н/ч erm+/mef+
13 236 19F 0,19 0,12 Н/ч Н/ч Н/ч erm+/mef+
14 236 19F 0,38 0,12 Н/ч Н/ч Н/ч erm+/mef+
15 СС193 (Greece21-30) 179 19F 0,5 0,25 Н/ч Н/ч Ч erm+
16 177 19F 0,012 S® Н/ч Н/ч Н/ч erm+
17 СС230 (Denmark14-32) 276 19А 0,25 0,25 Н/ч Н/чЕ) Н/ч erm+/mef+
18 5539 19A 0,5 0,03 Н/ч Ч Н/ч mef+
19 СС156 (Spain9V-3) 790 19A 1 0,25 Н/ч Н/ч Н/ч erm+/mef+
20 790 14 1,5 0,25 Н/ч Н/ч Н/ч erm+
21 790 14 1 0,5 Н/ч Н/чЕ) Н/ч erm+
22 865 14 1 0,5 Н/ч Н/ч Ч erm+
23 865 14 1,5 0,25 Н/ч Н/ч Ч erm+
24 865 14 1 0,5 Н/ч Н/ч Ч erm+
25 СС15 (England14-9) 15 14 0,75 0,12 Н/ч Н/ч Н/ч erm+
26 СС315 (Poland6B-20) 315 6B 0,12 0,03 Н/ч Н/ч Ч erm+
27 315 6B 0,023 S® Н/ч Н/ч Н/ч erm+
28 315 6B 0,032 S® Н/ч Н/ч Н/ч erm+
29 315 6B 0,125 0,03 Н/ч Н/ч Н/ч erm+
30 1032 6B 0,016 S® Н/ч Н/ч Н/ч erm+
31 386 6B 1 0,5 Н/ч Н/ч Ч erm+
32 СС81 (Spain23F-1) 81 23F 1 0,25 Н/ч Н/ч Н/ч erm+/mef+
Примечание. ST — сиквенс-тип; AMX — амоксициллин; ERY — эритромицин. Ч — чувствительный; Н/ч — нечувствительный. SLV — однолокусный вариант, DLV — двулокусный вариант. erm/mef — наличие соответствующей детерминанты резистентности к макролидам обозначено знаком «+».
A) Новый сиквенс-тип ST9659. Все 5 штаммов являются однолокусным вариантом ST320, обладая идентичной новой последовательностью локуса ddl (№ 610).
Б) Новый сиквенс-тип ST9656. Однолокусный вариант ST320 по локусу rec (новая последовательность rec № 257).
B) Новый сиквенс-тип ST9657. Двулокусный вариант ST320 по локусам aro (последовательность № 7) и ddl (новая последовательность ddl № 608).
Г) Новый сиквенс-тип ST9658 с профилем МЛСТ: aro 7, gdh 13, gki 8, rec 15, spi 6, xpt 6, ddl — новая последовательность № 609. Д) МПК амоксициллина тестировали только у пенициллинонечувствительных штаммов (МПК пенициллина > 0,06 мкг/мл). Е) Индуцибельная резистентность (i-MLSB фенотип).
variant, SLV) и 1 двулокусный вариант (double locus variant, DLV) этого сиквенс-типа. Примечательно, что 5 из 6 SLV обладали идентичным вариантом последовательности локуса ddl и принадлежали
к единственному новому сиквенс-типу, который ранее не был описан в базе данных PMEN (см. табл. 2). Большинство изолятов СС320 имели серотип 19F (8/10), а 2 из 10 изолятов — серо-
тип 19А. Все СС320-пневмококки характеризовались высокими МПК пенициллина и амоксицил-лина (>1 мкг/мл). Кроме того, 9 из 10 этих штаммов являлись носителями комбинации детерминант устойчивости к макролидам ermВ и mef, что обуславливало их MLSB-фенотип. Один штамм ^ЦУ ST320) был носителем гена mef и сохранял чувствительность к клиндамицину (см. табл. 2). Изолят-синглетон с серотипом 19F демонстрировал высокую МПК пенициллина (4 мкг/мл) и имел обе детерминанты резистентности к макролидам.
