CC BY
35
Є
Популяционная структура пневмококков со сниженной чувствительностью к пенициллину и перспективы антипневмококковой вакцинации для сдерживания распространения антибактериальной резистентности
С. В. СИДОРЕНКО12, Т. А. САВИНОВА3, Е. Н. ИЛЬИНА4, М. А. СЫРОЧКИНА5
' Научно-исследовательский институт детских инфекций, Санкт-Петербург
2 Кафедра микробиологии Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И. И. Мечникова, Санкт-Петербург
3 Национальное агентство клинической фармакологии и фармации, Москва
4 Научно-исследовательский институт физико-химической медицины, Москва
5 Кафедра общественного здравоохранения Уральской государственной медицинской академии, Екатеринбург
Population Pattern of Pneumococci with Lower Susceptibility to Penicillin
and Prospects of Antipneumococcal Vaccination to Control Antibiotic Resistance Distribution
S. V. SIDORENKO, T. A SAVINOVA E. N. ILYINA, M. A SYROCHKINA Reserch Institute of Children's Infections, St.Petersburg
Chair of Microbiology, I. I. Mechnikov St.Petersburg State Medical Academy, St.Petersburg National Agency of Clinical Pharmacology and Pharmacy, Moscow Research Institute of Physico-Chemical Medicine, Moscow Chair of Public Health, Urals State Medical Academy, Ekaterinburg
Массовая антипневмококковая вакцинация сопровождается изменениями в серотиповом составе и уровне антибиотико-резистентности пневмококков. Целью настоящей работы была оценка серотипового состава и популяционной структуры пневмококков со сниженной чувствительностью к пенициллину до начала массовой антипневмококковой вакцинации.
Среди 260 изолятов Streptococcus pneumoniae, выделенных в Российской Федерации в 2003—2007 гг., чаще всего встерча-лись серотипы 23F (37,2%) и 19F (13,9%). К серогруппе 6 относились 19,3% изолятов; по 3,6% изолятов относились к се-ротипу 3 и серогруппе 18; 4,9% изолятов — к серотипу 14; 2,2% — к серотипу 19А. К серотипам, входящим в 7-валентную конъюгированную пневмококковую вакцину, относились 66,8% изолятов, в 10-валентную — 67,3%, в 13-валентную — _£^_
82,1%. Изоляты со сниженной чувствительнстью к пенициллину характеризовались выраженной клональностью, 56.9% их них относились к четырём глобальным клональным комплексам (СС81, СС156, СС320 и СС315). Включение конъюгированной антипневмококковой вакцины в национальный календарь прививок Российской Федерации может способствовать снижению уровня антибиотикорезистентности среди пневмококков.
Ключевые слова: пневмококки, резистентность, вакцинация.
Large-scale antipneumococcal vaccination is followed by changes in the serotype composition and level of antibiotic resistance in pneumococci. The aim of the study was to evaluate the serotype composition and population pattern of pneumococci with lower susceptibility to penicillin before large-scale antipneumococcal vaccination. Among 260 Streptococcus pneumoniae strains isolated in the Russian Federation within 2003—2007, serotypes 23F (37.2%) and 19F (13.9%) were the most frequent ones. 19.3% of the isolates belonged to serogroup 6, 3.6% of the isolates each belonged to serotype 3 and serogroup 18, 4.9% of the isolates belonged to serotype
14 and 2.2% of the isolates belonged to serotype 19A. 66.8% of the isolates belonged to serotypes of the 7-valent conjugated pneumococcal vaccine, 67.3 and 82.1% of the isolates belonged to the 10- and 13-valent conjugated pneumococcal vaccines respectively. The isolates with lower susceptibility to penicillin were characterized by significant clonality and 56.9% of them belonged to 4 global clonal complexes (CC81, CC156, CC320 and CC315). Inclusion of the conjugated antipneumococcal vaccine to the National Vaccination Time-Table of the Russian Federation could promote lower levels of antibiotic resistance in pneumococci.
Key words: pneumococci, resistance, vaccination.
Введение
Вакцинация и антибактериальная терапия составляют основу профилактики и лечения подавляющего большинства инфекционных болезней, в том числе и различных форм пневмококковый инфек-
© Коллектив авторов, 2011
Адрес для корреспонденции: 197022, Россия, г. Санкт-Петербург, Профессора Попова ул., д. 9 НИИ детских инфекций
ций: от лёгких (отит и синусит) и до крайне тяжёлых (менингит). Основное место в лечении пневмококковый инфекций занимают две группы антибиотиков: беталактамы и макролиды. Несмотря на существенные различия, в болышинстве регионов мира отмечают тенденции к росту среди пневмококков устойчивости к указанным антибиотикам.
