СКРИНИНГ ПРОДУЦЕНТОВ ЛИПАЗ Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

УДК 579.

M.A. Pushkarev, T.B. Lisitskaya, V.A. Galynkin, A.V. Garabadzhiu, G.V. Kozlov

SCREENING OF LIPASE PRODUCERS

St. Petersburg State Institute of Technology (Technical University) Moskovsky Pr. 26, St Petersburg, 190013, Russia e-mail: malexpush@bk.ru

Microorganism cultures from the collection of the Department of Technology of microbiological synthesis of the St. Petersburg State Technological Institute (Technical Univeesity) were screened for their lipase producing ability. Among the tested cultures were 30 strains of bacteria, 39 yeast strains and 38 strains of micromycetes. It was found that 32 microorganism cultures are able to produce extracellular lipase. The values of the activity and specific activity were found during deep cultivation of the lipase producers.

Key words: screening, extracellular, lipase, bacteria, yeasts, micromycetes, specific activity.

5:577.15

М.А. Пушкарев1, Т.Б. Лисицкая2, В.А. Галынкин3, А.В. Гарабаджиу4, Г.В. Козлов5

СКРИНИНГ ПРОДУЦЕНТОВ ЛИПАЗ

Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет), Московский пр., д. 25, Санкт-Петербург, 190013, Россия e-mail: malexpush@bk.ru

Проведен скрининг продуцентов липаз среди культур микроорганизмов, находящихся в коллекции кафедры технологии микробиологического синтеза Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета). Среди исследованных культур 30 штаммов бактерий, 39 штаммов дрожжей и 38 штаммов микромицетов выявлено 32 культуры микроорганизмов, способных продуцировать внеклеточную липазу. Определены значения объемной и удельной активностей при глубинном культивировании продуцентов липаз.

Ключевые слова: скрининг, внеклеточные, липазы, бактерии, дрожжи, микромицеты, удельная активность.

Введение

Источниками получения ферментов липаз (три-ацилглицерол-ацилгидролазы, ЕС 3.1.1.3) могут быть растения, поджелудочная железа животных, а также штаммы природных и рекомбинантных микроорганизмов [1]. Липазы из микроорганизмов имеют ряд преимуществ. Во-первых, источник получения липаз является возобновляемым. Во-вторых, липазы микроорганизмов имеют более широкий рН и температурный диапазон действия по сравнению с липазами животных и растений. В-третьих, липазы микроорганизмов удобны с точки зрения использования в биотехнологии. Однако высокая стоимость липаз ограничивает их применение в промышленности и делает актуальным поиск новых высокоактивных продуцентов среди различных групп микроорганизмов.

Основные отрасли промышленности, где липазы находят применение: пищевая, молочная, масложи-ровая переработка, агрохимическая промышленность, производство бумаги, как добавка к моющим средствам, органический синтез, косметическая и фармацевтическая промышленности [2]. Перспективным является использование липаз в качестве биокатализатора в биодизельной технологии [3].

Целью данного исследования являлся поиск продуцентов липаз среди культур микроорганизмов, находящихся в коллекции кафедры технологии микробиологического синтеза (ТМС).

Объекты и методы исследования

Объектом исследования служили штаммы культур бактерий, дрожжей и грибов. Чистые культуры взяты из коллекции кафедры ТМС СПбГТИ(ТУ). Перечень исследованных культур приведён в таблицах 1-3.

Исходные культуры отсевали из музейных культур, хранящихся на скошенном питательном агаре при температуре 4 °С. Культуры выращивали также на скошенном питательном агаре при температуре 28-30 °С в течение 2-4 суток.

Скрининг продуцентов липаз проводили в два этапа. На первом этапе выявляли наличие/отсутствие ли-политической активности на агаризованной питательной среде. На втором этапе определяли количественным методом липолитическую активность на жидкой питательной среде.

