CC BY
39УДК 577.152.192.3
А.А. Клепиков1, М.М. Шамцян2
Лакказы (кислород оксидоредуктазы, К.Ф.1.10.3.2) являются одними из основных лигнолитических ферментов. Подавляющее большинство лакказ относится к так называемым «голубым» медьсодержащим белкам, способным катализировать процесс четырёхэлектронного восстановления молекулы кислорода до двух молекул воды. При этом в качестве промежуточного продукта не образуется ни перекиси водорода, ни каких либо других кислородных интермедиаторов. Обычными субстратами лакказы являются различные фенольные соединения и ароматические амины, выполняющие роль доноров электронов в ферментативной реакции [1, 2].
Лакказы из базидиальных грибов отличаются высоким окислительно-восстановительным потенциалом и широкой субстратной специфичностью, что делает возможным их широкое использование в промышленности, например, при производстве современных экологически чистых древесноволокнистых плит (в качестве биосвязующего агента, заменяющего фенолформальдегидные смолы) [3]; в целлюлозно-бумажной промышленности [4]; при создании биосенсоров [5]; в тонком органическом синтезе (например, синтезе электропроводящих полимеров); при создании биотопливных ячеек [6]; в текстильной промышленности (экологически чистое отбеливание тканей); в пищевой промышленности (удаление следов кислорода в продуктах питания для увеличения срока хранения); для определения ряда соединений в напитках (полифенолов в вине, танина в чае) [7]; для биодеградации ксенобиотиков, в том числе отравляющих веществ; синтезе лекарственных препаратов (например, антибиотиков); иммуно-ферментном анализе [8] и в других областях.
Несмотря на огромный потенциал использования лакказ в промышленности, их широкое применение ограничивается высокой стоимостью фермента. Одним из актуальных направлений работ по снижению стоимости получаемых ферментов является поиск новых продуцентов высокоактивных и стабильных лакказ.
Целью работы являлся скрининг эффективного штамма продуцента лакказы, изучение динамики его ок-сидазной активности, при культивировании на средах различного состава и характеристика фермента.
Методы исследования
Объектом исследования служили штаммы 26 культур базидиальных грибов из коллекции кафедры технологии микробиологического синтеза СПбГТИ(ТУ):
СКРИНИНГ И ИЗУЧЕНИЕ БАЗИДИАЛЬНЫХ ГРИБОВ В КАЧЕСТВЕ ПРОДУЦЕНТОВ ЛАККАЗ
Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет), Санкт-Петербург, Московский пр., д. 26
В результате проведённого в два этапа скрининга, отобран перспективный продуцент фермента лакказы, штамм гриба Funalia trogii ТИ 035. Для данного штамма изучена динамика оксидазной активности в культуральной жидкости в зависимости от концентрации в питательной среде ионов меди, а также от соотношения источников углерода и азота. Определены: термостабильность, молекулярная масса, температурный и рН-оптимум фермента.
Ключевые слова: продуцент лакказы, фермент, базидиаль-ные грибы, скрининг.
Antrodiella foliaceo-dontata ТИ 043; Bjerkandera adusta ТИ 001; Cerrena unicolor ТИ 026; Ceriporiopsis resinascens ТИ 030; Coprinus lagopides ТИ 012; Coriolus hirsutus ТИ 005; Coriolus versicolor 090; Corticium roseum ТИ 042; Fomes fomentarius ТИ 006; Fumitopsis pinicola ТИ 007; Funalia trogii ТИ 035; Ganoderma applanatum ТИ 009; Ganoderma lucidum 0860; Grifola frondosa ТИ 008; Hapalopilus rutilans ТИ 041; Hypsizigus ulmarius ТИ 010; Merulius tremellosus ТИ 044; Oligoporus cerifluus ТИ 045; Panus conchatus ТИ 028; Panus tigrinus ТИ 025; Pleurotus citrinopeleatus 0830; Pleurotus ostreatus 0553; Pleurotus ostreatus 0786; Pyptopurus betulinus ТИ 018; Skeletocutis lenis ТИ 046; Trametes suaveolens ТИ 019. Исходные культуры базиди-омицетов выращивали в пробирках на косяках сусло-агара при температуре 28-30 °С в течение 7 дней (до полного зарастания поверхности косяка) и хранили в холодильнике при температуре +4 °С.