Оставшиеся изоляты серогруппы 19 (п=8) принадлежали к 4 различным клональным комплексам, включая СС236 (п=3), СС193 (п=2), СС230 (п=2) и СС156 (п=1). В этой группе пневмококков МПК пенициллина была сравнительно низкой МПК<0,5 мкг/мл, за исключением 1 штамма из СС156 с МПК пенициллина 1 мкг/мл, а 3 из 8 изолятов обладали единственной детерминантой резистентности к макролидам (у 2 был ген ermB, у 1 — ген mef).
Клональный комплекс СС156 (клон Spain9V-3) был представлен пневмококками ST790 и ST865 (п=3 каждый). Большинство (5 из 6) этих изолятов относилось к серотипу 14 и было носителем ermB как единственной детерминанты резистентности к макролидам, а один изолят обладал индуцибель-ным MLSB-фенотипом. Оставшийся СС156-изолят с ST790 обладал капсулой 19А и двойным механизмом резистентности к макролидам. Все пневмококки СС156 демонстрировали высокую МПК пенициллина (>1 мкг/мл). Один штамм с серотипом 14 имел ST15 и относился к СС15 (см. табл. 2).
Клональный комплекс СС315 был представлен 6 изолятами (все с серотипом 6В) и 3 сиквенс-типами, которые включали ST315 (п=4), ST1032 и ST386 (п=1 каждый). Лишь один штамм имел высокую МПК пенициллина (1 мкг/мл), но был чувствителен к триметоприму/сульфаметоксазолу. Остальные были чувствительны к пенициллину или имели невысокий уровень МПК.
Один изолят с множественной устойчивостью с серотипом 23F имел ST81 и представлял СС81 (см. табл. 2).
Распределение серотипов пневмококка. Среди 107 типированных штаммов пневмококка было выявлено 17 различных серотипов, однако доминировали всего 6 серотипов с распространенностью >5%, которые суммарно составили почти 80% распределения (см. табл. 1). В число ведущих серотипов вошли серотипы ^ (27%), 3 (12%), 6В (11%), 14 (11%), 19А (9%) и 23F (8%). Не было получено ни одного изолята с серотипом 1 или 5. Охват серотипов имеющимися ПКВ составил: ПКВ-7 — 66%
(включает серотипы 4, 6В, 9У, 14, 18С, ^ и 23F), ПКВ-10 — 67% (дополнительно к ПКВ-7 включает серотипы 1, 5, 7F), ПКВ-13 — 93% (дополнительно к ПКВ-10 включает серотипы 3, 6А, 19А).
Обсуждение результатов
В настоящей работе представлены результаты разностороннего анализа пневмококков, полученных из ЖСУ у детей с ОСО. Существенная доля изученных штаммов характеризовалась нечувствительностью к антибиотикам. Снижение чувствительности к пенициллину было отмечено у 45% изолятов, 34% были резистентными к эритромицину и 30% пневмококков обладали множественной устойчивостью к антибиотикам. В исследовании Л.К. Катосовой и соавт., опубликованном в 2006 г. [25], в коллекции из 37 ЖСУ-пневмококков был выявлен лишь 1 пенициллинонечувствитель-ный изолят и ни одного резистентного к макролидам. Кроме того, работы, проведенные в конце 1990-х и на протяжении 2000-х годов в Смоленском НИИ антимикробной химиотерапии, показали чувствительность к пенициллину и эритромицину примерно у 90% носоглоточных изолятов пневмококка [26, 27]. Очевидно, что распространенность нечувствительных к антибиотикам пневмококков заметно возросла в последние годы. Тревожно и то, что за это время популяция пневмококков накопила множественные детерминанты резистентности, например двойственную устойчивость к макролидам за счет комбинации генов ermB и mef, о чем свидетельствуют настоящие данные и результаты наших предыдущих исследований [28].
