CC BY
51
УДК 577.352.38; 616-001.11; 577.19
8к01 КАК РЕГУЛЯТОР ПРОЦЕССОВ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ ПРИ ГИПЕРОКСИИ
© 2012 г. В.В. Внуков, А.О. Даниленко, Н.П. Милютина, А.А. Ананян, О.И. Гуценко
Внуков Валерий Валентинович - доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой биохимии и микробиологии, биолого-почвенный факультет, Южный федеральный университет, ул. Б. Садовая, 105/42, г. Ростов н/Д, 344006, e-mail: [email protected].
Vnukov Valery Valentinovich - Doctor of Biological Science, Professor, Head of the Department of Biochemistry and Microbiology, Faculty of Biology and Soils, Southern Federal University, B. Sadovaya St., 105/42, 344006, Rostov-on-Don, e-mail: [email protected].
Даниленко Алеся Олеговна - инженер, кафедра биохимии и микробиологии, Южный федеральный университет, ул. Б. Садовая, 105/42, г. Ростов н/Д, 344006, e-mail: [email protected].
Danilenko Alesya Olegovna - Engineer, Department of Biochemistry and Microbiology, Southern Federal University, B. Sadovaya St., 105/42, 344006, Rostov-on-Don, e-mail: adan00 7@inbox. ru.
Милютина Наталья Петровна - кандидат биологических наук, профессор, кафедра биохимии и микробиологии, биолого-почвенный факультет, Южный федеральный университет, ул. Б. Садовая, 105/42, г. Ростов н/Д, 344006, e-mail: [email protected].
Milyutina Natalia Petrovna - Candidate of Biological Science, Professor, Department of Biochemistry and Microbiology, Faculty of Biology and Soils, Southern Federal University, B. Sadovaya St., 105/42, 344006, Rostov-on-Don, email: [email protected].
Ананян Анжелика Аршаковна - кандидат биологических наук, доцент, кафедра биохимии и микробиологии, биолого-почвенный факультет, Южный федеральный университет, ул. Б. Садовая, 105/42, г. Ростов н/Д, 344006, e-mail: [email protected].
Ananyan Anzhelika Arshakovna - Candidate of Biological Science, Associate Professor, Department of Biochemistry and Microbiology, Faculty of Biology and Soils, Southern Federal University, B. Sadovaya St., 105/42, 344006, Rostov-on-Don, email: [email protected].
Гуценко Ольга Ивановна - аспирант, кафедра биохимии и микробиологии, биолого-почвенный факультет, Южный федеральный университет, ул. Б. Садовая, 105/42, г. Ростов н/Д, 344006, e-mail: [email protected].
Gutsenko Olga Ivanovna - Post-Graduate Student, Department of Biochemistry and Microbiology, Faculty of Biology and Soils, Southern Federal University, B. Sadovaya St., 105/42, 344006, Rostov-on-Don, e-mail: [email protected].
Исследовано влияние катионного производного пластохинона — 10-(6'-пластохинонил)децилтрифенилфосфония (SkQ1) на состояние системы ПОЛ—антиоксиданты (АО) в крови крыс при оксидативном стрессе (ОС), вызванном гипербарооксигенацией (ГБО; 0,5 МПа, 90 мин). Установлено, что при ГБО-индуцированном ОС в крови наблюдается интенсификация ПОЛ, сопровождающаяся накоплением его молекулярных продуктов на фоне напряженности и нарушения синергизма функционирования ферментов АО системы. Предварительное введение SkQ1 в чрезвычайно низких концентрациях (50 нмоль/кг) в течение 5 дней перед сеансом ГБО предотвращает активацию ПОЛ, снижает напряженность и дисбаланс АО системы и эффективно оптимизирует редокс-статус крови.
Ключевые слова: гипербарическая оксигенация, окислительный стресс, катионные производные пластохинона, эритроциты.
