CC BY
17
УДК 579.66
Хвойные бореальной зоны. 2018. Т. XXXVI, № 6. С. 574-580
СКРИНИНГ СИБИРСКИХ ШТАММОВ ГРИБОВ РОДА TRICHODERMA -ПРОДУЦЕНТОВ БИОФУНГИЦИДОВ НА РАСТИТЕЛЬНЫХ СУБСТРАТАХ
Ю. А. Литовка
Сибирский государственный университет науки и технологий имени академика М. Ф. Решетнева Российская Федерация, 660037, г. Красноярск, просп. им. газ. «Красноярский рабочий», 31
Институт леса им. В. Н. Сукачева СО РАН, Федеральный исследовательский центр «Красноярский научный центр СО РАН» Российская Федерация, 660036, г. Красноярск, Академгородок, 50/28 E-mail: litovkajul@rambler.ru
Скрининг сибирских штаммов грибов рода Trichoderma по показателям антибиотической и гиперпаразитической активности позволил отобрать штамм К6-15 Trichodermа asperellum, обладающий максимальными спектром и степенью активности в отношении наиболее вредоносных фитопатогенных грибов рода Fusarium - возбудителей сосудистого микоза сеянцев хвойных в Средней Сибири. Максимум его активности приходится на 5-е сутки культивирования; диаметр зоны отсутствия роста фитопатогенных грибов варьирует в пределах 19-41 мм.
Проведено твердофазное культивирование штамма на растительных отходах лесоперерабатывающей промышленности и подобран наиболее благоприятный ростовой субстрат (древесная зелень пихты) для получения опытных партий биофунгицидов. Оптимальная длительность твердофазного культивирования - 21 сутки; урожай конидий - 7,9 • 10кое • г-1 а.с.с.; сохранность препарата при 4-6 °С без потери активности -6 мес. Обогащение субстрата дополнительными источниками азотного питания в виде аммонийных и нитратных солей увеличивает продуктивность конидиегенеза в среднем в 2,5 раза по сравнению с исходным субстратом. Лабораторное испытание различных форм биопрепарата «триходермин» доказало их эффективность на посевах Pinus sylvestris в лабораторных условиях: послевсходовая гибель сеянцев уменьшилась в среднем в 2 раза, инфицированность корней - в 1,8 раза. На искусственном инфекционном фоне грунтовая всхожесть и послевсходовый отпад были на уровне контроля (без внесения фитопатогенов).
Ключевые слова: антагонистическая активность, биофунгициды, лигноцеллюлозные субстраты, твердофазное культивирование, Fusarium, Trichoderma.
Conifers of the boreal area. 2018, Vol. XXXVI, No. 6, P. 574-580
SCREENING OF SIBERIAN STRAINS TRICHODERMA SP. -PRODUCERS OF BIOFUNGICIDES ON PLANT SUBSTRATES
Y. A. Litovka
Reshetnev Siberian State University of Science and Technology 31, Krasnoyarsky Rabochy Av., Krasnoyarsk, 660037, Russian Federation
Sukachev Institute of Forest SB RAS, Federal Research Center "Krasnoyarsk Science Center SB RAS" 50/28, Akademgorodok, Krasnoyarsk, 660036, Russian Federation E-mail: litovkajul@rambler.ru
The screening of Siberian strains Trichoderma by indicators of antibiotic and hyper parasitic activity allowed the selection of the strain K6-15 Trichoderma asperellu, which has the maximum spectrum and degree of activity against phytopathogenic Fusarium species - the causative agents of vascular mycoses of conifer seedlings in Central Siberia. The maximum activity of the strain observed on the 5th day of cultivation; the diameter of the zone of the absence of growth phytopathogenic fungi was 19-41 mm.
In the case of solid-phase cultivation of the strain on plant waste, an optimum growth substrate (fir needles) selected to obtain experimental batches of bio fungicides. The duration of solid-phase cultivation - 21 days; the yield of conidia is 7.9 conidia per g; safety of the drug at 4-6 °C without loss of activity - 6 months. Adding a source of nitrogen nutrition (ammonium and nitrate salts) increases the productivity of conidia by an average of 2.5 times compared with the original substrate. Laboratory testing of various forms of a biological product has proven their effectiveness in Pinus sylvestris in the laboratory. The post-emergence loss of seedlings decreased on average by 2 times, the infection of roots by 1.8 times. On the artificial infectious background, soil germination and post-emergence death were at the level of control (without introducing pathogens).