Для первого этапа скрининга использовали ага-ризованные среды различного состава для бактерий, дрожжей и мицелиальных грибов. Для скрининга бактерий и дрожжей на агаризованной среде был использован метод, описанный в [4]. Для определения активных штаммов среди микромицетов был использован метод описанный в [5].

Среда для скрининга бактерий, г/л: пептон - 10,0, К2НРО4 - 1,0; СаС12 - 0,1, агар-агар - 20, Naa - 5,0.

Среда для скрининга дрожжей, г/л: сухой питательный агар - 40, глюкоза - 10, СаС12 - 0,2.

1 Пушкарёв Михаил Алексеевич, ассистент, каф. технологии микробиологического синтеза, e-mail: malexpush@bk.ru Pushkarev Mikhail A. assistant, Department of Technology of Microbiological Synthesis, e-mail: malexpush@bk.ru

2 Лисицкая Татьяна Борисовна, канд. техн. наук, зав. каф. технологии микробиологического синтеза, e-mail: lissitskayat@rambler.ru Lisitskaya Tatiana B., PhD (Eng.), Head Department of Technology of Microbiological Synthesis, e-mail: lissitskayat@rambler.ru

3 Галынкин Валерий Абрамович, д-р техн. наук, профессор каф. технологии микробиологического синтеза, e-mail: 7731254@mail.ru Galynkin Valerii A., Dr Sci (Eng.), Professor, Department of Technology of Microbiological Synthesis, e-mail: 7731254@mail.ru

4 Гарабаджиу Александр Васильевич, д-р хим. наук, проректор по научной работе, профессор каф. технологии микробиологического синтеза, e-mail: gar-54@mail.ru

Garabadzhiu Aleksandr V., Dr Sci. (Chem.), Vice rector for scientific work, Professor, Department of Technology of Microbiological Synthesis, e-mail: gar-54@mail.ru

5 Козлов Григорий Владимирович, канд. биол. наук, доцент каф. технологии микробиологического синтеза, e-mail: kozlov_gv@mail.ru Kozlov Grigorii V., PhD (Biol.), Associate professor, Department of Technology of Microbiological Synthesis, e-mail: kozlov_gv@mail.ru

Дата поступления - 29 сентября 2014 года Received September, 29 2014

Среды стерилизовали в автоклаве при избыточном давлении 50,7 кПа в течение 30 мин. Отдельно готовили 20 %-ный водный раствор Твина-80, стерилизовали аналогично и добавляли к питательной среде (концентрация Твина-80 в питательной среде - 5 %). Раствор разливали в стерильные чашки Петри по 20 мл. На поверхность агаровой пластинки делали посев исследуемых бактерий/дрожжей со скошенного агара штрихом в трёх повторностях.

Состав среды для скрининга микромице-тов, г/л: KH2PO4 - 0,7; K2HPO4 - 0,3; MgSO4-7H2O - 0,5; NaNO3 - 2,0; KCl - 0,5; FeSO^^O - 0,01; сахароза -30; родамин В (0,1 % раствор) - 2 мл; оливковое масло

- 30 мл; Твин-80 - 0,25 мл; агар-агар - 10. Среду подвергали стерилизации в условиях, описанных выше. Оливковое масло и Твин-80 стерилизовали отдельно от основной среды. К среде, охлажденной до 60 °C, добавляли смесь оливкового масла, Твина-80 и родамина В при интенсивном встряхивании и выдерживали 10 мин при 60 °С до снижения вспенивания. Полученный раствор разливали в чашки Петри по 20 мл. Культуры высевали уколом в центр пластинки и инкубировали при 30 °С.