Применение классического серотипирования и мулытилокусного сиквенс-типирования (МЬ8Т —
-е-
Є
multiloccus sequence typing) позволило установить, что большинство изолятов устойчивых пневмококков относятся к ограниченному кругу генетических линий. В рамках сети молекулярной эпидемиологии пневмококков (Pneumococcal Molecular Epidemiology Network — PMEN, http://www.sph.emory.edu/ PMEN/index.html) описано 43 глобальных клона, при этом 31 из них относятся к ограниченному числу серотипов (из 93 известных): 1, 6A, 6B, 14, 15A, 19F, 19A и 23F [1]. По данным MLST, каждый из этих клонов относится к определённому сиквенс-типу (sequence type — ST).
Ограниченность клонального и серотипового состава устойчивых пневмококков открывает возможность сдерживания их распространения путём вакцинации. Однако до недавнего времени реализация этой стратегии сдерживалась низкой имму-ногенностью полисахаридных вакцин у детей до двух лет, являющихся основным резервуаром пневмококков в человеческой популяции. Разработка и внедрение конъюгированных полисахаридных вакцин позволили преодолеть это ограничение. Массовое применение пневмококковой конъюгированной 7-валентной вакцины (ПКВ7) в США и других странах привело к значительному снижению заболеваемости тяжёлыми инвазивными пневмококковыми инфекциями, вызываемыми «вакцинными» серотипами, но сопровождалось относительным увеличением заболеваемости, связанной с серотипами, не входящими в состав ПКВ7 [2].
Быстрые изменения, происходящие в популяционной структуре пневмококков на фоне вакцинации, резко повысили требования к методам наблюдения за этими бактериями. Значительное расширение объёмов исследований по серотипи-рованию пневмококков стало возможным после разработки молекулярных методов типирования пневмококковых полисахаридов [3].
В Российской Федерации разрешена к применению пневмококковая конъюгированная семивалентная вакцина (ПКВ7), однако вакцинация не носит массового характера, поскольку вакцина не включена в национальный календарь прививок. Ожидается регистрация десяти- и тринадцативалентных конъюгированных вакцин. Есть основания предполагать, что в обозримом будущем вакцинация против пневмококковой инфекции будет включена в национальный календарь иммунизации. В этом случае следует ожидать изменений в популяционной структуре и распространении резистентности пневмококков. Адекватно оценить эти изменения и осуществить прогноз дальнейшего развития событий возможно лишь при наличии исходных данных. Приведённые факты обосновывают актуальность цели настоящее работы — оценку популяционной структуры антибиотикорезистентных пневмококков, циркулирующих в Российской Федерации.
Материал и методы
Изоляты. В исследование включены 260 изолятов S.pneumo-niae со сниженной чувствительностью к пенициллину (МПК > 0,06 мкг/мл), отобранные из 2117 изолятов, выделенных в ходе многоцентровых исследований в период 2003—2007 гг. в Центральном (Москва, Ярославль), Cеверо-Западном (Cанкт-Петер-бург), ^бирском (Иркутск, Томск) и Дальневосточном (Владивосток) федеральных округах от пациентов с инфекциями верхних и нижних дыхательных путей (отит, синусит, тонзилло-фарингит, обострение хронического бронхита и пневмония). Из стерильных локусов организма человека (кровь, ликвор, аутоп-сийный материал) получено 3,6% изолятов пневмококков. Около половины изолятов S.pneumoniae, включённых в настоящее исследование, выделено от детей первых пяти лет жизни.
Выделение геномной ДНК S.pneumoniae. Для выделения тотальной ДНК использовали набор «ДНК-экспресс» (НПФ «Литех», Россия).
Амплификация фрагментов генома. Для амплификации фрагментов 7 генов «домашнего хозяйства», используемых для последующего мультилокусного сиквенс-типирования (MLST), использовали ранее рекомендованные праймеры [4].
Для ПЦР-типирования капсульных антигенов использовали предложенные ранее праймеры (http://www.cdc.gov/nci-dod/biotech/files/pcr-oligonucleotide-primers-March2010.pdf), [3], специфичные к вариабельным участкам генов cps, кодирующих капсульные полисахариды следующих серотипов/серо-групп: 1, 2, 3, 4, 5, 6A/6B/6C, 7F/7A, 7C/(7B/40), 8, 9L/9N, 9V/9A, 10A, 10F/(10C/33C), 11A/11D, 12F/(12A/44/46), 13, 14, 15A/15F, 15B/15C, 16F, 17F, 18A/18B/18C/18F, 19A, 19F, 20, 21, 22A/22F, 23A, 23B, 23F, 24A/24B/24F, 31, 33F/(33A/37), 34, 35A/(35C/42), 35B, 35F/47F, 38F/25F, 39F.
