CC BY
19
DOI 10.31588/2413-4201-1883-243-3-107-112
УДК 619:636.085.55;579;615.9:637.05
СНИЖЕНИЕ ТОКСИЧНОСТИ КОРМОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИЗОЛЯТОВ
Идиятов И.И. - к.б.н., Тремасова А.М. - д.б.н., Ерошин А.И. - м.н.с., Бирюля В.В. - к.б.н., Тремасов Ю.М. - к.б.н.
ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»
Ключевые слова: комбикорм, микромицеты, микроорганизмы, токсичность, биотестирование, доброкачественность
Keywords: compound feed, micromycetes, microorganisms, toxicity, biotesting, benignity
В условиях интенсивного развития животноводства актуальной является проблема санитарного качества кормов. Изначально главную роль играет нарушение технологии заготовки и хранения кормовой массы, в результате чего обнаруживают низкие показатели эффективности ведения животноводства [9, 13]. К природным контаминантам продовольственного сырья и пищевых продуктов, представляющих реальную опасность для здоровья человека и животных, относятся микоток-сины, что связано с их высокой токсичностью, наличием у большинства из них им-мунодепрессивных, патогенных и канцерогенных свойств [3, 6]. Данные литературных источников свидетельствуют о значительной частоте и степени поражения кормов и пищевых продуктов микотоксинами во всех странах мира [10, 11]. В России, в том числе и в Татарстане, по степени распространенности наибольшее значение имеют микромицеты рода Fusarium и фу-зариотоксины - Т-2 токсин, дезоксинива-ленол и зеараленон [7].
Существует множество методов детоксикации кормов от микотоксинов: химические, физические, биологические и комбинированные. Однако большинство физических и химических методов деток-сикации дорогостоящие, требуют определенных производственных затрат, влияют на показатели качества кормов и незначительно снижают количество микотоксинов. Биологические способы детоксикации предусматривают применение ферментных препаратов и микроорганизмов, ингиби-
рующих развитие продуцентов микотоксинов в желудочно-кишечном тракте животных или выделяющих ферменты, де-структурирующие микотоксины [4, 8, 12]. Изыскание наиболее эффективных методов и средств, способствующих максимальному обезвреживанию микотоксинов в кормах, является на данный момент одной из актуальных задач [2].
Целью настоящего исследования явилась экспериментальная оценка степени влияния микроорганизмов на общую токсичность комбикорма.
Материал и методы исследований. Опыты проводили в условиях отделения токсикологии ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». В экспериментах использовали культуры микроорганизмов Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis, Propionibacte-rium freudenreichii и Bacillus subtilis, выделенные из природных биотопов. Для проведения исследований по оценке эффективности их применения в целях снижения токсичности кормов растительного происхождения изготавливали кормовые гранулы из доброкачественного комбикорма и фунгальной массы на основе зерна пшеницы, содержащей метаболиты штаммов микромицетов Fusarium sporotrichioides, Fusarium oxysporum, Aspergillus flavus. Предварительно оценивали общую токсичность комбикорма и зерна в соответствии с ГОСТ 31674-2012 [1], корма были признаны нетоксичными. Затем культивировали микромицеты в течение 14 суток в жидкой картофельной среде в качалочной колбе в условиях аэрации при скорости
вращения 120 об./мин и температуре 26 0С. Для приготовления фунгальной массы навески промытого зерна помещали в стеклянные флаконы, добавляли дистиллированной воды из расчета 10 мл на 100 г зерна, тщательно перемешивали, выдерживали 1 ч при частом встряхивании и ав-токлавировали при 121 0С в течение 30 минут. После остужения до комнатной температуры зерно контаминировали суспензией микроскопических грибов каждым штаммов в отдельности в концентрации 1х107 спор/мл, тщательно перемешивали. Флаконы помещали в термостат, культивирование микромицетов проводили при температуре 26 0С. Во всех емкостях отмечен рост мицелия, спустя 20 суток содержимое емкостей автоклавировали (при давлении 1 атм., 30 минут), просушивали при 45 0С, размалывали на лабораторной мельнице и перемешивали.