Анализ клональной структуры пневмококков с множественной устойчивостью к антибиотикам показал преобладание изолятов, относящихся к СС320. Этому клональному комплексу принадлежало большинство пневмококков с высокими МПК пенициллина и амоксициллина. Данные о генотипах пневмококка, присутствующих на территории России, ограничены, о чем можно судить по международной базе данных РМЕК Из 162 изолятов, депонированных в ней, большинство датировано 1990-ми — началом 2000-х годов [24]. В одной работе было описано 58 пенициллинонечувствительных штаммов пневмококка, собранных в России в 20032007 гг., среди которых преобладали представители СС81 ^Т81 с серотипом 23F), СС156 и СС236 [29]. Последние составляли большинство изолятов с множественной устойчивостью серотипа 19F ^Т236, ST271 и ST651). Серотип 19А был представлен 2 штаммами с ST236 и ST608 [29]. В нашей выборке генотипированных пневмококков мы также наблюдали перечисленные клональные комплексы,
однако они встречались гораздо реже. Десять из 32 пневмококков с множественной устойчивостью принадлежали к СС320, из них 3 изолята имели ST320, а у 7 изолятов были обнаружены новые сиквенс-варианты ST320. Отметим, что 6 из 7 этих пневмококков отличались от ST320 по последовательности локуса ddl, причем 5 из них обладали идентичной новой последовательностью ddl аллеля. Дивергентные последовательности по локусу ddl ассоциируются со структурными вариантами пени-циллинсвязывающего белка 2Ь, обеспечивающими резистентность к пенициллину [15]. До настоящего времени в PMEN не было депонировано ни одного изолята из России с сиквенс-типом ST320 [24], т.е. штамм пневмококка серотипа 19А с ST320, обнаруженный в ходе настоящей работы, является первым пневмококком такого рода, выявленным в нашей стране. Эти данные указывают на то, что, несмотря на ранее наблюдавшуюся ограниченную распространенность СС320 на территории России, в настоящее время этот клональный комплекс выходит на лидирующие позиции среди пневмококков с множественной устойчивостью к антибиотикам.
Пневмококковый клон с сиквенс-типом ST320 и капсулой серотипа 19А, являющийся родоначальником клонального комплекса СС320, получил широкое распространение в США, Канаде, Италии и Испании [15, 16, 30]. В Германии и Португалии увеличение доли серотипа 19А было связано с другим клональным комплексом — СС230 [31, 32]. В обоих случаях наблюдавшаяся экспансия объяснялась за счет феномена замещения серотипов, имеющего отношение к внедрению в широкую практику ПКВ-7 [15, 18]. В то же время в Южной Корее и Израиле об экспансии серотипа 19А с множественной устойчивостью к антибиотикам сообщалось еще до начала использования ПКВ [33, 34]. В частности, в Южной Корее распространился пред-существовавший клон ST320, тогда как в Израиле пролиферировали другие клональные комплексы, в основном СС230 [33, 34].
В отличие от процитированных работ, полученные нами данные говорят о появлении в рамках СС320 нескольких клональных линий пневмококка с множественной устойчивостью к антибиотикам, экспрессирующих преимущественно капсулу 19F (8 из 10 представителей СС320 имели серотип 19F и только 2 имели серотип 19А). Экспансия серотипа 19А ST320 и других клональных вариантов этого серотипа до начала использования ПКВ может быть обусловлена его конкурентными преимуществами по сравнению со штаммами-предшественниками, включая лучшую способность к колонизации, повышенную вирулентность и высокую антибиотикоре-
зистентность [15, 33, 34]. В этом контексте можно предположить, что в отсутствие давления ПКВ (как это до сих пор было в России) капсульный тип не играет ведущей роли в эволюции пневмококка. По мнению ряда авторов, одним из ведущих факторов, способствующих возникновению и распространению таких успешных пневмококковых клонов, как СС320, служит резистентность к антибиотикам [31, 34, 35]. Наши результаты поддерживают это положение, демонстрируя накопление в пневмококковой популяции России многих резистентных клонов на фоне роста ее устойчивости к антибиотикам за последние годы.
Резистентность к антибиотикам тесно связана с практикой назначения и применения этих препаратов. Обычно уровень резистентности имеет прямую зависимость от уровня потребления антибиотиков [36]. Тем не менее, в России сложилась парадоксальная ситуация, когда широкая распространенность устойчивых пневмококков сочетается со сравнительно низким потреблением антибиотиков, которое сопоставимо с Нидерландами, где уровень резистентности самый низкий в Европе [36].