Для амплификации генов «домашнего хозяйства» использовали следующий температурный профиль: 94°C — 2 мин; 94°C — 15 сек., 56°C — 30 сек., 72°C — 30 сек., 35 циклов; 72°C — 10 мин; 4°C — хранение.
Фрагменты cps-генов, кодирующих капсульные полисахариды, амплифицировали по следующему температурному профилю: 94°C — 2 мин; 94°C — 15 сек., 56°C — 10 сек., 72°C —
15 сек., 35 циклов; 72°C — 10 мин; 4°C — хранение.
Продукты амплификации детектировали в 2% агарозном геле (Sigma, C0A) с последующей визуализацией бромистым этидием (МеЛ, Германия) при УФ-излучении (Я=310 нм). Размеры ПЦР-продуктов определяли сравнением с маркёром молекулярного веса ДНК (100 bp DNA Ladder; Fermentas, Литва).
Секвенирование генов «домашнего хозяйства» и cps-генов. Определение нуклеотидных последовательностей фрагментов семи генов «домашнего хозяйства» и cps-генов проводили модифицированным методом Cенгера с использованием набора ABI Prism® BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit согласно рекомендациям производителя. В реакции секвенирования генов «домашнего хозяйства» и генов капсульных полисахаридов использовали те же праймеры, что и в реакции амплификации.
Мультилокусное сиквенс-типирование. Анализ последовательностей генов «домашнего хозяйства» с определением сик-венс-типов (ST) проводился с использованием базы данных MLST (http://spneumoniae.mlst.net). Для установления связей анализируемых изолятов друг с другом и с охарактеризованными изолятами из базы данных (определение принадлежности к клональным комплексам) и построения диаграмм использовался алгоритм eBURSTv3 [5], интегрированный в MLST-вебсайт (http://eburst.mlst.net).
Результаты исследования
Изоляты. Cреди изолятов пневмококков с высоким уровнем устойчивости к пенициллину (МПК ^ 2) 85,9% были устойчивы к эритромицину. Cреди изолятов пневмококков с промежуточ-
О
Рис. 1. Примеры мультипраймерных реакций.
М - маркёр молекулярных масс.
ным уровнем устойчивости к пенициллину (МПК 0,125—1,0 мкг/мл) доля резистентных к эритромицину составляла 28,1%. Также был зафиксирован высокий уровены перекрестной устойчивости между в-лактамными антибиотиками и линкозамидами (79,3%), ко-тримоксазолом (81,5%) и тетрациклином (89,2%). Однако к ко-тримоксазолу и тетрациклину были устойчивы 32,2 и 22,7% пенициллиночувствителыных изоля-тов соответственно.
Оптимизация протокола мультиплексной ПЦР для типирования капсульных антигенов. Праймеры, специфичные к вариабелыным участкам генов, кодирующих капсулыные полисахариды, бы-
80
70
50
40
30
20
10
83
31
п
пл И 13 8 7 ■ 8
1 1 34 г 2 1 1 4 1 1 3 4 3 21
< < чэ < <
Серотип/серогруппа
Рис. 2. Распределение серотипов/серогрупп среди изолятов, выделенных на территории России.
Чёрным цветом выделены серотипы, входящие в 7-валентную вакцину, светло-серым - в 10-валентную, тёмно-серым - в 13-валентную.
ли протестированы на ограниченной группе изолятов с известными серотипами, что позволило оптимизироваты условия мулытипраймерной ПЦР по сравнению с вариантами, предложенными в статыях [3, 6]. В резулытате внесённых изменений разработанная схема представляла собой каскад из 10 мулытиилексных реакций, проводимых последователыно [7].
Температура и время отжига и элонгации были оптимизированы таким образом, чтобы в резулытате реакции амплифицировалисы участки размером 98—816 п.н. (рис. 1).
В целом, праймерные системы оптимизиро-валисы так, чтобы в ходе первых четырех раундов амплификации удалосы установить серотипы/серогруппы для 94,2% клинических изолятов Б.рпеытотае.
Валидация метода ПЦР-типирования капсульных антигенов. С целыю валидации метода ПЦР - типирования
капсулыных антигенов осуществлено определение сероти-пов выборки пневмококков (п=101), которое проводили в реакции набухания со специфическими антисыворотками (табл. 1).