Биотестированием на простейших (Stylonychia mytilus) и кроликах-альбиносах, в остром опыте - на белых крысах, установили токсичность полученной массы (отмечены высокая гибель простейших (выживаемость при исследовании водного раствора ацетонового экстракта составила 28,66±3,29 %, водного экстракта - 70,84±1,66 %), воспалительный процесс у кроликов на обработанном участке кожи, падеж крыс). Затем даную массу смешивали с комбикормом в пропорции 1:100, увлажняли, из полученной смеси формировали гранулы посредством пропускания массы через бытовую мясорубку, подсушивали их в сушильном шкафу при температуре 500С в течение 8 часов.
Культивирование бактериальных штаммов проводили в жидких питательных средах: молочно- и пропионовокис-лых - в модифицированной сывороточной среде в условиях термостата при 30 0С в течение 24 ч., Bacillus subtilis - в мясо-пептонном бульоне, при 37 0С, 72 ч. Концентрацию микробных клеток в суспензиях оценивали методом высева последовательных серийных десятикратных разведений на плотные питательные среды с последующим подсчетом выросших колоний. Затем клеточную суспензию каждого из изолятов вносили в навески полученного
токсичного корма до получения конечного титра микроорганизмов 5x1012 КОЕ/кг, в качестве контроля использовали адекватное количество физиологического раствора. Массу тщательно перемешивали и подсушивали на воздухе. Корм хранили в картонных коробках в прохладном помещении.
Биотестирование проб изготовленного гранулированного корма и обработанного суспензиями микроорганизмов проводили путем извлечения из них различных фракций токсических веществ ацетоном с последующим воздействием этих экстрактов на стилонихий, кроликов (кожная проба) и мышей (острый опыт) [1].
Изучение эффективности отобранных микроорганизмов по снижению токсичности корма при длительном скармливании было проведено на белых крысах, результаты оценивали по анализу интегральных и клинико-гематологических показателей. Опыт проводили на 36 беспородных белых крысах, живой массой 130150 г, разделенных на 6 групп, по 6 голов в каждой (время адаптации перед началом эксперимента составляло не менее 14 дней). Первая группа служила отрицательным контролем и получала в течение 21 суток нетоксичный корм, животные второй группы (положительный контроль) - токсичный (гранулы, контаминированные метаболитами микроскопических плесневых грибов). Крысам 3-6 групп скармливали токсичный корм, обработанный суспензией микроорганизмов Lactobacillus planta-rum, Lactococcus lactis, Propionibacterium
freudenreichii и Bacillus subtilis, соответ-
12
ственно (с титром 5x10 КОЕ/кг корма). Все животные находились в одинаковых условиях содержания, соответствующих зоогигиеническим нормам, имели свободный доступ к кормам согласно суточным нормам, водопой был без ограничений. В начале опыта осуществляли взвешивание крыс, забор и анализ крови общепринятыми методами [5].
На протяжении всего эксперимента проводили оценку поедаемости кормов и каждые 7 дней - анализ динамики живой массы. На 21 сутки опыта всех животных подвергали убою, отбирали и исследовали
пробы крови, оценивали состояние внутренних органов.
Статистическую обработку полученного цифрового материала осуществляли методом вариационной статистики с применением программы Microsoft Excel.
Результаты исследований. При проведении биотестирования проб корма
на стилонихиях установлено, что выживаемость простейших при исследовании водного раствора ацетонового экстракта токсичного корма была ниже в сравнении с контрольным образцом на 49,4 %, обработка же его суспензией микроорганизмов способствовала снижению токсичности (Таблица 1).
Таблица 1 - Токсичность корма, обработанного суспензией изолятов микроорганизмов, на
простейших Stylonychia mytilus
Проба корма Выживаемость простейших, %
К 92,24±1,50*
ТК 42,84±2,63
ТК+Lactobacillus plantarum 73,14±1,97*
ТК+Lactococcus lactis 70,50±1,55*
ТК+Propionibacterium freudenrei chii 74,04±2,11*
ТК+Bacillus subtilis 74,40±0,84*
Примечание: К - корм, ТК - токсичный корм * - различия с ТК достоверны с точностью P <
0,05
Обработка суспензией Lactococcus lactis достоверно повышала выживаемость стилонихий на 27,7 %, Lactobacillus planta-rum, Propionibacterium freudenreichii и Bacillus subtilis - на 30,3; 31,2 и 31,6 %, соответственно.