Effects of 10-(6'- plastoquinonil) deciltriphenylphosphonium (SkQ1) on the lipid peroxidation-antioxidant (AO) in blood under oxidative stress (OS) indused by hyperbaric oxygenation (HBO, the exposure duration was set at 90 minutes at 0.5 MPa) have been studied. It was found that the HBO-induced oxidative stress causes an appreciable accumulation of lipid peroxidation molecular products, disorders of antioxidant system synergy. Administration of the mitochondria-targeted antioxidant SkQ1 in extremely low amount (50 nmol/kg for 5 days) effectively inhibits the accumulation of lipid peroxidation molecular products, reduces the imbalance in AO system functioning and effectively normalizes the redox-balance in blood.
Keywords: Hyperbaric oxygenation, oxidative stress, cation plastoquinone derivates, erythrocytes.
Окислительный стресс является широко распространенным состоянием в живых системах и развивается при многих патологических процессах и экстремальных воздействиях [1]. Активные формы кислорода (АФК) в физиологических концентрациях являются сигнальными молекулами, принимая участие в формировании разнообразных физиологических ответов, а при гиперпродук-
ции могут приводить к глубоким нарушениям структурно-метаболического гомеостаза. Дисбаланс в системах продукции и утилизации АФК приводит к формированию состояния окислительного стресса, развитие которого представляет собой «порочный круг»: АФК вызывают окислительные повреждения макромолекул, автоката-литически приводящие к усилению их генерации [2].
Накапливающиеся дефекты макромолекул запускают процесс самоликвидации клеток. Гибель клетки, как правило, есть результат реализации одной из программ, заложенных в ее геноме, в частности, различные виды апоптоза или некроза, а также их комбинации [3, 4]. Центральную роль при апоптозе играют митохондрии [5] не только потому, что их электронтранс-портная цепь (ЭТЦ) - один из основных центров ради-калообразования, но и за счет наличия большого числа про- и антиапоптотических факторов в межмембранном пространстве. В свою очередь это обусловливает необходимость поддерживать целостность и функциональное состояние митохондриальных мембран.
Интерес к созданию синтетических антиоксидан-тов, способных эффективно предотвращать свободно-радикальное окисление молекул, поддерживается на высоком уровне уже более 40 лет. Наиболее современный подход к синтетическим биологически активным антиоксидантам, основанный на их адресной доставке непосредственно к основным центрам продукции радикалов, в последние годы был предложен В.П. Скулачевым [5]. Поскольку матрикс митохондрий является единственным отрицательно заряженным отсеком внутри клетки, антиоксиданты, конъ-югированные с катионами и способные проникать через мембраны, могут эффективно нейтрализовать в них АФК. Присоединение пластохинона (природного антиоксиданта в составе тилакоидов) при помощи углеводородного линкера к положительно заряженной молекуле трифенилфосфония позволило получить не только митохондриально-адресованный, но и возобновляемый за счет дыхательной цепи антиоксидант [5].
В данной работе мы исследовали способность ми-тохондриально-адресованного антиоксиданта, относящегося к катионным производным пластохинона, -10-(6'-пластохинонил)децилтрифосфония (SkQ1) - в чрезвычайно низких концентрациях регулировать развитие окислительного стресса, вызванного воздействием повышенного давления кислорода.
Материалы и методы исследования
Эксперимент проведен на беспородных самцах Rattus norvegicus массой 180-200 г, содержавшихся в виварии на стандартной лабораторной диете. Все подопытные животные были разделены на 3 группы: 1-я (контроль) - интактные животные; 2-я - крысы, подвергнутые действию гипербароксигенации (ГБО). 3-я - крысы, которым в течение 5 дней в защечные мешки вводили этанольный раствор SkQ1 в дозе 50 нмоль/кг, а затем через 1 ч после последнего введения подвергали действию ГБО. В барокамере создавалось давление 0,5 МПа, изопрессия составляла 90 мин. После сеанса ГБО животных декапитировали.
Влияние SkQ1 на уровень молекулярных продукт
Интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) в крови определяли по накоплению его продуктов: диеновых конъюгатов (ДК) [6], малонового диальдегида (МДА) [7] и шиффовых оснований (ШО) [8]. Состояние ферментативного антиоксидантного звена эритроцитов оценивали по активности суперок-сиддисмутазы (СОД) [9], каталазы [10], глутатионпе-роксидазы (ГПО) [11], глутатионредуктазы (ГР) [12]. О состоянии неферментативного антиоксидантного звена эритроцитов судили по содержанию небелковых тиолов, представленных в основном восстановленным глутатионом (GSH) [13].
