CC BY
55
ХИМИЧЕСКАЯ ТЕХНОЛОГИЯ ПЕРЕРАБОТКИ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ
УДК: 632.4:635.64:632.937
ПЕРСПЕКТИВЫ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПРЕПАРАТА ДЛЯ ЗАЩИТЫ СЕЯНЦЕВ ХВОЙНЫХ ПУТЕМ ТВЕРДОФАЗНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ШТАММА 19/97М STREPTOMYCESLATERITIUS SVESCHNIKOVA
Т.И. Громовых, И.И. Гайдашева В. А. Ушанова, В.С. Садыкова, Г. А. Сизых
ГОУ ВПО «Сибирский государственный технологический университет»
660049 Красноярск, пр. Мира, 82
Проведены исследования по твердофазному культивированию биологически активного штамма 19/97 М Streptomyces lateritius на коре пихты и лиственницы и древесной зелени пихты. Показано, что штамм утилизирует субстраты и сохраняет свою активность и жизнеспособность в течение 6 месяцев. Полученный продукт после твердофазной ферментации может быть использован при создании биопрепаратов для защиты сеянцев хвойных от болезней, вызываемых микромицетами из родов Fusarium и Alternaria.
The solid phase cultivation of biological active strain 19/97 М Streptomyces lateritius on the larch bark and fir bark were investigated. It was shown that the strain can utilize the substrates and maintaned the activity and vitality during six months. These kind of products can be reccomended as a biopreparation for protection of coniferous seedlins from diseases caused Fusarium Alternaria genera.
ВВЕДЕНИЕ
Важной задачей современной экологии является выработка стратегии фитосанитарной оптимизации процессов лесовосстановления, направленной на обеспечение и внедрение новейших средств борьбы в систему интегрированной защиты растений. Наиболее распространенным и вредоносным заболеванием при выращивании сеянцев хвойных в лесных питомниках Средней Сибири является инфекционное полегание. Это заболевание вызывается грибами различных родов: Fusarium, Altemaria, Botrytis, Pythium, Phytophtora, VerticiШum, Rhizoctonia и Cladosporium. Наибольшую опасность для всходов и сеянцев хвойных представляют грибы рода Ршагшт. Вызываемые видами этого рода заболевания включают поражение наземной и корневой части растений. Наиболее сильно страдают посевы хвойных (Гтш, Picea и Larix), в меньшей степени - посевы лиственных пород [1-4].
Составной частью стратегии защиты является разработка биологического метода, основанного на сохранении и насыщении биоценозов антагонистически активными в отношении фитопатогенов микроорганизмами. Биометод, в широком понимании, подразумевает изменение количественного, видового состава и взаимоотношений популяций микроорганизмов, а также влияние метаболитов на патогенную микробиоту при различных способах использования биопрепаратов в общей технологии возделывания культур. В настоящее время имеется небольшое количество работ, в которых приводятся сведения об использовании актиномицетов в защите от почвенных грибов - фитопатогенов сельскохозяйственных культур и сеянцев древесных растений. Большинство работ посвящено изучению возможности использования отдельных представителей рода Streptomyces в качестве потенциальных агентов биоконтроля [5-9]. Многие актиномицеты являются активными антагонистами фитопатоген-
ных грибов. Субстратный мицелий актиномицетов может проникать в ткани растений, не только поражая возбудителей различных заболеваний, но и предоставляя растению некоторые метаболиты, оказывающие оздоравливающий эффект. Известно, что антибиотические вещества, выделяемые акти-номицетами, могут накапливаться в растениях, при этом повышается бактерицидность растительного сока и устойчивость растения к инфекциям [5-7].
К микроорганизмам-продуцентам биопрепаратов, представляющих собой живую культуру, предъявляются определенные требования. Они должны выживать и размножаться в новых для них условиях существования, выдерживая конкуренцию со стороны постоянных обитателей почвенного микробоценоза. При этом они должны сохранять высокие агрессивные и патогенные свойства селективно по отношению к объекту воздействия биопрепарата, не подавляя при этом безвредную сапро-трофную микрофлору и не разрушая структуру почвенного микробного сообщества [1,2, 7,10,11].
Во всероссийском научно-исследовательском институте защиты растений представлено некоторое количество актиномицетов - потенциальных продуцентов препаратов защиты растений. Новый штамм актиномицета Streptomyces felleus, выделенный из зоокомпоста, является антагонистом по отношению к фитопатогенным грибам и рекомендован для получения биопрепарата арилина. Штамм Р-21 актиномицета Streptomyces chrysomallus, выделенный из почв Прибалтики (Литва) и отобранный по признакам антагонистической и фиторегуляторной активности, депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов ВИЗР (коллекционный номер 150) и предназначен для получения поли-функционального биопрепарата против фитопатогенных грибов и вирусов, стимулирующего рост и развитие растений [12].