Keywords: antagonistic activity, bio fungicides, lignocellulosic substrates, solid phase cultivation, Fusarium, Trichoderma.
ВВЕДЕНИЕ
Микроскопические грибы рода Trichoderma представляют огромный практический интерес для создания экологически безопасных биофунгицидов широкого спектра действия, исходя из их высокого антагонистического и микопаразитического потенциала, ростовых параметров и продуктивности конидиегене-за, достаточно быстрой адаптации в почвенном мик-робоценозе при минимальном воздействии на аборигенную микрофлору и перспективности крупнотоннажного производства на разнообразных ростовых субстратах в различных биотехнологических системах. Эффективность действия биопрепаратов из серии «триходермины» обеспечивается множественностью механизмов регуляции численности фитопатогенов, включая конкуренцию за питательный субстрат и ареал; синтез разнообразных антифунгальных метаболитов и ферментов; микопаразитизм; индуцирование системной и локальной резистентности растений. Однако, при наличии неоспоримых преимуществ, эффективность практического применения биологических средств защиты растений в настоящее время все еще существенно уступает химическим препаратам. Решением данной проблемы может стать, с одной стороны, использование высокоактивных аборигенных штаммов грибов, адаптированных к конкретным почвенно-климатическим условиям; с другой стороны - разработка технологии и применения новых высокоэффективных препаративных форм биофунгицидов. Технологии твердофазного культивирования грибов позволяют получить биопрепараты с высоким титром конидий и иммобилизованным мицелием продуцента на носителе. Наличие питательного субстрата существенно облегчает адаптационные процессы при интродукции антагониста в почвенный микробоценоз и минимизирует потери его биологической активности. В качестве таких ростовых субстратов перспективно использовать растительные отходы лесоперерабатывающей промышленности и сельскохозяйственного комплекса, решая, тем самым, попутно, проблему их утилизации [1-6].
Целью настоящей работы было исследование биоконтрольного потенциала сибирских штаммов грибов рода Trichoderma и перспектив их твердофазного культивирования на растительных субстратах - отходах лесопереработки.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектами исследования служили 10 штаммов грибов рода Trichoderma (Eukaryota; Fungi; Ascomycota; Pezizomycotina; Sordariomycetes; Hypocreales; Hypo-creaceae), изолированные в чистую культуру из почвы лесных питомников, а также с поверхности плодовых тел базидиальных грибов Armillaria mellea s. l. и Heterobasidion annosum s. l. (Красноярский край, Средняя Сибирь). В качестве тест-объектов использовали возбудителей болезней растений хвойных пород - фитопатогенные грибы рода Fusarium (Eukaryota; Fungi; Ascomycota; Pezizomycotina;
Sordariomycetes; Hypocreomycetidae; Hypocreales; Nectriaceae): Fusarium avenaceum (Fr.) Sacc., Fusarium equiseti (Corda) Sacc., Fusarium oxysporum Schltdl., Fusarium redolens Wollenw., Fusarium solani (Mart.) Appel & Wollenw., Fusarium sporotrichioides Sherb., Fusarium subglutinans (Wollenw. & Reinking) P. E. Nelson, Toussoun & Marasas, Fusarium tricinctum (Corda) Sacc. Фитопатогенные микромицеты были изолированы из пораженной корневой системы и ри-зосферной почвы сеянцев хвойных в лесных питомниках.
Скрининг антагонистически активных штаммов Trichoderma осуществляли методами встречных культур, агаровых блоков и лунок при 26±1 °С [7; 8]. О степени активности судили по диаметру зоны отсутствия роста: 10-12 мм - слабая активность; 12,514,5 мм - умеренная активность; 15-17,5 - средняя; 18-21 - высокая; 21 мм и более - очень высокая.