Посевной материал для глубинного культивирования выращивали в колбах с керамическими бусами с жидкой питательной средой состава (г/л): глюкоза-10; пептон - 3,0; КН2РО4 - 0,6; К2НРО4 - 0,4; MgSO4 - 0,5; MnS04-7H20 - 0,05; ZnS04-7^0 - 0,001; FeS04-7H20 -0,0005; дрожжевой экстракт-2; вода водопроводная, при температуре 26-28°С в течение 14-21 дней до полного зарастания поверхности среды пленкой мицелия. Выращенный поверхностным способом посевной материал измельчали с помощью керамических бус, встряхиванием колб. Полученную суспензию использовали в качестве посевного материала на стадии ферментации из расчета 10 мл суспензии на 150 мл среды.
Определение оксидазной активности штаммов по методу Бавендамма и модифицированному методу Бавендамма. Агаризованную среду с растущей культурой (8 мм в диаметре) переносили на чашку Петри, содержащую твердую агаризованную среду с галловой кислотой 0,4% (классический метод Бавендамма) [9]. В качестве контроля использовали ту же среду без галловой кислоты. Чашки выдерживали при 26°С в течение 4 суток. О продуцировании оксидоредуктаз судили по появлению коричневой окраски в агаризованной среде вблизи растущего мицелия. Параллельно тем же способом проводилось определение оксидазной активности на агаризованной глюкозо-аммонийной среде с пирокатехином 0,12% (модифицированным методом Бавендамма) [10]. Опыты проводили в 3-кратной повторности. Диаметры окрашенных зон измеряли в обоих случаях на четвертые сутки роста.
1 Клепиков Антон Александрович аспирант каф. технологии микробиологического синтеза, e-mail: [email protected]
2 Шамцян Марк Маркович канд. техн. наук, доцент каф. технологии микробиологического синтеза, e-mail: [email protected]
Дата поступления - 7 ноября 2013 года
Для отбора штаммов, обладающих наиболее высокой ок-сидазной активностью, проводили глубинное культивирование грибов в колбах Эрленмейера объёмом 750 мл с объёмом среды 150 мл на круговой качалке при 180 об/ мин, 26-28 °С и исходным рН 6.0 на среде следующего состава (г/л): глюкоза - 10,0; пептон - 3,0; КН2РО4 - 0,6; К2НРО4 - 0,4; MgSO4 - 0,5; MnSO^^Ü - 0,05; ZnSO„-7Н2О - 0,001; FeS04•7Н20 - 0,0005; вода водопроводная. В качестве индуктора вносилось 0,4 г/л СuS04•5Н20. В дальнейших исследованиях с выбранным штаммом-продуцентом вносилось оптимизированное количество СuS04•5Н20 - 0,15 г/л (0,6 мМ Си2+).
Определение экстрацеллюлярной оксидазной активности в культуральной среде. Активность определяли в нативном растворе культуральной жидкости спектрофотометрически при 410 нм, на спектрофотометре APEL PD-303 (Япония). В качестве хромогенного субстрата использовали 0,01 М раствор пирокатехина в 0,1 М цитратном буфере, рН 4,96. В кварцевую кювету объёмом 3,5 мл вносили 0,1 мл культуральной жидкости, 3,4 мл раствора субстрата и определяли изменение оптической плотности за 1 мин. Для расчета активности брали прямолинейный участок изменения оптической плотности, угол наклона которого к оси абсцисс составлял около 45°. В случае, если угол наклона графика составлял более 45°, объём пробы уменьшали, соответственно увеличивая объём буфера. За единицу оксидазной активности (Ед/мл) принимали увеличение оптической плотности реакционной смеси при 410 нм за 1 мин, в пересчёте на 1 мл раствора культуральной жидкости.
Выделение и очистка фермента. Осаждение белков проводили методом высаливания (сульфатом аммония) в диапазоне насыщения 0-90%. Очистку ферментного препарата проводили методом гель-фильтрации на колонке высотой 40 см и диаметром 1,5 см, заполненной Молселектом G-75. Элюирование проводили фосфатным буфером рН = 6,5.