В Сибирском государственном технологическом университете из почвы лесного питомника
Красноярского края выделен штамм 19/97М Streptomyces lateritius Sveschnikova и впервые предложен для стимулирования роста и защиты сеянцев хвойных от возбудителей болезней, вызываемых грибами родов Fusarium и Alternaria [13]. Однако внедрение полученного перспективного штамма возможно только при массовом получении на его основе биопрепарата. С этой целью проводятся исследования по разработке биотехнологии и подбору питательных сред для его культивирования.
При выявлении потенциальных возможностей микроорганизмов образовывать антибиотические вещества подбору сред необходимо уделять самое серьёзное внимание. К настоящему времени предложено большое количество сред для культивирования актиномицетов. Недостатком этих сред является то, что на них также хорошо растут и многие бактерии. Для изучения разнообразия почвенных актиномицетов рекомендуют среды, содержащие в качестве углеродного субстрата крахмал, моно- и дисахара, процеженный отвар картофеля, пептон, гороховую муку, мясной, кукурузный, дрожжевой экстракт и другие [14,15]. В сравнении с другими бактериями почвенные актиномицеты более устойчивы к высушиванию и могут развиваться при низкой влажности питательного субстрата (8-10%). За исключением термофилов, актиномицеты характеризуются сравнительно небольшой скоростью роста даже в условиях лабораторных культур и достаточного снабжения легкоусвояемыми питательными веществами.
Перспективным биотехнологическим процессом получения биомассы актиномицетов может быть твердофазная ферментация растительных материалов [16]. Твердофазная ферментация - микробиологический процесс, протекающий в массе измельченного и влажного твердого сырья, имеющего различную форму и размеры частиц. Субстрат, используемый для твердофазной ферментации, должен содержать доступные питательные вещества для роста микроорганизмов: целлюлозу, крахмал, сахара - в качестве источников углерода; аммиак, мочевину, белки - в качестве источников азота, и минеральные соли.
По своим физическим свойствам субстрат может быть практически нерастворимым в воде (например, опилки), набухать в ней, принимать гелеобразное состояние или даже частично растворяться (например, крахмал), а также обладать достаточной влажностью. Влага может пропитывать частицы или образовывать пленку на их поверхности. Эффективность метода твердофазной ферментации зависит от используемого сырья, типа целевого продукта, особенностей микробной культуры и других причин. В мировой практике известны несколько технологических вариантов твердофазной ферментации, направленных на промышленное получение синтезируемых микроорганизмами ферментов, биологически активных веществ, антибиотиков и обогащенных белком кормовых препаратов [14-16].
Для массовой наработки биопрепарата путем твердофазной ферментации в разных странах мира
используются: зерно, отруби, солома пшеницы и сорго, свекловичный жом, торф, гуза-пая (коробочки хлопка, после сбора хлопковой ваты), шелуха подсолнечника и стебли кукурузы, виноградные выжимки. Состав сред оказывает существенное влияние на рост микроорганизмов [16]. Исследований по использованию остатков древесной массы (коры, опилок, хвои) для культивирования актиномицетов крайне мало. В связи с этим целью работы было провести подбор питательных сред для культивирования антагонистически активного штамма 19/97М Streptomyces lateritius и оценить его активность после культивирования на различных питательных субстратах.
ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектами исследования служил штамм 19/97М вида Streptomyces lateritius (ВКПМ Ac 16З7), выделенный из почвы лесного питомника Красноярского края. Для оценки антибиотической активности в качестве тест-объекта использовали изолят Fusarium oxysporum. Изучение биологической активности метаболитов штамма проводили на семенах Larix sibirica L.
МЕТОДЫ ВЫРАЩИВАНИЯ ПРОДУЦЕНТА
Изучение процесса микробного биосинтеза обычно начинается с исследования динамики роста периодической культуры. Цикл развития периодической культуры начинается с засева среды. Засев осуществляется в таком количестве, которое обеспечивает начало роста микроорганизмов с минимальной задержкой или даже лаг-фазы. Оценку антибиотической активности штамма 19/97М Streptomyces lateritius на шестые сутки культивирования на твердых субстратах осуществляли путем высева продуцента на жидкую крахмалоаммиачную среду.