Для наработки опытных партий биопрепарата «триходермин» использовали наиболее активный штамм К6-15 Trichoderma asperellum Samuels, Lieckf. & Nirenberg и растительные отходы (древесная зелень пихты после извлечения масел, исходные опилки пихты, лиственницы, сосны, осины и березы). Стерильные увлажненные субстраты (68-70 % влажность) инокулировали споровой суспензией гриба с титром 0,1 • 106 кое • г-1 а.с.с.; посевы инкубировали при 28 °C в течение 28 суток; продуктивность конидиегенеза оценивали в динамике с использованием камеры Горяева. Жидкую форму препарата получали путем глубинного культивирования штамма К6-15 на среде Чапека в термостатируемом шейкере (Orbital Shaker -Incubator ES-20) при 150 об/мин в течение 3 сут при 25 °С. Сыпучие биопрепараты хранили в сухих стерильных контейнерах при 4-6 °C, исследуя антагонистическую активность продуцента спустя 1, 3 и 6 месяцев методом агаровых блоков. Предварительную активацию штамма К6-15 осуществляли на агаризо-ванной среде Чапека при 27 °C в течение 5 сут.
Лабораторные испытания биопрепаратов в условиях естественного и искусственного инфекционного фона проводили на сеянцах Pinus sylvestris L. на базе лаборатории лесных культур микологии и фитопатологии Института леса имени В. Н. Сукачева (ФИЦ КНЦ СО РАН). Для создания искусственной инфекции использовали споровые суспензии фитопатоген-ных грибов F. oxysporum и F.redolens. Посевная площадь в одной емкости составила 20 см2; количество семян Pinus sylvestris в одной емкости - 50 шт. Почва для эксперимента была отобрана на территории лесного питомника. Схема эксперимента представлена далее (табл. 4). Оцениваемые показатели: грунтовая всхожесть сеянцев, послевсходовый отпад и инфици-руемость корневой системы.
РЕЗУЛЬТАТЫ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
На первом этапе исследования проводили отбор антагонистически активных штаммов Trichoderma
штриховым методом, который удобен для начального скрининга и оценки уровня гиперпаразитической активности потенциальных продуцентов биопрепаратов (рис. 1). Установлено, что все исследуемые сибирские штаммы Trichoderma обладают антагонистической активностью в отношении грибов рода Fusarium, однако спектр их действия существенно различается (рис. 1, а). Выявлены штаммы - гиперпаразиты, эффективно подавляющие развитие фитопатогенных грибов F.avenaceum, F.equiseti, F.tricinctum и проявляющие среднее антифунгальное действие в отношении наиболее значимых корневых патогенов сеянцев хвойных на территории Сибири в настоящее время (F.sporotrichioides, F.solani, F.subglutinans, F. re do lens и F.oxysporum) [9; 10].
Количественная оценка антибиотической активности живых культур выявила три штамма Trichoderma, характеризующихся широким спектром действия и
высоким уровнем синтеза биологически активных веществ, ограничивающих рост фитопатогенных грибов: диаметр зоны отсутствия роста тест-культур варьировал в пределах 19,1-28,6 мм (табл. 1; рис. 1, б).
Исследование наиболее перспективного по результатам первичного отбора штамма К6-15 T.asperellum показало, что максимум его антагонистической активности приходится на 5-е сутки культивирования: диаметр зоны отсутствия роста фитопатогенов варьирует в пределах 25-40 мм. С увеличением срока культивирования (7-9 сут) активность продуцента снижается в 1,3-1,8 раз (рис. 2). Минимальной чувствительностью к воздействию антагониста характеризуются представители вида F.solani (диаметр зоны отсутствия роста 20-25 мм). Активность метаболитов изучаемого штамма в отсутствии живых клеток продуцента также оказалась очень высокой.
Рис. 1. Скрининг антагонистически активных штаммов грибов рода Тпскойвгта методами перпендикулярных штрихов (а) и агаровых блоков (б)
Таблица 1
Антибиотическая активность сибирских штаммов грибов рода Trichoderma в отношении фитопатогенов рода Fusarium
Штаммы Trichoderma m а S с s e di oii hi F.subglutinans m ut
e c а с e Ьц а e or t t Ьц О ЧЗ g F. solan ci £ £ o s .F tc in ic itr tF.