Глубинное культивирование продуцентов липаз проводили в колбах Эрленмейера со 100 мл среды на роторной качалке (частота вращения 230 мин-при 28-32 °С. Посевной материал для глубинного культивирования выращивали в два этапа. На первом этапе культуры бактерий со скошенного агара петлёй вносили в жидкую питательную среду, г/л: масло оливковое - 5,0; Твин 80 - 5,0; пептон - 3,0; КН2РО4 - 1,0; дрожжевой экстракт - 1,0; NH4NO3 - 1,0; MgSO4x7H2O

- 0,5. Через сутки культивирования (второй этап) получали посевной материал на жидкой среде, которым засевали колбы с таким же составом питательной среды. Количество посевного материала составляло 5% от объёма среды в колбе. Культивирование проводили в течение суток.

Из культуральной жидкости клетки отделяли центрифугированием при 4000 g. В нативном растворе определяли количество белка методом Лоури [6] и активность липазы.

Активность липазы измеряли модифицированным методом Shukla [7]. В качестве субстрата липазы использовали 40 % Твин-80. К 5 мл 40% раствора Твина-80 добавляли 4 мл воды и 1 мл нативного раствора. Ферментативную реакцию проводили при 37 °C, на роторной качалке при 250 мин-1 в течение 3-х суток, реакцию останавливали добавлением 30 мл 95 % этанола. Освобождённые из Твина-80 кислоты титровали 0,05н раствором КОН в присутствии 1% раствора фенолфталеина. Отдельно готовили контрольную пробу из 5 мл 40% раствора Твина-80 и 4 мл воды, выдерживали в аналогичных условиях, добавляли 30 мл 95% этанола и 1 мл нативного раствора. За единицу активности липазы (U) принимали количество фермента, необходимое для освобождения 1 мкмоля олеиновой кислоты за 1 минуту.

Результаты

На первом этапе скрининг продуцентов липаз проводили на агаризованной среде. О способности продуцировать внеклеточную липазу культурами бактерий и дрожжей судили по образованию зоны кальциевых солей жирных кислот вокруг штриха культуры. Наблюдение проводили для бактерий на первые, вторые и пятые сутки культивирования, для дрожжей

- на третьи и пятые сутки. Рост колоний отмечен среди всех культур бактерий и дрожжей на первые сутки культивирования. Данные об образовании зоны кальциевых солей жирных кислот исследованными культурами бактерий и дрожжей приведены в таблице 1 и таблице 2.