Исследование на кроликах и мышах позволило учесть дермонекротическое действие веществ корма и их воздействие на пищеварительную систему животных. Было установлено, что двукратное накожное нанесение с последующим втиранием масляного раствора ацетонового экстракта контрольного образца корма не вызывало каких-либо изменений. При исследовании проб токсичного корма отмечены гиперемия, точечные кровоизлияния, уплотнение, болезненность и шелушение кожи. Нанесение на выстриженные участки кожи кролика экстрактов корма, обработанного суспензиями микроорганизмов способствовало появлению гиперемии, сохраняющейся не более 1-2 суток, другие признаки воспалительной реакции отсутствовали.
Однократное пероральное введение белым мышам (по 0,5 мл) масляного раствора ацетонового экстракта контрольного образца корма и обработанного суспензиями исследуемых бактерий, не вызывало изменений в клиническом статусе в тече-
ние 3 суток наблюдения, при вскрытии убитых животных патологий внутренних органов обнаружено не было. Мыши, получавшие экстракт токсичного корма, были угнетены, отмечена гибель 2 из 5 голов, при вскрытии павших и вынужденно убитых животных были выявлены кровоизлияния в паренхиматозных органах, геморрагическое воспаление желудочно-кишечного тракта.
В хроническом опыте в ходе наблюдения за клиническим состоянием белых крыс было установлено, что животные первой группы и потреблявшие токсичные гранулы, обработанные суспензией бактерий, были активными, свободно потребляли корм и воду.
Крысы второй группы поедали корм не охотно и не полностью, были угнетены, с 12-15 суток опыта наблюдалось расстройство желудочно-кишечного тракта в виде диареи. Как следует из данных, представленных в таблице 2, масса тела животных, потреблявших нетоксичные гранулы, за время опыта увеличилась на 28,6 %, средний суточный привес составил 1,94 г. У крыс, получавших токсичный корм, прирост массы составил, соответственно, 14,8 % и 1,00 г, что достоверно ниже контроля на 52,0 %.
Таблица 2 - Динамика массы тела белых крыс, потреблявших токсичные корма, обработан-
ные суспензией изолятов микроорганизмов
Живая масса, г Прирост
Группа фон 7 сут 14 сут 21 сут массы за
опыт, г
1 142,33±3,35 155,17±3,49 169,00±3,12 183,00±3,15 40,67
2 142,67±2,29 153,67±2,20 160,17±2,39* 163,83±1,75* 21,16
3 140,67±2,33 151,83±2,41 165,67±1,93 178,33±2,01 37,66
4 142,83±2,99 154,83±2,32 167,17±2,20 179,83±1,71 37,00
5 141,17±2,36 153,33±2,20 167,83±1,83 181,17±1,84 40,00
6 140,60±2,50 152,00±2,15 166,67±2,33 180,00±2,00 39,40
* - различия с контролем достоверны с точностью p < 0,05
Добавление в токсичный корм суспензии микроорганизмов Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis, Propionibacterium freudenreichii и Bacillus subtilis с тит-
12
ром 5x10 КОЕ/кг корма оказывало протекторное воздействие на организм, масса тела животных, потреблявших его, не имела достоверных отличий с контролем. Так, прирост массы у крыс третьей группы на 80 % превысил прирост животных, поедавших токсичные гранулы, у крыс четвертой - на 74,9 %, пятой и шестой групп -на 89,0 и 86,2 %, соответственно. Среднесуточный привес массы у животных 3-6 групп составил 1,79; 1,76; 1,90 и 1,88 г, что ниже контроля на 7,4; 9,0; 1,6 и 3,1 %, со-
ответственно.