Процесс твердофазного культивирования осуществляли на древесной зелени пихты, коре лиственницы и коре пихты после СО2- экстракции, каждую из которых использовали в виде трех фракций: 0,25-1 мм, 1-3 мм, 3-5 мм. Культивирование проводили в конических колбах на 500 мл на субстратах (20 г), увлажненных до S0 %, добавляли разные источники азота (NH4NO3, (NH4)2SO4, KNO3) и подвергали стерилизации. Субстраты ино-кулировали агаровыми блочками штамма 19/97М Streptomyces lateritius. Культивирование проводили при температуре от 25 до 27 °С в течение 30 сут. После культивирования исследуемого штамма массу тщательно перемешивали, образцы в количестве 1 г смывали водой в объеме 50 мл. Учет продуктивности штамма проводили определением численности колониеобразующих единиц (КОЕ) методом посева серийных разбавлений из смыва с 1 г полученного продукта после культивирования на твердых питательных средах.
Биологическую активность препарата изучали на водных экстрактах. Для получения экстрактов продукт после твердофазного культивирования
4S3
штамма 19/97 М Б&вр1отусв' ШвгШш помещали в стерильную воду в количестве 1 г на 50 мл и экстрагировали в течение 24 часов при температуре 2830 °С. Полученный экстракт использовали для оценки на токсичность в отношении семян лиственницы сибирской и антибиотическую активность в отношении тест-фитопатогена.
Семена растений выдерживали в экстрактах в течение 24 ч при температуре 25 °С. Для каждого варианта брали по 50 семян в четырехкратной повторности. После суточного замачивания семена раскладывали на влажной фильтровальной бумаге в чашках Петри, увлажняли равным количеством водопроводной воды и проращивали в течение 5-7 дней при постоянной температуре. Учитывали показатели энергии прорастания и всхожести семян. Токсичными считаются вещества, вызывающие снижение всхожести семян или угнетение роста проростков и корней не менее чем на 30 % по сравнению с контролем.
Сохраняемость штамма в полученном продукте определяли при хранении его в течение 6 месяцев. Биомассу штамма 19/97М 81гвр1отусв' ШвгШш, полученную на твердых питательных субстратах (древесная зелень, кора пихты, кора лиственницы), помещали в стерильные бюксы, высушивали в сушильном шкафу до постоянной массы при температуре 40 °С в течение шести суток. По истечении данного времени проводили оценку жизнеспособности штамма ежемесячно на модифицированной крахмало-аммиачной среде методом посева серийных разбавлений из смыва с 1 полученного продукта. Численность &гвр1отусв' ШвгШш пересчитывали по значениям титров после хранения в сравнении с исходным.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Получение биопестицидов в настоящее время является трудно решаемой задачей, так как не разработаны технологии массового наращивания продуцентов. Большая часть продуцентов биологических препаратов защиты растений представляет собой продуценты на основе грибов. Для получения биопрепаратов на основе актиномицетов подобные исследования не проводились. В связи с этим представлялось интересным оценить способность штамма 19/97 М 81гвр1отусв' ШвгШш расти на твердых питательных субстратах.
Исследования показали, что для культивирования лучше использовать растительные субстраты размером фракций 1-3 мм, фракции других размеров менее эффективны для роста 81гер1отусеБ ШвгШш с целью получения биопрепаратов. Продуцент хорошо растет на коре лиственницы и древесной зелени пихты, о чем свидетельствовали показатели его численности (рис. 1). В массе коры лиственницы и на древесной зелени пихты, начиная с четвертых суток культивирования, появляется пигмент, синтезируемый продуцентом.
Численность актиномицета уже на 10-е сутки культивирования на древесной зелени пихты составляла 1,91-1011 КОЕ-г-1, а на 30 - е сутки - 2,19-1011
КОЕ-г-1. На коре пихты численность продуцента была существенно ниже, хотя имела вполне высокий титр для использования в почве в качестве биологического пестицида. Таким образом, данные доказывают, что кору хвойных, а также древесную зелень пихты можно использовать в качестве питательных субстратов для твердофазной ферментации с целью накопления биомассы продуцента.
о
б 1
>•.
О 0,5
с; о
10 20 30 40
Время, сут
—♦— Кора лиственницы —■— Древесная зелень —▲— Кора пихты
Рисунок 1 - Динамика численности (КОЕ) штамма 19/97 М Streptomyces ШегШш на растительных субстратах в течение 40 суток
Комплекс метаболитов, выделяемый актиноми-цетом, содержит ряд веществ, обладающих способностью стимулировать рост и прорастание семян хвойных. Результаты исследований, проведенных на семенах лиственницы, показали, что большое количество этих веществ выделяется актиномице-том при твердофазном способе культивирования микроорганизма. Метаболиты актиномицета при культивировании на коре хвойных после СО2-экстракции и древесной зелени пихты оказывают лучшее действие на прорастание семян лиственницы сибирской, чем метаболиты при выращивании продуцента на стандартной среде (табл. 1). Кроме того, штамм не теряет свою антибиотическую активность в отношении тест-фитопатогена Ешагшт оху'рогит, вызывающего фузариоз сеянцев хвойных.