Резулытаты мулытипраймерной ПЦР полностыю совпадали с резулытатами классического серотипирования. Для 59,4% (60/101) изолятов определен один из 10 отделы-ных серотипов. Часты изолятов (38,6%) удалосы типиро-ваты толыко до уровня серогруппы (например, 6 серо-
■е
е
Таблица 1. Валидация метода ПЦР-типирования капсульных антигенов
ПЦР-типирование Классическое серотипирование Секвенирование фрагмента срт-гена
серотипы число изолятов (%) и=101 серотипы число изолятов (%) и=35
1 1 1(1,0) * —
3 3 3 (3,0) 3 1 (2,9)
4 4 1 (1,0) — —
6А/6В/6С 6А 7 (6,9) 6А 1 (2,9)
6В 23 (22,8) 6В 7 (20,0)
9У/9А 9А 1 (1,0) 9У/9А 1 (2,9)
9К/9Ь 9К 1 (1,0) — —
9Ь 1(1,0) — —
10А 10А 1 (1,0) — —
13 13 1(1,0) — —
14 14 6 (5,9) 14 4 (11,4)
15А/15Р 15А 3 (3,0) 15А 2 (5,7)
19А 19А 2 (2,0) 19А 1 (2,9)
19Б 19Б 14 (13,9) 19Б 6(17,1)
23А 23А 1 (1,0) 23А 1 (2,9)
23Б 23Б 30 (29,7) 23Б 9 (25,7)
35А/35С/42 35С 1 (1,0) — —
35Р/47Р 35Б 2 (2,0) — —
18 (18А/18В/18С/18Р) — — 18 1 (2,9)
11А/11Б — — 11А/11Б 1 (2,9)
Hетииируемые 11В 1 (1,0) — —
17А 1 (1,0) — —
Примечание. * - серотипирование/секвенирование не проводилось.
группа) или до группы серотипов с перекрестной реактивностью (например, 35Р/47Б). Два нетипи-руемыгх молекулярным методом изолята (2%) от-носилисы к серотипам, не включенным в мулыти-праймерные реакции ПЦР (см. табл. 1).
Фрагменты ер8-локусов 35 изолятов были секвенированы. Резулытаты ПЦР-типирования капсулыныгх антигенов и секвенирования соответствующих ампликонов также полностыю совпадали (табл. 2).
ПЦР-типирование капсульных антигенов. Из проанализированной выборки 24 изолята (9,2%) быши отрицателыными по ер8А-локусу, консервативному для пневмококков. Данные изоляты быши исключены из далынейшего анализа. Из оставшихся 236 изолятов положителыных по ер8Д-локусу се-ротипы быши определены у 94,5% (223). Невоз-можносты серотипироваты 5,5% изолятов может быты связана с присутствием серотипов, не включенных в мулытиплексные реакции, или с бактери-алыной нагрузкой в образце ниже предела чувстви-телыности мулытипраймерной ПЦР.
Из 39 пар праймеров толыко 22 обладали полной специфичностью в отношении конкретных серотипов, 17 пар праймеров были специфичны в отношении серогрупп (6, 1 , 22, 24) или 2-4 серотипов, относящихся к одной серогруппе или обладающих перекрестной реактивностью (например, 9У/9Д, 11А/1Ю, 33Б/33А/37, 35А/35С/42).
Наиболее распространёнными оказалисы се-ротипы 23Б (37,2%) и 19Б (13,9%). К серогруппе 6 относилисы 19,3% изолятов: к серотипу 6В — 10,3%, к 6А — 3,1% (5,8% изолятов 6 серогруппы
не были дифференцированы на серотипы). По 3,6% изолятов относилисы к серотипу 3 и серогруппе 18, а 4,9% изолятов — к серотипу 14. Семы (3,1%) и пяты (2,2%) изолятов относилисы к серотипам 6А и 19А соответственно (рис. 2).
К серотипам, входящим в 7-валентную пневмококковую вакцину, относилисы 66,8% изолятов, в 10-валентную — 67,3%, в 13-валентную — 82,1%.
Мультилокусное сиквенс-типирование. Из числа изолятов со сниженным уровнем устойчивости к пенициллину 58 проанализированы методом мулытилокусного сиквенс-типирования. Характеристика изолятов, относящихся к клоналыным комплексам с двумя и более изоля-тами и/или связанных с глобалыными клонами по номенклатуре РМЕМ, представлена в табл. 2.