Определение оптимумов и стабильности фермента. Определение рН оптимумов окисления 0,01 М раствора пирокатехина проводили в цитратно-фосфат-ной буферной системе в диапазоне рН 2,2-8,0.
Температурный оптимум определяли в диапазоне температур 25-85 °С по скорости окисления 0,01 М раствора пирокатехина в 0,1 М цитратном буфере, рН 4,96. Для оценки термостабильности лакказы фермент инкубировали при температуре 50 °С, 60 °С, 70 °С, 80 °С, 85 °С и 90 °С в течение часа, измеряя остаточную активность через каждые 5 мин.
Экспериментальные результаты и их обсуждения
Результаты первого этапа скрининга культур на агаризованной среде в чашках Петри представлены в таблице 1. Положительную реакцию Бавендамма показали все изученные штаммы, за исключением Fumitopsis pinícola ТИ 007, Hypsizigus ulmarius ТИ 010, Pyptopurus betulinus ТИ 018. Причём штамм Fumitopsis pinicola ТИ 007 не показал положительной реакции ни на одной из сред, штамм Hypsizigus ulmarius ТИ 010 не показал положительной реакции на среде с добавлением галловой кислоты (классический метод Бавендамма), а штамм Pyptopurus betulinus ТИ 018 не показал положительной реакции на среде с добавлением пирокатехина (модифицированный метод Бавендамма). Наибольшие зоны окрашивания были выявлены у штаммов Bjerkandera adusta ТИ 001, Coriolus hirsutus ТИ 005, Coriolus versicolor 090, Corticium roseum ТИ 042, Funalia trogii ТИ 035 и Panus tigrinus ТИ 025. Максимальная зона окрашивания на среде с галловой кислотой была выявлена у базидиомице-та Coriolus hirsutus ТИ 005, а на среде с пирокатехином у Bjerkandera adusta ТИ 001. Штаммы Funalia trogii ТИ 035 и Panus tigrinus ТИ 025 показали значительные зоны окрашивания на обоих вариантах сред.
Таблица 1. Скрининг оксидазной активности штаммов базидиальных
грибов на агаризованной среде.
Агаризован-ное сусло с галловой кислотой Агаризованная глюкозо-аммо-нийная среда с пирокатехином
Продуцент Диаметр окрашенной зоны, мм Отношение диаметра окрашенной зоны к диаметру колонии Диаметр окрашенной зоны, мм Отношение диаметра окрашенной зоны к диаметру колонии
Antrodiella foliaceo^ntata ТИ 043 27 1,63 14 1,03
Bjerkandera adusta ТИ 001 32 1,29 47 1,17
Cerrena unicolor ТИ 026 18 1,07 18 1,06
Ceriporiopsis resinascens ТИ 030 24 1,67 18 1,34
Coprinus lagopides ТИ 012 24 1,6 30 2,12
Coriolus hirsutus ТИ 005 72 1,14 33 1,59
Coriolus versicolor 090 48 2,04 25 1,4
Corticium roseum ТИ 042 42 2,42 18 1,08
Fomes fomentarius ТИ 006 21 1,52 24 1,89
Fumitopsis pinicola ТИ 007 0 0 0 0
Funalia trogii ТИ 035 41 2,15 42 2,61
Ganoderma applanatum ТИ 009 22 1,22 23 1,91
Ganoderma lucidum 0860 26 1,01 23 1,18
Grifola frondosa ТИ 0008 12 1 19 1,7
Hapalopilus rutilans ТИ 041 36 1,73 19 1,15
Hypsizigus ulmarius ТИ 010 0 0 13 1,1
Merulius tremellosus ТИ 044 24 1,54 20 1,41
Oligoporus cerifluus ТИ 045 12 1,01 13 1,07
Panus conchatus ТИ 028 25 2,1 22 1,78
Panus tigrinus ТИ 025 43 1,25 41 1,29
Pleurotus citrinopeleatus 0830 25 1,79 21 1,83
Pleurotus ostreatus 0553 20 2,08 15 1,19
Pleurotus ostreatus 0786 22 2 20 1,8
Pyptopurus betulinus ТИ 018 14 1,35 0 0
Skeletocutis lenis ТИ 046 31 2,04 32 2,3
Trametes suaveolens ТИ 019 22 1,81 23 1,52
У всех штаммов, показавших положительную реакцию Бавендамма, диаметр окрашенной зоны либо превышал диаметр колонии, либо равнялся ему. Наибольшее превышение диаметра окрашенной зоны по отношению к диаметру колонии наблюдалось у штаммов Coprinus lagopides ТИ 012, Coriolus versicolor 090, Corticium roseum ТИ 042, Funalia trogii ТИ 035, Panus conchatus ТИ 028, Pleurotus ostreatus 0553, Pleurotus ostreatus 0786 и Skeletocutis lenis ТИ 046. У данных штаммов диаметр окрашенной зоны превышал диаметр колонии минимум в два раза.