Результаты исследования крови подопытных животных свидетельствовали о нормализации обменных процессов на фоне обработки токсичного корма бактериальной суспензией (Таблица 3). Так у крыс, потреблявших токсичные гранулы, на 21 сутки опыта отмечены изменения картины крови, характеризующиеся достоверным снижением содержания эритроцитов и концентрации в них гемоглобина на 16,7 и 17,5 %, соответственно, повышением уровня лейкоцитов на 7 %, что обусловлено угнетением гемопоэза и воспалительными процессами, происходящими в организме.
Таблица 3 - Гематологические показатели белых крыс, потреблявших токсичные корма, об-
работанные суспензией изолятов микроорганизмов
Группа Эритроциты, 1012/л Лейкоциты, 109/л Гемоглобин, г/л
фон 6,48±0,07 8,17±0,20 144,13±3,01
1 6,58±0,10 8,53±0,15 154,00±2,00
2 5,48±0,14* 9,13±0,14* 127,05±2,00*
3 6,38±0,20 8,28±0,27 146,83±2,66
4 6,43±0,16 8,33±0,24 149,30±2,85
5 6,40±0,15 8,57±0,26 150,65±2,05
6 6,41±0,19 8,27±0,21 149,17±2,00
* - различия с контролем достоверны с точностью p < 0,05
В крови животных, которые потребляли корм, контаминированный метаболитами микромицетов и обработанный суспензией испытуемых микроорганизмов, выявлено незначительное снижение исследуемых показателей, отличия с контрольными значениями были недостоверными.
Заключение. Биотестированием на простейших, кроликах и мышах было установлено снижение токсичности корма,
контаминированного метаболитами мик-ромицетов Fusarium sporotrichioides, Fusarium oxysporum, Aspergillus flavus и обработанного суспензиями бактерий Lac-tobacillus plantarum, Lactococcus lactis, Pro-pionibacterium freudenreichii и Bacillus sub-tilis. При длительном скармливании токсичного корма, предварительно обработанного исследуемыми микроорганизмами, отмечено их протекторное воздействие
на организм подопытных животных. Следовательно, штаммы обладают способностью к детоксикации токсичных метаболитов микроскопических грибов и потенциально могут быть использованы с целью повышения доброкачественности кормов растительного происхождения.
Работа выполнена при поддержке Совета по грантам Президента РФ для государственной поддержки молодых российских ученых и по государственной поддержке ведущих научных школ РФ в рамках выполнения гранта МК-1582.2020.11 (соглашение № 075-15-2020-225 от 27.04.2020).
ЛИТЕРАТУРА:
1. ГОСТ 31674-2012. «Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения общей токсичности». Москва. Стандартинформ. - 2014. - 15 с.
2. Еремеев, И.М. Биологические методы борьбы с микотоксинами / И.М. Еремеев, Е.Н. Иванов, Л.Е. Матросова [и др.] // Ветеринарный врач. - 2014. - № 1. - С. 7-10.
3. Идиятов, И.И. Сочетанное воздействие малых доз диоксина и Т-2 токсина на организм поросят и пути коррекции / И.И. Идиятов // Автореферат дис. ... кандидата биологических наук. -Казань, 2013. - 19 с.
4. Идиятов, И.И. Поиск эффективных средств биологической защиты растений и кормов против микромицета Aspergillus flavus / Идиятов И.И., Галлямо-ва С.Р., Бирюля В.В. [и др.] // Ветеринарный врач. - 2017. - № 5. - С. 24-30.
5. Кондрахин, И.П. Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики / И.П. Кондрахин. - М.: Изд. Колос, 2004. - 520 с.
6. Мухарлямова, А.З. Морфологические и биохимические показатели крови кроликов при экспериментальном афла-токсикозе на фоне применения ретинола ацетата и цеолита / А.З. Мухарлямова, А.М. Тремасова, С.А. Танасева [и др.] //
Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. - 2019. - Т. 238. - № 2. - С. 133-138.
7. Папуниди, К.Х. Кормовые отравления и токсикоинфекции животных / К.Х. Папуниди, А.И. Никитин, Э.И. Семёнов [и др.]. - Казань, 2018. - 210с.
8. Портнов, О.В. Влияние биологически активных кормовых добавок на росто-весовые параметры и биохимические показатели сыворотки крови цыплят-бройлеров / О.В. Портнов, Э.К. Папуниди, И.И. Идиятов [и др.] // Ветеринарный врач.