Наиболышее количество изолятов (п=15) от-носилосы к СС81, все они демонстрировали сик-венс-тип 81 и серотип 23Б. К СС81 относится глобалыныш клон 8рат23р-1, устойчивый к пенициллину, тетрациклину и хлорамфениколу, но чувствителыныш к макролидам. В Москве выщеле-ны 14 из 15 изолятов, сходных по профилю анти-бактериалыной резистентности. Высокий уровены устойчивости к макролидам связан с одновременным наличием ет(В) и теДЕ) генов. У двух изолятов уровены устойчивости к пенициллину был несколыко ниже, чем у осталыныгх, а у двух других вымвлена устойчивость к левофлоксаци-ну. Изолят, выщеленный во Владивостоке, отличался от московских отсутствием теД(Е) гена. Все изоляты были устойчивы к хлорамфениколу и тетрациклину.
%
I
§
СП
s
0 § §
1 s
0
1 I
Ki
o
Os
I
Os
Таблица 2. Клональная структура, серотиповый состав и ассоциированная антибиотикорезистентность изолятов Б.рпечтотае, со сниженной чувствительностью к пенициллину
сс Связь с глобальным ST n Серотип МПК антибиотиков, мкг/мл Генотип Регаон
клоном пенициллин эритромицин левофлоксацин тетрациклин хлорамфеникол устойчивости к макролидам
81 Spain™-1 81 2 23F 0,125-0,25 >32 1 16 16 егт{В) + теДЕ) Москва
10 23F 2-8 >32 1-2 4->32 16
2 23F 4 >32 4-8 8 16
1 23F 2 >32 8 8 16 егт{В) Владивосток
156 Spain9V-3 790 1 14 2 >32 1 0,25 4 егт{В) Санкт-Петербург
143 1 14 4 >32 1 >32 2 Москва
608 1 19A 4 0,06 1 0,25 2 Москва
239 1 9V/A 1 0,125 1 16 2 — Санкт-Петербург
239 1 NT 1 0,12 1 16 2 Москва
93 1 6A 1 >32 1 32 64 егт{В) Москва
2009 1 6B 0,25 0,3 2 32 2 — Москва
4282 1 NT 1 0,3 1 32 2 Москва
320 Taiwan™-14 236 1 19F 4 >32 0,5 16 2 егт( В) + теДЕ) Москва
1 19F 2 0,25 1 32 2 — Москва
1 19F 0,25 <0,015 0,5 0,125 2 Владивосток
1 19A 1 >32 0,5 16 2 егт( В) + теДЕ) Москва
271 1 19F 1 >32 1 32 4 егт( В) + теДЕ) Иркутск
651 1 19F 2 2 1 32 2 теДЕ) Москва
315 Polandt;B-20 315 6B 0,125 >32 1 32 4 егт( В) Москва («=2), Иркутск («=2)
30 1500 1 6A 0,125 2 1 0,125 2 теДЕ) Иркутск («=1)
23F 0,125 0,03 1 0,06 2 — Москва («=2), Иркутск («=1)
1012 1012 1 33F/A/37 0,5 <0,007 0,5 8 2 — Москва
1012 1 11 A/D 0,5 8 1 4 8 Санкт-Петербург
15 423 1 19F 0,25 0,125 0,5 32 4 — Иркутск
4844 1 6B 1 0,125 1 32 2
230 Denmark14-32 230 1 19F 0,5 0,03 1 32 2 — Москва
ИЗ Netherlandslsc-36 123 1 23F 0,25 0,03 1 4 2 — Москва
63 Sweden15A-25 3816 1 14 0,125 >32 1 32 4 егт( В) Иркутск
0 ~0
3
5
1 O'
пї
О
2
S
e
Вторым по количеству был CC156 (8 изоля-тов). Родоначальником этого клонального комплекса считается ST156, с которым связан глобальный клон Spain9V-3. CC156 является самым широко распространённым и гетерогенным клональным комплексом. По состоянию на май 2011 он насчитывает 884 сиквенс-типа (www.mlst.net). Выявленные в настоящем исследовании в Москве и Санкт-Петербурге сиквенс-типы являются либо однолокусными вариантами (single locus variant — SLV) ST156, например ST608, либо лишь отдаленно с ним связаны, например ST2009. Лишь один сиквенс-тип (ST239) представлен двумя изолятами. Изоляты СС156 относились к серотипам 6А, 6В, 9V/N, 14 и 19А.
Разнообразие серотипового состава СС156 хорошо известно. Так, в Бельгии среди изолятов этого клонального комплекса преобладают серо-типы 9V и 14 [8], в Финляндии преобладает 14 се-ротип [9], в США — серотипы 6B, 9A, 9N, 9V, 14 [10], в Южной Корее — 9V и 11А [11]. Профиль антибиотикорезистентности у изученных изолятов также варьировал. Три изолята были устойчивы к макролидам (наличие erm(B) гена), шесть изолятов устойчивы к тетрациклину и один — к хлорамфениколу.