Диаметр зоны отсутствия роста фитопатогенов, мм
К6-15 23,8±0,12 28,6±0,26 22,7±0,12 20,4±0,23 21,9±0,15 24,7±0,12 21,5±0,17 27,2±0,12
М 99/1 19,1±0,10 21,3±0,15 18,3±0,15 17,1±0,15 17,7±0,12 15,2±0,12 18,2±0,20 18,6±0,17
М 99/9 22,8±0,12 23,8±0,12 19,5±0,23 19,1±0,15 19,3±0,15 20,8±0,12 20,0±0,23 24,1±0,12
АМ 1-14 16,7±0,18 16,1±0,10 12,5±0,15 15,7±0,2 12,6±0,15 15,7±0,12 15,7±0,22 16,7±0,18
АМ 2-14 18,3±0,18 15,7±0,20 10,4±0,07 11,8±0,17 10,6±0,35 15,9±0,18 12,9±0,15 18,3±0,18
AМ 3-14 17,3±0,51 16,2±0,17 12,2±0,20 15,7±0,20 11,8±0,17 16,7±0,12 14,6±0,35 17,3±0,51
АМ4-14 15,7±0,2 15,2±0,12 12,6±0,15 10,6±0,35 10,4±0,07 16,2±0,17 13,8±0,17 16,5±0,23
АМ 5-14 16,1±0,12 15,6±0,18 11,2±0,19 16,3±0,12 12,5±0,15 15,6±0,18 17,4±0,07 20,4±0,23
КГ 1-14 18,9±0,20 16,3±0,12 12,2±0,20 15,2±0,12 11,2±0,19 16,3±0,12 14,5±0,15 19,5±0,23
КГ 2-14 19,7±0,23 22,4±0,13 19,8±0,15 20,1±0,15 21,3±0,15 22,7±0,22 20,2±0,19 25,4±0,13
Максимальное ингибирование роста фитопатоген-ных грибов отмечено при использовании пятисуточ-ного культурального фильтрата, полученного в условиях глубинной культуры. Диаметр зон отсутствия роста тест-культур находился в пределах 22-44 мм.
Твердофазное культивирование наиболее активного биоконтрольного штамма К6-15 Т.си'рвгвИит осуществляли на измельченных растительных субстратах, определяя продуктивность конидиегенеза в динамике. Исходный титр инокулюма составил 0,1 • 106 кое • г-1 а.с.с. Установлено, что исследуемый штамм колонизирует все исследуемые ростовые субстраты, однако его продуктивность существенно различается (табл. 2). Максимальные показатели конидиеобразо-вания отмечены на древесной зелени пихты на 21-е сутки культивирования - 8,0 • 106 кое • г-1 а.с.с.; урожай конидий составил 7,9 • 106 кое • г-1 а.с.с. Продуктивность штамма К6-15 на опилках березы, осины и сосны была существенно ниже: только на 28 сутки культивирования зафиксированы наибольшие значения урожая конидий - 2,7; 1,4 и 0,9 • 106 кое • г-1 а.с.с. соответственно. Однако эти субстраты можно рассматривать как одну из составляющих многокомпонентных композиций для твердофазного культивирования продуцента биопрепарата при проведении соответствующей оптимизации. Опилки пихты и лиственницы оказались не благоприятными субстратами для роста и спорообразования гриба (урожай конидий 0,3 и 0,2 • 106 кое • г-1 а.с.с.), что, вероятно, обусловлено особенностями их биохимического состава.
Субстраты растительного происхождения и, древесина в частности, бедны питательными веществами, что замедляет скорость колонизации субстрата мицелием гриба и увеличивает продолжительность его культивирования. В связи с чем, оценили возможность увеличения продуктивности штамма К6-16 за счет обогащения древесной зелени пихты дополнительным источником азотного питания (табл. 3). Показано, что наиболее благоприятным источником азота для получения биопрепарата на древесной зелени
пихты оказался 1 %-й раствор сульфат аммония. В результате его применения отмечены максимальные показатели продуктивности исследуемого гриба на 21-е сутки твердофазного культивирования - урожай конидий составил 19,2 • 106 кое • г-1 а.с.с., что в 2,4 раза выше, чем без обогащения. Высокая продуктивность также выявлена на субстрате, увлажненном 1 %-м раствором нитрата аммония: на 14-е сутки культивирования титр составил 15,2 • 106 кое • г-1 а.с.с., что в 2,6 раз превышало аналогичный показатель при увлажнении субстрата водой.