Для второго этапа скрининга были отобраны штаммы, диаметры окрашенных зон которых равнялись или были больше 25 мм хотя бы на одной из выбранных сред. Данные по динамике оксидазной активности отобранных после первого этапа скрининга продуцентов в глубинной культуре представлены в таблице 2.
Таблица 2. Динамика оксидазной активности в глубинной культуре продуцентов, отобранных после первого этапа скрининга.
Продуцент Оксидазная активность при разной продолжительности культивирования, Ед/мл
Б-е 7-е 10-е 14-е
сутки сутки сутки сутки
Bjerkandera adusta ТИ 001 2,17 2,75 5,72 8,3
Coprinus lagopides ТИ 012 0,01 0,01 0,02 0,02
Coriolus hirsutus ТИ 005 0,04 0,16 0,52 0,54
Coriolus versicolor 090 1,35 1,05 1,02 1,28
Corticium roseum ТИ 042 0,25 0,95 1,25 1,55
Funalia trogii ТИ 035 4,26 6,41 8,51 11,12
Ganoderma lucidum 0860 0 0 0,01 0,01
Hapalopilus rutilans ТИ 041 0,12 0,25 0,26 0,26
Panus conchatus ТИ 028 0,17 0,19 0,24 0,19
Panus tigrinus ТИ 025 0,23 1,44 1,42 1,1
Pleurotus citrinopeleatus 0830 0,04 0,25 0,16 0,12
Skeletocutis lenis ТИ 046 0,48 0,97 1,15 1,23
У всех 12 отобранных для второго этапа скрининга продуцентов, была обнаружена оксидазная активность в глубинной культуре. Наименьшую, следовую активность не превышающую 0,02 Ед/мл показали штаммы Coprinus lagopides ТИ 012 и Ganoderma lucidum 0860. Большинство из изученных штаммов обладали оксидазной активностью, не превышающей 1,6 Ед/мл (в порядке убывания): Corticium roseum ТИ 042, Panus tigrinus ТИ 025, Coriolus versicolor 090, Skeletocutis lenis ТИ 046, Coriolus hirsutus ТИ 005, Hapalopilus rutilans ТИ 041, Pleurotus citrinopeleatus 0830, Panus conchatus ТИ 028. В значительных количествах синтезировали лакказу только штаммы Bjerkandera adusta ТИ 001 и Funalia trogii ТИ 035. При этом максимальная оксидазная активность штамма Funalia trogii ТИ 035 равная 11,12 Ед/мл превышала максимальную оксидазную активность штамма Bjerkandera adusta ТИ 001 в 1,34 раза.
По результатам проведённого в два этапа скрининга в качестве наиболее перспективного продуцента для дальнейшего изучения был отобран штамм Funalia trogii ТИ 035.
Известно, что в состав активного центра лакказы входят 4 катиона меди [11, 12]. Таким образом, добавление катионов меди в питательную среду необходимо для синтеза лакказы. Но, так как медь является фунгицидом и подавляет рост, для максимального синтеза лакказы необходимо было найти оптимальное количество меди в питательной среде.