Вероятно, что одним из главных двигателей растущей устойчивости является сомнительная практика назначения антибиотиков. Так, недавнее многоцентровое исследование показало, что необоснованное назначение антибиотиков детям в амбулаторной сети составляет 40%, а правильное использование было зарегистрировано в 45% случаев [37]. В перечне назначаемых антибиотиков 22% приходилось на макролиды и 14% — на цефалоспо-рины. Ряд авторов относят оба эти класса антибиотиков к числу препаратов, стимулирующих появление резистентности [34]. Например, введение единственной дозы цефтриаксона может привести к серьезным сдвигам в носоглоточной микрофлоре, повышая долю штаммов пневмококка со сниженной чувствительностью к пенициллину [38]. В нашем исследовании более 90% пациентов с ОСО, которых лечили антибиотиками, получали цефалоспорины (данные не представлены). Выбор этого класса антибиотиков в качестве препаратов первой линии при лечении ОСО следует признать неадекватным. Международные рекомендации однозначно указывают на амоксициллин (в сочетании с клавуланатом или без него) в качестве первоначального выбора антибиотика при ОСО в подавляющем большинстве случаев [4]. Представленные в настоящей работе результаты поддерживают данную рекомендацию, поскольку все исследованные изоляты пневмококка из ЖСУ были чувствительны к амоксициллину.
Анализ распределения серотипов пневмококка при ОСО показал преобладание типичных
«педиатрических» серотипов, которые были распространены во многих странах до введения ПКВ [12]. Наиболее часто встречались изоляты серогруппы 19, составив 36% спектра серотипов. В отличие от других стран, мы наблюдали сравнительно высокую долю пневмококков серотипа 3 (12%). Большинство пневмококков со сниженной чувствительностью к антибиотикам принадлежали к серогруппам 19 и 6 и к серотипу 14. Таким образом, композиция серотипов прогнозирует хороший охват циркулирующих пневмококков имеющимися ПКВ, включая нечувствительные штаммы.
ПКВ зарекомендовали себя как важный инструмент для снижения бремени пневмококковых инфекций, связанных с вакцинными серотипами, включая ОСО [12, 14, 16]. В 2014 году иммунизация ПКВ была введена и в российский календарь прививок [19]. Отметим, что современная сероэпидемио-логия и молекулярно-генетические характеристики пневмококков в России обосновывают использование ПКВ с расширенным охватом серотипов, включая серотип 19А, даже несмотря на относительно небольшую долю этого серотипа среди циркулирующих штаммов [28, 39]. Эта мера будет способство-
вать ограничению возможной экспансии предсуще-ствующих клонов СС320 с множественной устойчивостью к антибиотикам через механизм «переключения» капсулы под давлением вакцинации.
Таким образом, наше исследование показало широкую распространенность устойчивости к антибиотикам среди штаммов пневмококка, вызывающих ОСО, которая возросла в последние годы. Это требует срочных мер по изменению сложившейся практики назначения и использования антибиотиков. Описанные изоляты пневмококка с множественной устойчивостью принадлежали к ограниченному числу клональных линий, которые не были описаны в России ранее. В связи с этим необходимость тщательного наблюдения за распространением и эволюцией резистентных пневмококков после начала широкой вакцинации ПКВ в нашей стране не вызывает сомнений.
Выражение признательности
Исследование было выполнено при частичной поддержке гранта на проведение независимого исследования от компании Pfizer.
Литература
1. Баранов А.А., Намазова Л.С., Таточенко В.К. Пневмококковая инфекция и связанные с ней заболевания — серьезная проблема современного здравоохранения. Педиатрическая фармакология 2008; 5, 2:7-12.
2. Маянский Н.А., Алябьева Н.М., Иваненко А.М., Пономаренко О.А., Катосова Л.К., Лазарева А.В., Куличенко Т.В., Намазова-Баранова Л.С. Бактериальная этиология острого среднего отита у детей до 5 лет: роль Streptococcus pneumonrne. Вопросы диагностики в педиатрии 2013; 5, 3:5-13.