Штамм хорошо сохраняет свою жизнеспособность в полученном препарате в течение шести месяцев хранения при температуре 21-22 °С, с титром на древесной зелени - 2,2-1011, на коре лиственницы - 1,6-1011, на коре пихты - 0,1-1011 КОЕ-г-1 (рис.2). Достоверность различий численности по критерию Фишера при хранении нет, то есть биомасса может храниться длительный период времени, не теряя жизнеспособности.
Высокая антагонистическая активность штамма обусловливается большим количеством антимикробных метаболитов, которые штамм синтезирует в процессе культивирования. Это обеспечивает сохранение его стабильности и отсутствие инфицирования посторонней микрофолорой в смеси биомассы штамма с растительными остатками.
« 2,5
1,91
2
1,5 -
Таблица 1 - Биологическая активность водных экстрактов из биомассы штамма 19/97М Streptomyces ШегШт после твердофазного культивирования____________________________________________________________________
Водный экстракт Зона подавления роста (мм) Fusa-rium oxysporum Энергия прорастания семян Larix sibirica L. Всхожесть семян Larix sibirica L. Инфицируемость семян Larix sibirica L.
81гвр1отусв' ШвгШи' на коре пихты 12,7±1,4 б8,7±З,4 78,7±З,4 б,0±0,7
81гвр1отусв' ШвгШи' на коре лиственницы 10,7±1,7 б2,5±З,4 7б,5±2,7 2,2±0,1
81гвр1отусв' ШвгШи' на древесной зелени пихты 14,7±1,2 бб,7±З,4 84,2 ±З,7 1,б±0,4
Метаболиты штамма Б1гвр- 9,З±1,5
1отусв' 1а1вгШш 58,7±З,4 82,7±1,7 2,4±2,8
на среде Чапека
Контроль (вода) 0 4б,4±2,8 бб,4±2,8 7,4±0,8
■ Корлшгаы ВДревесісія -ймень □ Кор.і шанснншиї
1 2 3 4 5 6
Время, месяц
Рисунок 2 - Численность (КОЕ) штамма 19/97М Streptomyces ШєгШш на растительных субстратах при хранении
Рисунок 3 - Характер роста смыва на КАА из продукта после поверхностного твердофазного культивирования штамма 19/97 М Streptomyces ШегШт на коре пихты
Микробиологический контроль при посеве на питательные среды показал, что основную массу живых пропагул в продукте составляет штамм 19/97М
Streptomyces lateritius (рис. 3).
Таким образом, кора хвойных после СО2-экстракции и древесная зелень пихты могут быть использованы в качестве субстрата для твердофазной ферментации нового антагонистически активного штамма 19/97М Streptomyces lateritius - продуцента биологического препарата.
Комплекс метаболитов актиномицета, выделяемый в культуральную жидкость, содержит ряд веществ, обладающих способностью стимулировать рост и прорастание семян хвойных. Результаты исследований, проведенных на семенах лиственницы, ели показали, что большое количество этих веществ выделяется актиномицетом при твердофазном способе культивирования микроорганизма. Метаболиты актиномицета, при культивировании штамма 19/97 М Streptomyces lateritius на коре лиственницы и коре пихты после СО2-экстракции и древесной зелени пихты, оказывают на прорастание семян большее действие, чем метаболиты при выращивании продуцента на стандартной среде.
Полученный путем твердофазной ферментации биопрепарат проходит испытания в лесных питомниках Красноярского края и Республики Тыва при выращивании сеянцев хвойных пород.
Научные исследования выполнены при поддержке грантами РФФИ 06-04-08040-офиа «Создание высокопродуктивных устойчивых к патогенам форм хвойных растений в культуре in vitro, на основе современных достижений в области половой репродукции голосемянных» и ФЦНП № 2466 «Развитие гербарной коллекции и музея культур грибов Средней Сибири как базы для научнообразовательного процесса».
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Громовых, Т.И. Биологический контроль болезней сеянцев хвойных в лесных питомниках Средней Сибири / Т.И. Громовых, Ю.А Литовка, О.Н Андреева.
- Красноярск: СибГТУ, 2005. - 264 с.