На рисунке 1 показана зависимость оксидазной активности в культуральной среде штамма Funalia trogii ТИ 035 от концентрации катионов меди. Установлено, что в начале культивирования на 7-е сутки наибольшая оксидазная активность наблюдается при максимальных 0,8 и 1,6 мМ концентрациях Си2+. Однако при более продолжительном культивировании, максимальная оксидазная активность наблюдается при 0,6 мМ концентрации Си2+ в среде.
■ 7-е сутки 10-е сутки
■ 14-е сутки
Концентрация Си504-5Н20, мМ
Рисунок 1. Зависимость оксидазной активности в культуральной среде штамма Funalia ^одп ТИ 035 от концентрации в питательной среде катионов меди.
Известно, что углерод и азот являются двумя наиболее важными компонентами питательной среды для любого ферментативного процесса [13], таким образом, изменяя количество одного или обоих компонентов в среде, можно обеспечить заметное улучшение продукции изучаемого фермента [14, 15]. Динамика оксидазной активности в зависимости от соотношения в питательной среде источников углерода и азота представлена на рисунке 2. Полученные данные показали значительное увеличение оксидазной активности в культуральной среде штамма РипаНа иодН ТИ 035 при культивировании его на средах с высоким содержанием азота. Максимальная оксидазная активность 51,34 Ед/мл была достигнута на питательной среде с соотношением углерода к азоту равным 2 : 1 (10 г/л глюкозы; 15 г/л пептона) на 14 сутки культивирования.
—С/Ы=20:1 (10 г/л глюкозы; 1,5 г/л пептона) С/Н-10:1 (10 г/л глюкозы; В г/л пептона) —С/Н=5:1 (10 г/л глюкозы; 6 г/л пептона) —*-С/М=3:1 (10 г/л глюкозы; 10 г/л пептона) —Ж—С/Ы=2:1 (10 г/л глюкозы; 15 г/л пептона) С/Н=1,4:1 (10 г/л глюкозы; 20 г/л пептона)
Время культивирования, сутки
Рисунок 2. Динамика оксидазной активности в культуральной среде штамма РипаНа ^одп ТИ 035 в зависимости от соотношения в питательной среде источников углерода и азота.
Методом гель-хроматографии определена ориентировочная молекулярная масса фермента лакказы, выделенного из культуральной жидкости штамма РипаНа иодН ТИ 035, которая составила 63 кДа, что соответствует литературным данным, устанавливающим молекулярную массу лакказы в пределах от 32 до 140 кДа [16].
Зависимость активности лакказы от рН буферного раствора содержащего субстрат (пирокатехин) - имеет ко-локолообразный характер (рисунок 3). Каталитическая активность фермента в диапазоне рН 2,2-4,6 скачкообразно увеличивается в семь раз, имеет достаточно острый каталитический пик в диапазоне рН 4,6-5,6, а затем также быстро, как и возрастала, падает в диапазоне рН 5,6-8,0.
120 п
100 -
.80 -
; 60 -
40 -
20 -
10
рн
Рисунок 3. рН-зависимость активности лакказы (продуцент РипаНа ^ди ТИ 035) в универсальном буфере (субстрат пирокатехин). За 100% принималась максимальная активность фермента.
Максимальная активность фермента наблюдается при температуре 52°С и остаётся близкой к максимальной в диапазоне температур 49-59°С (рисунок 4). По литературным данным температурные оптимумы грибных лакказ в зависимости от штамма продуцента лежат в области температур 50-70°С [17, 18]. Термическая стабильность лакказы представлена на рисунке 5. Полученные данные показали, что изучаемая лакказа обладает высо-
кой для грибной лакказы термостабильностью - теряет меньше 10% активности в течение часа при 70°С и меньше 40% активности в течение часа при 80°С. Значительная потеря активности наблюдается лишь при температуре 85°С, когда за 5 минут активность фермента падает до 12,78% от начальной.
100 95 90 85 £80
Í75 <
О 70 65 60 55 50
15 18 21 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 Температура, "С
Рисунок 4. Зависимость активности лакказы от температуры, продуцент Funalia trogii ТИ 035.
-50 °С -60 °С 70 'С -80 °С -85 °С 90 °С
05 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Время, мин.