Все полученные партии биопрепаратов были испытаны на сеянцах сосны обыкновенной в лабораторных условиях на искусственном и естественном инфекционных фонах. Особенности используемых биопрепаратов: T1: титр препарата 7,6 • 106 кое/г а.с.с.; норма расхода 50 г / 1 кг семян; вносимый титр 0,08 •
105 кое / см2. T2: титр препарата 7,6 • 106 кое/г а.с.с.; норма расхода 100 г / 1 кг семян; вносимый титр 0,15 • 105 кое / см2. Т3: культуральная жидкость с биомассой продуцента в количестве 1,6 г/л; норма расхода 500 мл на 1 кг семян. Т4: титр препарата 0,7 • 106 кое/г а.с.с.; норма расхода 280 г / 1 кг семян; вносимый титр 0,04 • 105 кое / см2. Т5: титр препарата 2,6 •
106 кое/г а.с.с.; норма расхода: 280 г / 1 кг семян; вносимый титр - 0,13 • 105 кое / см2 (табл. 4).
Исследование опытных партий биопрепаратов, полученных путем твердофазного и глубинного культивирования показало, что внесение всех видов три-ходермина не оказало влияния на естественный выпад растений по сравнению с контролем, за исключением «триходермина Пх», что свидетельствует об отсутствии негативного влияния продуцента на растения. При этом послевсходовый отпад сеянцев снизился в среднем в 2 раза, инфицированность корней -в 1,8 раз. В условиях искусственного инфицирования посевов двумя видами фитопатогенных грибов рода Fusarium отмечены очень высокие показатели довсходового и послевсходового выпада, особенно в случае применения вида F.oxysporum (F1).
Рис. 2. Динамика антагонистической активности штамма К6-15 Trichoderma asperellum
Таблица 2
Продуктивность конидиегенеза штамма К6-15 Тгккойегша аяреге11иш при твердофазном культивировании на растительных субстратах
Растительный субстрат Титр спор (N • 106 кое) на 1 г а.с.с. Урожай конидий,
длительность культивирования, сут N • 106 кое • г-1 а.с.с.*
14 21 28
Древесная зелень пихты 5,9 8,0 7,8 7,9
Опилки пихты 0,2 0,4 0,4 0,3
Опилки осины 0,4 1,2 1,5 1,4
Опилки лиственницы 0,1 0,3 0,3 0,2
Опилки березы 0,6 2,2 2,8 2,7
Опилки сосны 0,4 0,8 1,0 0,9
* В расчете использовали максимальный титр кое на каждом субстрате.
Таблица 3
Продуктивность штамма К6-15 Trichoderma asperellum при твердофазном культивировании на обогащенной азотом древесной зелени пихты
Источник азота Титр спор (N • 106 кое) на 1 г а.с.с. Урожай конидий,
длительность культивирования, сут N • 106 кое • г-1 а.с.с.*
14 21 28
Н2 О 5,9 8,0 7,8 7,9
1 % NH4NO3 15,2 13,5 9,5 15,1
1 % (NH4)2SO4 9,7 19,3 18,0 19,2
* В расчете использовали максимальный титр спор на каждом субстрате
Таблица 4
Влияние биопрепаратов «триходермин» на ростовые особенности сеянцев Pinus sylvestris на искусственном и естественном инфекционных фонах
Вариант опыта Всхожесть, шт. Послевсходо-вый отпад, шт. Инфицируемость корневой системы, %
Контроль. Предпосевная обработка семян 0,5 % КМп04 20±2,51 9±0,89 80±2,28
Т1. Внесение биопрепарата «триходермин Пх» (пихта-хвоя) в почву из расчета 0,02 г препарата на 20 см2 16±1,52 5±1,48 50±1,58
Т2. Внесение биопрепарата «триходермин Пх» в почву из расчета 0,04 г препарата на 20 см2 18±1,14 5±0,71 40±2,58
Т3. Предпосевное замачивание семян (24 ч) в жидкости после глубинного культивирования («триходермин Г) 19±2,52 6±0,89 45±2,97