2. Lewis J.A. Integrated control of Rhizoctonia fruit rot of cucumber / J.A. Lewis, C.C. Papavizas // Phytopatholo-gy.-1980. - V.70. - 85-89 р.
3. Тулемисова, К.А. Микробиологические методы защиты растений / К.А. Тулемисова // Вестник АН Каз ССР. - 1990. - 36 с.
4. Рекомендации по защите от заболеваний сеянцев хвойных пород лесных питомников Красноярского
края / И.С. Коссинская. - Красноярск, 1971. - 52 с.
5. Терехова, Л.П. Поиск продуцентов антибиотиков среди актиномицетов редких родов / Л.П. Терехова. -Алма-Ата: Гылым, 1990. - 118 с.
6. Zhilu Ai, Zhengqiang Jiang, Lite Li, Wei Deng, Isao Kusakabe, Huishang Li Immobilization of Streptomyces olivaceoviridis E-86 xylanase on Eudragit S-100 for xy-lo-oligosaccharide production // Process Biochemistry Volume 40. - Issue 8. - 2005. - Р. 2707-2714.
7. Brinda Mahadevan and Don L. Crawford Properties of the chitinase of the antifungal biocontrol agent Strepto-myces lydicus WYEC108 // Enzyme and Microbial Technology Volume 20, Issue 7, 1997, P. 489-493.
8. Mameri, N. Batch zinc biosorption by a bacterial nonliving Streptomyces rimosus biomass / N. Mameri et al // Water Research. -1999. - Volume 33. - Issue 6. -P. 13471354.
9. Samir, S. Szabo Hydrocarbon uptake by Streptomyces /
S. Samir et al // FEMS Microbiology Letters - Volume 169.- Issue 1. - 1998. - P. 87-94.
10. Dumroese, R.K. Interaction among Streptomyces gri-seoviridis, Fusarium root disease, and Douglas-fir seedlings / R.K. Dumroese, R.L. James, Wenny D.L // New Forest. - 1998. - V.15. - P. 181-191.
11. А.с. 1042.349 СССР, МКИ7 С 12 N / Тулемисова, К.А. Штамм Streptomyces griseoruber 3-79 №314 продуцент антибиотика для борьбы со слизистым бактериозом капусты / К.А. Тулемисова, Е.Ф. Игина, Е.Т. Никитина (СССР). - опубл. 16.05.1983 Бюл. №.
- 8 с.
12. Бурцева, С. А. Перспективы применения метаболитов актиномицетов для предпосевной обработки семян /
С.А. Бурцева, А.Ф. Тодераш, И.О. Растимешина // Регуляторы роста и развития растений: мат-лы IV междунар. науч.-практ. конф. - М., 1997. - 157 с.
13. Пат. 2261902 Российская Федерация, МПК7 С 12 N 1/20, А 01 N 63/00. Штамм актиномицета Streptomyces ЫепИш 19/97М, используемый для стмулирования роста и защиты сеянцев хвойных от возбудителей болезней, вызываемых грибами родов Гшапит и АЙетапа / Громовых Т.И., Литовка Ю.А., Садыкова В.С.; заявители и патентообладатели: Сибирский гос. технология. ун-т, Красноярский гос. ун-т. - № 2003100579/13; заявл. 08.01.2003; опубл. 10.10.2005, Бюл. № 28. - 8 с.
14. Егоров, Н.С. Основы учения об антибиотиках / Н.С. Егоров. - М.: МГУ, 2004.-512 с.
15. Семенов, С.М. Лабораторные среды для актиномицетов / С.М. Семенов. - М., 1990. - 328 с.
16. Твердофазная ферментация обрезков виноградной лозы базидиомицетами - источник белковоферментных препаратов / В.И. Элисашвили [и др.] // Превращения древесины при энзиматическом и микробиологическом воздействиях: тез. докл. 3-го научного семинара. - Рига, 1988. - С. 183 - 190 .
17. Головлева, Л.А. Биохимия разложения лигнина микроорганизмами / Л.А. Головлева, О.В. Мальцева // Проблемы био онверсии растительного сырья. - М.: Наука, 1986. - 295 с.
18. Сэги, Й. Методы почвенной микробиологии / Й. Сэги. - М.: Колос, 1983. - 173 с.
19. Оболенская, А.В. Лабораторные работы по химии древесины и целлюлозы / А.В. Оболенская, З.П. Ель-ницкая, А.А. Леонович. - М.: Экология, 1991. - 320 с.
Поступила в редакцию 9 июля 2007 г. Принята к печати 26 ноября 2007 г.