К клональному комплексу 320 относились шесть изолятов, выделенных в Москве, Владивостоке и Иркутске. Родоначальником этого клонального комплекса по eBURST рассматривается ST320, с ним связан глобальный клон Taiwan19F-14, относящийся к ST236. К указанному сиквенс-типу относятся четыре из шести изолятов, по одному изоляту относятся к ST271 и ST651 соответственно. Пять из шести изолятов демонстрировали серотип 19F, а в одном случае был выявлен серотип 19А. Четыре изолята были устойчивы к макролидам, три из них обладали генами erm(B) и mef(E) одновременно, один изолят — только mef(E) геном. Пять из шести изолятов были устойчивы к тетрациклину, все сохраняли чувствительность к хлорамфениколу.
Четыре генетически и фенотипически идентичных изолята относились к клональному комплексу СС315, сиквенс-типу ST315, серотипу 6В, два из них были выделены в Москве, два — в Иркутске. Все изоляты демонстрировали низкий уровень устойчивости к пенициллину, были устойчивы к макролидам (обладали геном erm(B)). СС315 связан с глобальным клоном Poland6B-20.
К СС30, не связанному с глобальными клонами, относились четыре изолята ST1500, выделенные в Москве и Иркутске. Один изолят, выделенный от пациента из Иркутска, был устойчив к макролидам и обладал mef(E) геном.
По два изолята из Москвы и Санкт-Петербурга относились к клональным комплексам СС15 и СС1012, не связанным с глобальными клонами.
Изоляты относились к различным серотипам, характеризовались невысоким уровнем устойчивости к пенициллину, устойчивостью к тетрациклину. В отношении одного изолята МПК эритромицина составила 8,0 мкг/мл, однако erm(B) или mef(E) обнаружено не было.
По одному изоляту относилось к клональным комплексам, связанным с глобальными клонами Denmark14-32, Netherlands18C-36 и Sweden15A-25. Все они относились к различным сиквенс-типам, характеризовались невысоким уровнем устойчивости к пенициллину, устойчивостью к тетрациклину и чувствительностью к хлорамфениколу. Изолят CC63, ST3816 (Sweden15A-25) был также устойчив к макролидам и обладал геном erm(B).
По одному изоляту из Москвы, Санкт-Петербурга, Томска и Иркутска относилось к восьми клональным комплексам СС2779, СС490, СС102, СС346, СС439, СС801, СС180, и СС4746. Все они относились к различным серотипам, характеризовались невысоким уровнем устойчивости к пенициллину и чувствительностью к другим антибиотикам. Исключение составили: изолят ST3403 (CC490), устойчивый к макролидам (ген erm(B)) и изолят ST42 (CC439), устойчивый к тетрациклину. Шесть генетически и фенотипически разнородных изолятов относились к генетически обособленным (singletons).
Таким образом, около 56,9% проанализированных клинических изолятов с повышенной устойчивостью к пенициллину, циркулирующих в России, относились к четырем глобальным клональным комплексам (СС81, СС156, СС320 и СС315). Независимое формирование перечисленных клональных комплексов на территории Российской Федерации является маловероятным, скорее всего, произошёл их импорт из других географических регионов.
Обсуждение результатов
Полученные в ходе настоящего исследования результаты свидетельствуют о выраженной кло-нальности не чувствительных к пенициллину штаммов, циркулирующих на территории Российской Федерации. Более 66% изолятов относятся к 5 серотипам, входящим в ПКВ7 (4, 6В, 14, 19F и 23F).
В связи с этим интересно проанализировать данные США, как по общей динамике резистентности, так и по серотиповому составу устойчивых штаммов. В США с начала 90-х годов отмечали стабильную тенденцию к росту устойчивости пневмококков к макролидам и беталактамам. Максимум был отмечен в 2000—2001 гг., к началу массового применения ПКВ7. По одним данным частота высокого уровня устойчивости к пенициллину (МПК > 2,0 мкг/мл) в это время достигла 30%
[12], по другим — не превысила 10% [13]. В этот период около 90% пенициллиноустойчивых пнев-
e
мококков относились к серотипам, входящим в состав ПКВ7 (6B, 9V, 14, 19F, 23F). Начиная с 2002, вслед за внедрением массовой вакцинации ПКВ7, был отмечен короткий период снижения частоты устойчивости к беталактамам и макроли-дам, который в 2004 г сменился новым подъёмом
[13], сопровождавшимся значительными изменениями серотипового состава устойчивых пневмококков. В 2004—2005 гг. на фоне резкого снижения количества случаев заболеваний инвазивными пневмококковыми инфекциями доля вакцинных серотипов снизилась до 40%, при этом доля серо-типа 19А возросла с 1,5% до 35% [14].