Т4. Внесение биопрепарата «триходермин Оо» (осина-опилки) в почву из расчета 0,1 г препарата на 20 см2 18±1,52 5±0,71 40±2,65
Т5. Внесение биопрепарата «триходермин Бо» (береза-опилки) в почву из расчета 0,1 г препарата на 20 см2 18±1,48 4±0,84 39±1,87
F1. Предпосевное замачивание семян в культуральной жидкости Е.охузрогит в течение 24 ч с подсушиванием 9±0,58 9±0,55 100±0,00
Т1+F1. Внесение биопрепарата «триходермин Пх» (0,02 г) + F.oxysporum 15±0,84 9±0,89 57±2,56
Т2+F1. Внесение биопрепарата «триходермин Пх» (0,04 г) + F.oxysporum 22±3,11 8±1,14 50±2,77
Т3+F1. Замачивание семян в биопрепарате «триходермин Г» + F. oxysporum 18±2,59 10±1,58 49±2,77
Т4+F1. Внесение биопрепарата «триходермин Оо» + F.oxysporum 17±2,07 10±1,14 45±2,70
Т5+F1. Внесение биопрепарата «триходермин Бо» (береза-опилки) + F. oxysporum 18±1,52 9±1,30 44±2,88
F2. Предпосевное замачивание семян в культуральной жидкости F. redolens в течение 24 ч с подсушиванием 13±1,22 12±1,22 95±3,46
Т1+F2. Внесение биопрепарата «триходермин Пх» + F. redolens 18±1,58 8±0,71 50±3,11
Т2+F2. Внесение биопрепарата «триходермин Пх» + F.redolens 21±2,41 9±1,48 43±2,88
Т3+F2. Замачивание семян в биопрепарате «триходермин Г» + F.redolens 19±1,64 10±1,14 40±2,83
Т4+F2. Внесение биопрепарата «триходермин Оо» + F.redolens. 19±1,48 11±1,52 38±2,68
Т5+F2. Внесение биопрепарата «триходермин Бо» (береза-опилки) + F.redolens 22±1,82 9±1,48 39±1,95
Таблица 5
Антагонистическая активность штамма К6-15 Тг1ско&гша аяреге11ит, после хранения биопрепаратов
Фитопатогенные грибы рода Fusarium
Диаметр зоны отсутствия роста фитопатогенов, мм
растительная основа биопрепарата
опилки осины опилки лиственницы опилки пихты древесная зелень пихты исходная активность штамма
F. sporotrichioides 22,5±1,55* 20,5±2,44 14,5±2,13 21,0±3,40 21,0±2,40 14,0±3,12 20,0±1,00 20,0±2,11 15,0±1,00 20,0±2,33 20,5±3,55 19,5±2,11 22,7
F.oxysporum 21,0±2,34 20,0±2,55 13,0±1,23 21,0±2,44 21,0±3,30 12,5±0,12 20,0±1,00 20,0±2,33 13,0±1,00 19,5±2,20 19,5±2,78 18,0±2,34 22,5
F.equiseti 22,0±1,34 21,0±1,50 13,5±3,22 23,0±1,55 23,0±1,30 12,0±3,30 25,0±1,55 24,0±0,77 12,5±1,22 25,0±1,33 25,0±3,11 22,5±1,34 28,6
F.solani 19,0±1,50 19,0±1,30 13,0±0,12 20,0±1,50 19,0±1,66 12,5±2,33 20,0±2,50 19,0±0,87 12,0±3,22 17,9±1,55 18,0±1,23 17,3±1,45 20,0
* Значения антагонистической активности штамма через 30 сут / 60 сут / 90 сут хранения биопрепаратов при 4-6 оС.
Инфицированность корневой системы варьировала в пределах 95-100 %. При использовании биопрепаратов грунтовая всхожесть и послевсходовый отпад были на уровне контроля без внесения фитопатогенов, что свидетельствует о наличии выраженных ан-тифунгальных свойств. Инфицируемость корневой системы варьировала в пределах 38-57 %, что подтверждает эффективность препаратов для сдерживания развития искусственно интродуцированных в почву фитопатогенов. Максимально эффективными для ограничения фузариозной инфекции оказались препараты триходермин Пх», внесенный в почву из расчета 0,04 г на 20 см2, и «триходермин Бо», внесенный из расчета 0,1 г препарата на 20 см2.