Таблица 1. Липолитическая активность исследованных культур бактерий

№ Культура Липолитическая активность

1 сутки 2 сутки 5 сутки

1 Agrobacterium sp. - - -

2 Arthrobacter citreus - + +*

3 Arthrobacter globiformis - - +

4 Azotobacter chroococcum - + +

5 Bac. megaterium - - -

6 Bac. mesentericus - + +

7 Bac. mycoides - - -

8 Bac. polymyxa - + +

9 Bac. subtilis - - -

10 Bac. subtilis шт. 79 (329) - + +

11 Bac. thuringiensis - + +*

12 Bacillus cereus - - -

13 Flavobacterium sawor - - +

14 Flavobacterium sp. - + +

15 Micrococcus corallines - - -

16 Micrococcus polychromus - - -

17 Mycobacterium album - - -

18 Mycobacterium brevicola - - +

19 Mycobacterium luteum - + +

20 Mycobacterium phlei + +* +*

21 Mycobacterium sp. + + +*

22 Nocardia rubra - - +

23 Pseudomonas aurantiaca 336/547 - - -

24 Pseudomonas fluorescens - - -

25 Pseudomonas sp. - - -

26 Rhodococcus equi + +* +*

27 Sarcina erythromyxa + +* +*

28 Sarcina flava - +* +*

29 Sarcina lutea - + +

30 Staphylococcus citreus - + +

Примечание * - большая зона

Таблица 2. Липолитическая активность исследованных культур дрожжей

№ Культура Активность

3 сутки 5 сутки

1 Candida albicans - -

2 Candida brancii - -

3 Candida glabrata - -

4 Candida krusei - -

5 Candida parapsilosis + +

6 Candida pseudotropicalis № 9 (20-10) + +

7 Candida tropicalis - +

8 Candida tropicalis № 9 (20-10) + +

9 Hansenula sp. - -

10 Hansenula apiculate - -

11 Hansenula beijerinck - -

12 Kluyveromyces marxianus - -

13 Mycoderma vini - -

14 Pichia sp. - -

15 Pichia alcalophila - -

16 Rhodotorula sp. - +

17 Saccharomyces bayanus - -

18 Saccharomyces cerevisiae - -

19 Saccharomyces cerevisiae (Бочкарёв) - -

20 Saccharomyces cerevisiae № 9 - -

21 Saccharomyces cerevisiae № 10 - -

22 Saccharomyces ellipsoids - -

23 Saccharomyces oviformis - -

24 Sporobolomyces pararoseum D-9 - -

25 Sporobolomyces salmonicolor - +

26 Torula fomata + +

27 Torula niger - -

28 Torula rubra 5 (649) - +

29 Torula rubra 649 - -

30 Torulopsis anomala + +

31 Trichosporon sp. 26/4 + +

32 Trichosporon cutaneum K-2 - -

33 Willia anomala - -

34 Willia sp. 1 - -

35 Willia sp. 2 - -

36 Willia sativa - -

37 Zygosaccharomyces sp. - -

38 Дрожжи из почвы - +

39 Пивные дрожжи - -

О способности продуцировать внеклеточную липазу культурами микромицетов судили по образованию оранжевой люминисцирующей зоны вокруг места высева культуры микромицета. Наблюдение проводили на третьи сутки культивирования. Рост колоний микромицетов отмечен для всех культур. Данные об образовании люминисцирующей зоны исследованными культурами микромицетов приведены в таблице 3.

Таблица 3. Липолитическая активность исследованных культур микромицетов

№ п/п Микроорганизмы Липолитическая активность, 3-и сутки

Дейтеромицеты:

1 Acremonium roseum -

2 Alternaria alternata -

3 Alternaria radicina -

4 Alternaria sp. -

5 Aspergillus niger -

6 Aspergillus oryzae -

7 Cladosporium resinae -

8 Fusarium avenaceum -

9 Fusarium graminearum -

10 Fusarium moniliforme -

11 Fusarium oxysporum -

12 Penicillium anela -

13 Penicillium brevicompactum -

14 Penicillium camemberti +

15 Penicillium ciclopium -

16 Penicillium chrysogenum -

17 Penicillium funiculosum -

18 Penicillium glaucum -

19 Penicillium nalgiovensis -

20 Penicillium notatum -

21 Penicillium ochro-chloron -

22 Penicillium puberulum -

23 Penicillium purpurogenum -

24 Verticillium fungicola -

25 Verticillium dahlia -

Аскомицеты:

26 Chaetomium fumicolum -

27 Chaetomium cochliodis шт. 266 -

28 Chaetomium oganova -

29 Cochliobolus sativus -

30 Gliocladium vermoeseni -

Зигомицеты:

31 Mucor mucedo -

32 Mucor sp. -

33 Rhizopus oryzae +

Базидиомицеты:

34 Bjerkandera adusta -

35 Coriolus versicolor -

36 Lentinus edodes -

37 Pleurotus ostreatus -

Как видно из таблицы 1, зону кальциевых солей образует значительное количество культур бактерий. На первые сутки культивирования зона кальциевых солей появилась только у 4 бактерий - Rhodococcus equi, Mycobacterium sp., M.phlei, Sarcina erythromyxa,. На вторые сутки культивирования зона кальциевых солей наблюдалась у еще 11 культур - Staphylococcus citreus, Sarcina lutea, S. flava, M.luteum, Bac. subtilis шт. 79 (329), Bac. thuringiensis, Flavobacterium sp., Bac. polymyxa, Bac. mesentericus, Azotobacter chroococcum, Arthrobacter citreus. Всего на пятые сутки культивирования выявлено 19 культур бактерий, продуцирующих внеклеточную липазу.