В Испании и Великобритании после начала массовой вакцинации ПКВ7 также отмечают снижение уровня резистентности пневмококков к беталактамам и макролидам при увеличении роли серотипа 19А [15, 16], но возобновления роста резистентности не отмечают, что, возможно, связано с меньшей длительностью периода наблюдения. Однако влияющие на динамику серотипов и резистентности факторы, вероятно, нельзя ограничить вакцинацией. Так, в Испании тенденция к снижению частоты резистентности к беталактамам и макролидам выявлена еще до начала применения ПКВ7, а в Корее и Польше доля серотипа 19А возросла еще до внедрения массовой вакцинации против пневмококковой инфекции [17].
Большинство не чувствительных к пенициллину изолятов серотипа 19А в США относятся к СС320. Изначально пенициллиноустойчивые пневмококки клонального комплекса СС320, связанного с глобальным клоном Taiwan19F-14, относились к «вакцинному» серотипу 19F. С 2001—2002 гг. начали выявляться изоляты СС320, относящиеся к «невакцинному» серотипу 19А [18]. Появление таких изолятов связывают с феноменом «переключения» серотипов, заключающимся в приобретении отдельными генетическими линиями новых генов биосинтеза капсульных полисахаридов в результате горизонтального генетического обмена под влиянием селективного прессинга ПКВ7 [19, 20]. Феномен «переключения» серотипов на 19А отмечен еще у нескольких клональных комплексов
ЛИТЕРАТУРА
1. McGee L, McDougal L., Zhou J. et al. Nomenclature of major antimicrobial-resistant clones of Streptococcus pneumoniae defined by the pneumococcal molecular epidemiology network. J Clin Microbiol 2001, 39: 7: 2565—2571.
2. Pilishvili T, Lexau C., Farley M.M. et al. Sustained reductions in invasive pneumococcal disease in the era of conjugate vaccine. J Infect Dis 2010, 201: 1: 32—41.
3. Pai R, Gertz R. E, Beall B. Sequential multiplex PCR approach for determining capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae isolates. J Clin Microbiol 2006, 44: 1: 124—131.
4. Enright M. C., Spratt B. G. A multilocus sequence typing scheme for Streptococcus pneumoniae: identification of clones associated with serious invasive disease. Microbiology 1998, 144: Pt 11: 3049—3060.
[21]. Распространение в «поствакцинальную» эру пневмококков серотипа 6С [22] также, вероятно, связано с «переключением» некоторых генетических линий с серотипов 6А и 6В, а также с серотипов 3 и 34. Около 50% изолятов серотипа 6 С проявляют низкий уровень устойчивости к пенициллину и другим антибиотикам [23].
Практически важным представляется выявление в России изолята СС320 серотипа 19А до начала массового применения конъюгированных вакцин. Вполне вероятно, что эпизоды переключения представителей СС320 с серотипа 19F на 19А происходят независимо от вакцинации, последняя лишь способствует селекции серотипа 19А. Очевидно, что использование для массовой иммунизации ПКВ13 имеет преимущество перед 7- и 10-валентными вакцинами, поскольку может предотвратить распространение потенциально наиболее опасного серотипа 19А. Кроме серотипа 19А, в состав ПКВ13 также входят способные к распространению серотипы 6А и 3. В целом, ПКВ13 перекрывает 82,1% изолятов не чувствительных к пенициллину пневмококков, циркулирующих в Российской Федерации.
Значительный практический и теоретический интерес представляет дальнейшая динамика популяционной структуры пневмококков и распространение среди них резистентности после ожидаемого в ближайшем будущем начала массового применения конъюгированной пневмококковой вакцины, в состав которой входят серотипы, получившие в последние годы наибольшее распространение, прежде всего 19А. В настоящее время трудно предсказать, как быстро и на каких генетических платформах (сиквенс-типах) смогут сформироваться успешные линии «невакцинных» серотипов. Этот факт обосновывает настоятельную необходимость детального наблюдения за популяционной структурой пневмококков в Российской Федерации, разработки и внедрения новых высокопроизводительных методов типирования этих бактерий.
Работа выполнена при поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований. Проект № 11-04-01733-а.
5. Feil E. J., Li B. C., Aanensen D. M. et al. eBURST: inferring patterns of evolutionary descent among clusters of related bacterial genotypes from multilocus sequence typing data. J Bacteriol 2004, 186: 5: 1518—1530.