Между теоретической возможностью использования грибов рода Trichoderma в практике защиты растений и получением многофункциональных и эффективных биопрепаратов в различных биотехнологических системах находится ряд препятствий, включая проблему сохранения жизнеспособности конидий и активности культуры. Исследование антибиотической активности штамма-продуцента К6-15 T.asperellum показало, что в течение первого месяца хранения при 4-6 оС активность препаратов существенно не снижается по сравнению с исходными значениями: диаметры зон отсутствия роста фитопатогенов находятся в пределах 18-25 мм (см. табл. 5).
Спустя три месяца показатели антагонистической активности находятся на стабильном уровне; пределы варьирования зоны отсутствия роста тест-культур сопоставимы с предыдущими значениями и исходной активностью штамма. Через шесть месяцев хранения показатели антагонистической активности в большинстве случаев были ниже исходного значения более чем в 1,5 раза; показателей после трехмесячного хранения - в 1,4 раза. Однако активность штамма, культивируемого на древесной зелени пихты, оставалась стабильной: значения диаметров зон отсутствия роста фитопатогенных грибов варьировали в пределах 17,3-22,5 мм, включая наиболее опасных возбудите-
лей сосудистого микоза сеянцев хвойных F.sporotrichioides, F.oxysporum и F.solani. Этот факт свидетельствует о сохранении активности и эффективности биопрепарата при хранении и перспективности применения древесной зелени пихты для получения сыпучей формы биофунгицида на основе штамма К6-15 Trichoderma asperellum.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
По результатам проведенного скрининга отобран штамм К6-15 Trichoderma asperellum, обладающий максимальным спектром и степенью антибиотической активности в отношении возбудителей сосудистого микоза сеянцев хвойных из рода Fusarium. Максимум его активности приходится на 5-е сутки культивирования; диаметр зоны отсутствия роста фитопатоген-ных грибов варьирует в пределах 19-41 мм.
Древесную зелень пихты после извлечения эфирных масел целесообразно использовать как структурную и питательную основу для получения сыпучей формы биофунгицида. Максимальный титр кое отмечен на 21-е сутки твердофазного культивирования; урожай конидий составил 7,9 • 106 кое • г-1 а.с.с.; сохранность препарата при 4-6 °С без потери активности - 6 мес. Обогащение субстрата дополнительными источниками азотного питания в виде аммонийных или нитратных солей увеличивает продуктивность конидиегенеза в среднем в 2,5 раза по сравнению с исходным субстратом.
Лабораторное испытание биопрепаратов на сеянцах сосны доказало их эффективность: послевсходо-вый отпад сеянцев снизился в среднем в 2 раза, инфи-цированность корней - в 1,8 раза. На искусственном инфекционном фоне грунтовая всхожесть и послевсходовый отпад были на уровне контроля (без внесения фитопатогенов).
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ
1. Видовой состав и распространение грибов рода Trichoderma в наземных экосистемах бассейна р. Ени-
сей / В. С. Садыкова, А. В. Кураков, А. Н. Лихачев и др. // Микология и фитопатология. 2013. Т. 47, № 6. С. 390-396.
2. Использование микробного антагонизма в борьбе с инфекционным полеганием сеянцев хвойных / Т. И. Громовых, В. М. Гукасян, А. Л. Малиновский и др. // Сибирский экологический журнал. 1997. № 5. С. 501-504.
3. Бондарь П. Н., Садыкова В. С. Использование отходов деревообрабатывающей промышленности для создания биопрепаратов на основе грибов рода Trichoderma // Хвойные бореальной зоны. 2015. Т. 33, № 5-6. С. 286-290.
4. Литовка Ю. А., Савицкая А. Г., Рязанова Т. В., Нешумаева Н. А. Проблемы применения растительных отходов для получения биологических препаратов защиты растений / Ю. А. Литовка, А. Г. Савицкая, Т. В. Рязанова и др. // Химия растительного сырья. 2011. № 3. С. 167-172.
5. Control of root diseases with Trichoderma spp. in forest nurseries of Central Siberia / T. I., Gromovykh V. S. Sadykova, V. A. Tyulpanova, A. L. Malinovsky // Biological Control: A Global Perspective 2007. Р. 197-202.