Среди исследованных 39 культур дрожжей выявлено 11 культур продуцирующих внеклеточную липазу, среди которых четыре культуры рода Candida - C. parapsilosis, C. pseudotropicalis, два штамма C. tropicalis, а также Rhodotorula sp., Sporobolomyces salmonicolor, Torula fomata, T.rubra 5 (649), Torulopsis anomala, Trichosporon 26/4 и неидентифи-цированная культура дрожжей из почвы (таблица 2).

Среди 38 культур микромицетов выявлено всего 2 культуры, продуцирующих внеклеточную липазу - дей-теромицет Penicillium camamberti и зигомицет Rhizopus oryzae (таблица 3)

Отобранные на первом этапе скрининга культуры микроорганизмов культивировали на жидкой питательной среде. В нативном растворе культуральной жидкости определяли липолитическую активность и концентрацию белка. Результаты по объёмной и удельной активности липаз, полученные на 3-и сутки культивирования, приведены в таблице 4.

Таблица 4. Липолитическая активность микроорганизмов на жидкой питательной среде

№ Микроорганизмы и/мл Сб г/мл U/мг

Бактерии:

1 Arthrobacter citreus 0,241±0,012 0,359±0,019 0,670±0,070

2 Arthrobacter globiformis 0,155±0,008 0,303±0,016 0,510±0,050

3 Azotobacter chroococcum 0,109±0,007 0,449±0,023 0,240±0,027

4 Bac. mesentericus 0,330±0,016 0,540±0,028 0,610±0,060

5 Bac. polymyxa 0,299±0,015 0,517±0,025 0,580±0,060

6 Bac. subtilis 79 (329) 0,043±0,002 0,359±0,018 0,121±0,012

7 Bac. thuringiensis 0,229±0,014 0,404±0,020 0,570±0,060

8 Flavobacterium sawor 0,283±0,014 0,494±0,025 0,570±0,050

9 Flavobacterium sp. 0,118±0,006 0,730±0,030 0,161±0,012

10 Mycobacterium brevicola 0,082±0,005 0,620±0,030 0,132±0,014

11 Mycobacterium luteum 0,052±0,002 0,509±0,026 0,102±0,013

12 Mycobacterium phlei 0,297±0,017 0,382±0,015 0,780±0,080

13 Mycobacterium sp. 0,321±0,016 0,359±0,019 0,890±0,090

14 Nocardia rubra 0,064±0,003 0,239±0,012 0,269±0,027

15 Rhodococcus equi 0,278±0,014 0,449±0,023 0,620±0,060

16 Sarcina erythromyxa 0,116±0,006 0,860±0,040 0,136±0,014

17 Sarcina flava 0,064±0,003 0,438±0,023 0,147±0,015

18 Sarcina lutea 0,127±0,008 0,359±0,017 0,350±0,040

19 Staphylococcus citreus 0,030±0,002 1,305±0,068 0,023±0,002

Дрожжи:

20 Candida parapsilosis 0,109±0,006 0,700±0,040 0,157±0,016

21 Candida pseudotropicalis № 9 (20-10) 0,330±0,016 0,670±0,040 0,480±0,050

22 Candida tropicalis 0,214±0,011 0,337±0,018 0,630±0,070

23 Candida tropicalis № 9 (20-10) 0,243±0,012 0,426 ±0,022 0,570±0,060

24 Rhodotorula sp. 0,165±0,008 0,610±0,030 0,272±0,028

25 Sporobolomyces salmonicolor 0,056±0,003 0,348±0,018 0,159±0,016

26 Torula fomata 0,276±0,014 0,517±0,027 0,530±0,050

27 Torula rubra 5 (649) 0,111±0,006 0,404±0,019 0,275±0,027

28 Torulopsis anomala 0,078±0,004 0,650±0,030 0,120±0,012

29 Trichosporon sp. 26/4 0,125±0,006 0,940±0,050 0,132±0,014

30 Дрожжи из почвы 0,085±0,004 0,740±0,030 0,115±0,011

Грибы:

31 Penicillium camamberti 0,109±0,005 1,030±0,050 0,106±0,011

32 Rhizopus oryzae 0,339±0,020 1,370±0,070 0,247±0,028

Исходя из полученных данных, можно выделить 9 культур бактерий: наибольшую удельную активность среди бактерий показала культура Mycobacterium sp. а также культуры M.phlei, Arthrobacter citreus, A.globiformis, Rhodococcus equi, Bac. Mesentericus, Bac. Polymyxa, Bac. Thuringiensis, Flavobacterium sawar.

Среди исследованных культур дрожжей-продуцентов липаз высокой удельной активностью обладают культуры Torula fomata, два штамма C. tropicalis и C. pseudotropicalis.

Наибольшую объёмную активность среди микромицетов, сравнимую с активностью липаз бактерий, имеет Rhizopus oryzae. В тоже время удельная активность липазы Rhizopus oryzae не велика. Это может быть связано с высокой экспрессией внеклеточных белков, а также с высоким содержанием в среде белковых компонентов исходной питательной среды.

Заключение

В результате проведенного двухступенчатого скрининга продуцентов липаз на агаризованной и жидкой питательных средах среди 107 культур микроорганизмов выявлено 32 культуры, образующих внеклеточную липазу: 19 культур бактерий, 11 культур дрожжей и 2 культуры микромицетов. Показано, что у девяти культур бактерий (Arthrobacter citreus, A.globiformis, Bac. mesentericus, Bac. polymyxa, Bac. thuringiensis, Flavobacterium sawor, Mycobacterium sp., M.phlei Rhodococcus equi) и у трёх культур дрожжей (Candida pseudotropicalis C. tropicalis, Torula fomata) удельная активность липазы 2-3 раза выше, чем у Rhizopus oryzae, который известен как продуцент липазы по литературным данным [7].

Таким образом, проведённый скрининг позволил выявить перспективные продуценты липаз среди бактериальных и дрожжевых культур. На следующем этапе исследования будет проведена оптимизация состава среды по разным источникам азота и углерода, различным индукторам липазы и по другим факторам, способствующим продуцированию липазы (например, ионам металлов Ca, Mg, Fe и др.).

Литература

1. Manali Kapoor, Munishwar Nath Gupta. Lipase promiscuity and its biochemical applications. // Process Biochemistry. 2012. V. 47. P. 555-569

2. Sharma Rohit, Yusuf Chisti, Uttam Chand Ba-nerjee . Production, purification, characterization, and applications of lipases // Biotechnology Advances. 2001. № 19. Р. 627-662.

3. Гарабаджиу А.В. Галынкин В.А., Карасев М.М., Козлов Г.В., Лисицкая Т.Б. Основные аспекты использования липаз для получения биодизеля (обзор) // Известия СПбГТИ(ТУ). 2010. № 7. С. 63-67.

4. lonita A., Moscovici V., Popa C., Vamanu A., Popa O., Dinu L. Screening of yeast and fungal strains for lipolytic potential and determination of some biochemical properties of microbial lipases // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 1997. Vol. 3, № 1-4. P. 147-151.

5. Hou, C.T. Johnston T.M. Screening of Lipase Activities with Cultures from the Agricultural Research Service Culture Collection // J. Amer. Oil Chemists' Society. 1992. Vol. 69. № 11. P. 1088-1097.

6. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. № 193. P. 265-275.

7. Shukla P., Gupta K. Ecological screening for lipolytic molds and process optimization for lipase production Rhizopus oryzae KG-5 // Journal of Applied Sciences in Environmental Sanitation. 2007. Vol. 2, № 2. P. 35-42.