6. Saha S., Darmstadt G., Baqui A. et al. Identification of serotype in culture negative pneumococcal meningitis using sequential multiplex PCR: implication for surveillance and vaccine design. PLoS ONE 2008, 3: 10: e3576.
7. Savinova T., Ilina E., Sidorenko S. Serotypes of penicillin non-suscepti-ble Streptococcus pneumoniae (Spn) in pre-vaccination era: possible impact of conjugate vaccines introduction in Russia. 50th Interscience ^nference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Boston, USA September 12—15, 2010 (C2—725).
8. Amrine-Madsen H., Van Eldere J., Mera R. M. et al. Temporal and spatial distribution of clonal complexes of Streptococcus pneumoniae isolates resistant to multiple classes of antibiotics in Belgium, 1997 to 2004. Antimicrob Agents Chemother 2008; 52: 9: 3216—3220.
e
9. Siira L, Rantala M, Jalava J. et al. Temporal trends of antimicrobial resistance and clonality of invasive Streptococcus pneumoniae in Finland, 2002—2006. Antimicrob Agents Chemother 2009; 53: 5: 2066—2073.
10. Beall B, McEllistrem M. C., Gertz R. E. et al. Pre- and postvaccination clonal compositions of invasive pneumococcal serotypes for isolates collected in the United States in 1999, 2001, and 2002. J Clin Microbiol 2006, 44: 3: 999—1017.
11. Eun B. W, Kim S. J., Cho E. Y. et al. Genetic structure of Streptococcus pneumoniae isolated from children in a tertiary care university hospital, in Korea, 1995 to 2005. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 2010, 68: 4: 345—351.
12. Lynch J. P., 3rd, Zhanel G. G. Streptococcus pneumoniae: does antimicrobial resistance matter? Semin Respir Crit Care Med 2009; 30: 2: 210—238.
13. Jones R. N, SaderH. S., Moet G. J., Farrell D. J. Declining antimicrobial susceptibility of Streptococcus pneumoniae in the United States: report from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program (1998—2009). Diagn Microbiol Infect Dis 2010; 68: 3: 334—336.
14. Richter S. S., Heilmann K. P., Dohrn C. L. et al. Changing epidemiology of antimicrobial-resistant Streptococcus pneumoniae in the United States, 2004—2005. Clin Infect Dis 2009, 48: 3: e23—33.
15. Fenoll A., Aguilar L., Vicioso M. D. et al. Serotype distribution and susceptibility of Streptococcus pneumoniae isolates from pleural fluid in Spain from 1997 to 2008. Antimicrob Agents Chemother 2010; 54: 12: 5387—5390.
16. Henderson K. L., Muller-Pebody B., Blackburn R. M., Johnson A. P. Reduction in erythromycin resistance in invasive pneumococci from
young children in England and Wales. J Antimicrob Chemother 2010; 65: 2: 369—370.
17. Perez-Trallero E., Martin-Herrero J. E., Mazon A. et al. Antimicrobial resistance among respiratory pathogens in Spain: latest data and changes over 11 years (1996—1997 to 2006—2007). Antimicrob Agents Chemother 2010; 54: 7: 2953—2959.
18. Pai R., Moore M. R., Pilishvili T. et al. Postvaccine genetic structure of Streptococcus pneumoniae serotype 19A from children in the United States. J Infect Dis 2005; 192: 11: 1988—1995.
19. Moore M. R., Gertz R. E., Woodbury R. L. et al. Population snapshot of emergent Streptococcus pneumoniae serotype 19A in the United States, 2005. J Infect Dis 2008; 197: 7: 1016—1027.
20. Tarrago D., Aguilar L., Garcia R. et al. Evolution of clonal and susceptibility profiles of serotype 19A Streptococcus pneumoniae among invasive isolates from children in Spain, 1990 to 2008. Antimicrob Agents Chemother 2011; 55: 5: 2297—2302.
21. Beall B. W., Gertz R. E., Hulkower R. L. et al. Shifting genetic structure of invasive serotype 19A pneumococci in the United States. Journal of Infectious Diseases 2011; 203: 10: 1360—1368.
22. Nahm M. H., Lin J., Finkelstein J. A., Pelton S. I. Increase in the prevalence of the newly discovered pneumococcal serotype 6C in the nasopharynx after introduction of pneumococcal conjugate vaccine. J Infect Dis 2009; 199: 3: 320—325.
23. Jacobs M. R., Bajaksouzian S., Bonomo R. A. et al. Occurrence, distribution, and origins of Streptococcus pneumoniae serotype 6C, a recently recognized serotype. J Clin Microbiol 2009; 47: 1: 64—72.
-Q-