6. Biological activity of the Siberian Trichoderma strains as a factor for the development of new generation biopreparations / V. S. Sadykova, T. I. Gromovykh, A. N. Likhachev et al. // Biotechnology in Russia. 2007. № 6. Р. 10-18.
7. Егоров Н. С. Основы учения об антибиотиках. М. : Высш. шк., 2004. 263 с.
8. Нетрусов А. И., Егорова М. А., Захарчук Л. М. Практикум по микробиологии. М. : Академия, 2005. 608 с.
9. Литовка Ю. А., Громовых Т. И. Видовой состав и патогенность грибов рода Fusarium на сеянцах хвойных пород в лесных питомниках Средней Сибири // Микология и фитопатология. 2008. Т. 42, № 1. С. 35-42.
10. Литовка Ю. А., Савицкая А. Г., Рязанова Т. В. Видовой состав и фитотоксичные свойства микро-мицетов рода Fusarium, распространенных в лесных питомниках Средней и Южной Сибири // Хвойные бореальной зоны. 2011. Т. 29, № 3-4. С. 233-237.
REFERENCES
1. Vidovoy sostav i rasprostraneniye gribov roda Trichoderma v nazemnykh ekosistemakh basseyna r. Eni-
sey / V. S. Sadykova, A. V. Kurakov, A. N. Likhachev i dr. // Mikologiya i fitopatologiya. 2013, T. 47, No. 6, S. 390-396.
2. Ispol'zovaniye mikrobnogo antagonizma v bor'be s infektsionnym poleganiyem seyantsev khvoynykh / T. I. Gromovykh, V. M. Gukasyan, A. L. Malinovskiy i dr. // Sibirskiy ekologicheskiy zhurnal. 1997, No. 5, S. 501-504.
3. Bondar' P. N., Sadykova V. S. Ispol'zovaniye otkhodov derevoobrabatyvayushchey promyshlennosti dlya sozdaniya biopreparatov na osnove gribov roda Trichoderma // Khvoynyye boreal'noy zony. 2015, T. 33, No. 5-6, S. 286-290.
4. Litovka Yu. A., Savitskaya A. G., Ryazanova T. V., Nesh-chmayeva N. A. Problemy primeneniya rastitel'nykh otkhodov dlya polucheniya biologicheskikh preparatov zashchity rasteniy / Yu. A. Litovka, A. G. Savitskaya, T. V. Ryazanova i dr. // Khimiya rastitel'nogo syr'ya. 2011, No. 3, S. 167-172.
5. Control of root diseases with Trichoderma spp. in forest nurseries of Central Siberia / T. I., Gromovykh V. S. Sadykova, V. A. Tyulpanova, A. L. Malinovsky // Biological Control: A Global Perspective 2007, P. 197202.
6. Biological activity of the Siberian Trichoderma strains as a factor for the development of new generation biopreparations / V. S. Sadykova, T. I. Gromovykh, A. N. Likhachev et al. // Biotechnology in Russia. 2007, No. 6, P. 10-18.
7. Egorov N. S. Osnovy ucheniya ob antibiotikakh. Moscow, Vyssh. shk., 2004, 263 s.
8. Netrusov A. I., Egorova M. A., Zakharchuk L. M. Praktikum po mikrobiologii. Moscow, Akademiya, 2005, 608 s.
9. Litovka Yu. A., Gromovykh T. I. Vidovoy sostav i patogennost' gribov roda Fusariim na seyantsakh khvoynykh porod v lesnykh pitomnikakh Sredney Sibiri // Mikologiya i fitopatologiya. 2008, T. 42, No. 1, S. 35-42.
10. Litovka Yu. A., Savitskaya A. G., Ryazanova T. V. Vidovoy sostav i fitotoksichnyye svoystva mikromi-tsetov roda Fusarium, rasprostranennykh v lesnykh pitomnikakh Sredney i Yuzhnoy Sibiri // Khvoynyye bore-al'noy zony. 2011. T. 29, No. 3-4. S. 233-237.
© Литовка Ю. А., 2018
Поступила в редакцию 16.11.2018 Принята к печати 10.12.2018