Рисунок 5. Термостабильность лакказы, продуцент Funalia trogii ТИ 035.
Приведённые данные дают основания для продолжения исследований штамма Funalia trogii ТИ 035 в качестве возможного промышленного продуцента лакказы.
Литература
1. Guo L.Q., Lin S.X., ZhengX.B. [et al.]. Production, purification and characterization of a thermostable laccase from a tropical white-rot fungus // World J. Microbiol Biotechnol. 2011. Vol. 27. P. 731-735.
2. Giardina P., Faraco V., Pezzella C. [et al.]. Laccases: a never-ending story. // Cell Mol Life Sci. 2009. Vol.67. P. 369-385.
3. Рабинович М.Л. Теоретические основы биотехнологии древесных композитов. М.: Наука, 2002. 344 с.
4. Литвинов М.Б. Укрощение лигнина //Химия и жизнь: электронный научный журнал. 2006. № 2. C. 1821. URL: http://www.hij.ru/read/articles/all/1047/ (дата обращения: 20.11.2012).
5. Diaconu M., Litescu S.C.,. Radu G. L. Bienzymatic sensor based on the use of redox enzymes and chitosan-MWCNT nanocomposite. Evaluation of total phenolic content in plant extracts // Microchim Acta. 2011. Vol. 172. P. 177-184.
6. Bullen R.A., Arnot T.C., Lakeman J. B., Walch F. C. Biofuel cells and their development // Biosens Bioelectron.
2006. Vol. 21. P. 2015-2045.
7. Johann F.O. Uses of laccases in the food industry // Enzyme research. 2010. Vol. 2010. P. 8.
8. Снигирева А.В., Врублевская В.В., Лисов А.В., [и др.]. Влияние полимера 2,5-дигидроксибензойной кислоты на миграцию клеток и развитие вирусной инфекции in vitro //16-я Междунар. Пущинская школа-конф. молодых ученых. Биология - наука XXI века. Сборник тезисов. Пущино.. 16-21 апреля 2012 г C. 445. URL: http://www. biology21.ru (дата обращения: 15.11.2012).
9. Bavendamm W. Uber das Vorkommen und den Nachweis von Oxydasen dei holzzerstorenden Pilzen. // Z. Pflanzenkr Planzenschutz. 1928. № 38. P. 257-276.
10. Русинова Т.В. Разработка технологии биосинтеза фермента лакказы базидиальными грибами рода Trametes: автореф. дис. ... канд. техн. наук. М.: МГУИЭ.
2007. 20 с.
11. Solomon E.I. Sundraham U.M., Machonkin T.E. Multicopper oxidases and oxygenases. // Chem. Rew. 1996. Vol. 96. P. 2563-2606.
12. Лихтенштейн Г.И. Многоядерные окислительно-восстановительные металлоферменты. М.: Наука, 1979. С. 323
13. Pandey A., Radhakrishnan S. Packed bed column bioreactor for production of enzymes // Enzyme Microb Technol . 1992. ol. 14. P. 486-488.
14. Jordaan J. Isolation and characterization of a novel thermostable and catalytically efficient laccase from Peniophora sp. strain UD4 // PhD thesis Rhodes University. 2005. URL: http://eprints.ru.ac.za/211/1/JustinJordaan_PhD_ Thesis.pdf (дата обращения: 19.11.2012).
15. Masurekar P. S. Nutritional and engineering aspects of microbial process development // Prog Drug Res.
2008. Vol. 65. P. 291, 293-328.
16. Болобова А.В., Аскадский А.А., Кондращен-ко В.И., Рабинович М.Л. Теоретические основы биотехнологии древесных композитов Книга 2. Ферменты, модели, процессы. М.: Наука, 2002. C. 126-127.
17. Luisa M. Goncalves F.C., Steiner W. Purification and characterisation of laccase from a newly isolated wood-decaying fungus: Enzymes for Pulp and Paper Processing // Ame. Chem. Soc. 1996. Vol.20. P. 258-263.
18. Baldrian P. Fungal laccasess - occurrence and properties // FEMS Microbiol. Rev. 2005. Vol. 20. P. 1-28.