3. Vergison A. Microbiology of otitis media: a moving target. Vaccine 2008; 26S: G5-G10.
4. Lieberthal A.S., Carroll A.E., Joffe M.D., et al. The diagnosis and management of acute otitis media (clinical practice guideline). Pediatrics 2013; 131: e964.
5. Monasta L., Ronfani L., Marchetti F., et al. Burden of disease caused by otitis media: systematic review and global estimates. PLoS One 2012; 7(4): e36226.
6. Reinert R.R. The antimicrobial resistance profile of Streptococcus pneumoniae. Clin Microbiol Infect 2009; 15 (Suppl. 3):7-11.
7. Linares J., Ardanuy C., Pallares R., Fenoll A. Changes in antimicrobial resistance, serotypes and genotypes in Streptococcus pneumoniae over a 30-year period. Clin Microbiol Infect 2010; 16:402-10.
8. Hackel M., Lascols C., Bouchillon S., et al. Serotype prevalence and antibiotic resistance in Streptococcus
pneumoniae clinical isolates among global populations. Vaccine 2013; 31:4881-7.
9. Geng Q., Zhang T., Ding Y., et al. Molecular characterization and antimicrobial susceptibility of Streptococcus pneumoniae isolated from children hospitalized with respiratory infections in Suzhou, China. PLoS One 2014; 9: e93752.
10. Маянский Н.А., Алябьева Н.М., Лазарева А.В., Катосова Л.К. Серотиповое разнообразие и резистентность пневмококков. Вестник РАМН 2014; 7-8:38-45.
11. Wyres K.L., Lambertsen L.M., Croucher N.J., et al. Pneumococcal capsular switching: a historical perspective. J Infect Dis 2013; 207:439-49.
12. Rodgers G.L., Arguedas A., Cohen R., Dagan R. Global serotype distribution among S. pneumoniae isolates causing otitis media in children: potential implications for pneumococcal conjugate vaccines. Vaccine 2009; 27:3802-10.
13. Richter S.S., Heilmann K.P., Dohrn C.L., et al. Pneumo-coccal serotypes before and after introduction of conjugate Vaccines, United States, 1999-2011. Emerg Infect Dis 2013; 19:1074-83.
14. Azzari C., Martinon-Torres F., Schmitt H.J., Dagan R. Evolving role of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in clinical practice. Pediatr Infect Dis J 2014; 33:858-64.
15. Moore M.R., Gertz R.E. Jr, Woodbury R.L., et al. Population snapshot of emergent Streptococcus pneumoniae serotype 19A in the United States, 2005. J Infect Dis 2008; 197:1016-27.
16. Gene A., del Amo E., Inigo M., et al. Pneumococcal serotypes causing acute otitis media among children in Barcelona (1992-2011): emergence of the multiresistant clone S.T320 of serotype 19A. Pediatr Infect Dis J 2013; 32: e128-33.
17. Croucher N.J., Harris S.R., Fraser C., et al. Rapid pneumococcal evolution in response to clinical interventions. Science 2011; 331:430-4.
18. Weinberger D.M., Malley R., Lipsitch M. Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination. Lancet 2011; 378:1962-73.
19. Приказ Министра здравоохранения Российской Федерации от 21 марта 2014 г. N125h г. Москва «Об утверждении национального календаря профилактических прививок и календаря профилактических прививок по эпидемическим показаниям».
20. Баранов А.А., Намазова-Баранова Л.С., Маян-ский Н.А., Куличенко Т.В., Полунина Т.А., Лазарева А.В. и соавт. Роль Streptococcus pneumoniae в структуре бактериальных инфекций у детей, госпитализированных в стационары г. Москвы в 20112012 гг. Педиатрическая фармакология 2013; 10(5):6-12.
21. Leclercq R., Canton R., Brown D.F., et al. E.T expert rules in antimicrobial susceptibility testing. Clin Microbiol Infect 2013; 19:141-60.
22. Алябьева Н.М. Серотипы и устойчивость к антибиотикам штаммов Streptococcus pneumoniae, выделенных у детей при респираторных инфекциях: Дисс... канд. мед. наук. Москва, 2014, 98 с.