- 2014. - № 6. - С. 56-59.
9. Потехина, Р.М. Микологическая статистика загрязненности кормов по отдельным районам Поволжья / Р.М. Поте-хина, Э.И. Семёнов, Л.Е. Матросова [и др.] // Вестник Марийского государственного университета. Серия: Сельскохозяйственные науки. - 2019. - Т. 5. - № 2 (18). - С. 197-203.
10. Семенов, Э.И. Микромицеты корма как причина наличия антибиотиков в молоке / Э.И. Семенов, К.Х. Папуниди, Н.Н. Мишина [и др.] // Молочная промышленность. - 2019. - № 12. - С. 60-61.
11. Семенова, С.А. Изучение антагонизма микроскопических грибов к патогенным микробам / С.А. Семенова, Э.А. Магдеева, А.К. Галиуллин // Успехи медицинской микологии. - 2014. - Т. 1 2. - С. 339-341.
12. Тремасова, А.М. Профилактическая эффективность пробиотического препарата при микотоксикозе / А.М. Тремасо-ва, Л.Е. Матросова, М.Я. Тремасов [и др.] // Ветеринарная медицина. - 2011. - № 95.
- С. 230.
13. Smolentsev, S.Yu. The effect of probiotic feed additives such as Prolam and Bacell on resistance of the pig body / S.Yu. Smolentsev, M.A. Efimova, I.V. Krasovskaia [et al.] // Journal of Pharmaceutical Sciences and Research. - 2018. - Т. 10. - № 12. - P. 3474-3475.
СНИЖЕНИЕ ТОКСИЧНОСТИ КОРМОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИАЛЬНЫХ
ИЗОЛЯТОВ
Идиятов И.И., Тремасова А.М., Ерошин А.И., Бирюля В.В., Тремасов Ю.М.
Резюме
В статье представлены результаты оценки степени влияния микроорганизмов Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis, Propionibacterium freudenreichii и Bacillus subtilis на общую токсичность комбикорма. Для проведения исследований изготавливали кормовые гранулы из доброкачественного комбикорма и фунгальной массы на основе зерна пшеницы, содержащей метаболиты штаммов микромицетов Fusarium sporotrichioides, Fusarium oxysporum, Aspergillus flavus. Биотестирование проб изготовленного гранулированного корма и обработанного суспензиями микроорганизмов проводили путем извлечения из них различных фракций токсических веществ ацетоном с последующим воздействием этих экстрактов на стилонихий, кроликов (кожная проба) и мышей. Изучение эффективности отобранных микроорганизмов по снижению токсичности корма при длительном скармливании было проведено на белых крысах, результаты оценивали по анализу интегральных и клинико-гематологических показателей. Установлено, что штаммы обладают способностью к детоксикации токсичных метаболитов микроскопических грибов и потенциально могут быть использованы с целью повышения доброкачественности кормов растительного происхождения.
REDUCED TOXICITY OF FODDER USING BACTERIAL ISOLATES
Idiyatov I.I., Tremasova A.M., Eroshin A.I., Biryulya V.V., Tremasov Yu.M.
Summary
The article presents the results of assessing the degree of influence of the microorganisms Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis, Propionibacterium freudenreichii and Bacillus subtilis on the general toxicity of feed. For research, fodder granules were prepared from benign compound feed and fungal mass based on wheat grain containing metabolites of micromycetes strains Fusarium sporotrichioides, Fusarium oxysporum, Aspergillus flavus/ Biotesting of samples of manufactured granulated feed and treated with suspensions of microorganisms was performed by extracting various fractions of toxic substances from them with acetone, followed by the effect of these extracts on Stylonychia, rabbits (skin test) and mice. A study of the effectiveness of selected microorganisms in reducing feed toxicity during prolonged feeding was carried out on white rats, the results were evaluated by analysis of integral and clinical and hematological parameters. It was found that the strains have the ability to detoxify toxic metabolites of microscopic fungi and can potentially be used to improve the benign quality of plant-based feeds.