23. Enright M.C., Spratt B.G. A multilocus sequence typing scheme for Streptococcus pneumoniae: identification of clones associated with serious invasive disease. Microbiology 1998; 144:3049-60.
24. Multi Locus Sequence Typing: Streptococcus pneumoniae [database online]. Режим доступа: http://pubmlst.org/ spneumoniae.
25. Катосова Л.К., Очкасов А.В., Богомильский М.Р. Этиология и рациональная терапия тяжелых форм острых средних гнойных отитов у детей. Антибиот химиотер 2006; 2:23-9.
26. Козлов Р.С., Сивая О.В., Кречикова О.И., Иван-чик Н.В., группа исследователей проекта «ПеГАС». Динамика резистентности Streptococcus pneumoniae к антибиотикам в России за период 1999-2009 гг. Клин микробиол антимикроб химиотер 2010; 12(4):269-368.
27. Козлов Р.С., Чагарян А.Н., Козлова Л.В., Муравьев А.А. Серологическая характеристика и чувствительность к антибиотикам пневмококков, выделенных у детей в возрасте до 5 лет в отдельных регионах Российской Федерации. Клин микробиол антимикроб химиотер 2011; 13:177-87.
28. Mayanskiy N., Alyabieva N., Ponomarenko O., et al. Serotypes and antibiotic resistance of non-invasive
Streptococcus pneumoniae circulating in pediatric hospitals in Moscow, Russia. Int J Infect Dis 2014; 20:58-62.
29. Сидоренко С.В., Савинова Т.А., Ильина Е.Н., Сырочкина М.А. Популяционная структура пневмококков со сниженной чувствительностью к пенициллину и перспективы антипневмококковой вакцинации для сдерживания распространения антибактериальной резистентности. Антибиот химиотер 2011; 56(5-6):11-8.
30. Pillai D.R., Shahinas D., Buzina A., et al. Genome-wide dissection of globally emergent multi-drug resistant serotype 19A Streptococcus pneumoniae. BMC Genomics 2009; 10:642.
31. van der Linden M., Winkel N., Küntzel S., et al. Epidemiology of Streptococcus pneumoniae serogroup 6 isolates from IPD in children and adults in Germany. PLoS One 2013; 8: e60848.
32. Aguiar S.I., Pinto F.R., Nunes S., et al. Denmark14-230 clone as an increasing cause of pneumococcal infection in Portugal within a background of diverse serotype 19A lineages. J Clin Microbiol. 2010; 48:101-8.
33. Hsieh Y..C, Lin T.L., Chang K.Y., et al. Expansion and evolution of Streptococcus pneumoniae serotype 19A ST320 clone as compared to its ancestral clone, Taiwan19F-14 (ST236). J Infect Dis 2013; 208:203-10.
34. Dagan R., Givon-Lavi N., Leibovitz E., et al. Introduction and proliferation of multidrug-resistant Streptococcus pneumoniae serotype 19A clones that cause acute otitis media in an unvaccinated population. J Infect Dis 2009; 199:776-85.
35. Moore M.R. Rethinking replacement and resistance. J Infect Dis 2009; 199:771-3.
36. Goossens H., Ferech M., Vander Stichele R., Else-viers M.; ESAC Project Group. Outpatient antibiotic use in Europe and association with resistance: a cross-national database study. Lancet 2005; 365:579-87.
37. Rachina S., Kozlov R., Jarkova L., Belkova Y., Tato-chenko, V., and PATRIOT study group. Prescribing of systemic antimicrobials for respiratory infections in children in primary care in Russia [Abstract P0370]. Proceedings of the 24th ECCMID 2014 Barcelona, Spain.
38. Heikkinen T., Saeed K.A., McCormick D.P., et al. A single intramuscular dose of ceftriaxone changes naso-pharyngeal bacterial flora in children with acute otitis media. Acta Paediatr 2000; 89:1316-21.
39. Tatochenko V., Sidorenko S., Namazova-Baranova L., et al. Streptococcus pneumoniae serotype distribution in children in the Russian Federation before the introduction of pneumococcal conjugate vaccines into the National Immunization Program. Expert Rev Vaccines 2014; 13:257-64.