Статистическую обработку полученных результатов проводили по стандартным формулам, используя в качестве показателя разброса значений стандартную ошибку среднего. Средние значения сравнивали с использованием ^критерия Стьюдента, считая различия достоверными при р не менее 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
В качестве модели окислительного стресса мы использовали ГБО, основываясь на многолетних фундаментальных и прикладных исследованиях кафедры биохимии и микробиологии Южного федерального университета [14]. Кровь - первая ткань после легких, которая испытывает токсическое действие гипербарического кислорода, а также, являясь интегративной тканью, способна адекватно отражать общее состояние организма при стрессорном воздействии. Более того, в силу своей биологической функции эритроциты более других клеток контактируют с O2 и его активными формами.
Экспозиция крыс при 0,5 МПа в течение 90 мин в значительной степени усиливает протекание цепных процессов ПОЛ плазмы крови и мембран эритроцитов. Как известно, в ходе самых первых стадий ли-попереокисления отрыв атома водорода от молекулы ненасыщенных жирных кислот приводит к появлению системы сопряженных двойных связей. Таким образом, уровень ДК отражает интенсивность сво-боднорадикального окисления липидов на самых начальных этапах ПОЛ. В крови крыс после сеанса ГБО уровень ДК выше нормы на 21-60 % (табл. 1). Однако ДК - достаточно нестабильные соединения, которые легко подвергаются дальнейшей окислительной деградации с образованием более стабильных вторичных продуктов, наиболее важными из которых являются алкенали - МДА. Содержание МДА, отражающего интенсивность промежуточных стадий ПОЛ в крови крыс после действия гиперок-сии, увеличивается на 26-28 % (табл. 1).
Таблица 1
ПОЛ в крови крыс при гипероксии. М±т, и=11^13
Условия эксперимента Плазма крови Эритроциты
ДК, нмоль/мг ОЛ МДА, нмоль/мг белка ШО, о.е.фл./мг ОЛ ДК, нмоль/мг ОЛ МДА, нмоль/мг белка ШО, о.е.фл./мг ОЛ
Контроль 3,59 ±0,09 0,29 ±0,02 0,35 ±0,02 9,95 ±0,84 2,20 ±0,21 2,77 ±0,23
ГБО, р (Д%) 4,35 ±0,29 < 0,01(+21) 0,37 ±0,03 <0,02(+28) 0,44 ±0,03 <0,02(+26) 15,91±2,02 <0,02(+60) 2,78 ±0,17 <0,05(+26) 4,97 ±0,48 <0,001(+80)
ГБО+SkQl, р (Д%) 3,40 ±0,21 > 0,1 0,30 ±0,03 > 0,1 0,39 ±0,02 > 0,1 9,06 ±0,87 > 0,1 1,60 ±0,13 < 0,05(-27) 3,03 ±0,31 > 0,1
МДА - реакционно-способная молекула, которая при взаимодействии с аминосодержащими агентами (белки, некоторые фосфолипиды, нуклеотиды, нуклеиновые кислоты, аминокислоты) образует флюоресцирующие соединения типа ШО, которые в большинстве своем инертны, не разрушаются лизосомами, могут накапливаться в организме. Поскольку в норме обрыв цепных реакций ПОЛ, как правило, происходит до стадии образования ШО, их накопление может отражать глубину окислительных нарушений в тканях. Так, прирост уровня конечных продуктов ПОЛ на 26 и 80 % в плазме и эритроцитах крыс после сеанса ГБО (табл. 1) свидетельствует не только о значительной активации ПОЛ, но и о недостаточной мощности естественных антиокислительных систем, неспособных оборвать каскад цепных
Влияние SkQ1 на активность антиоксидантных ферментов
реакций и затормозить окислительную деградацию ли-пидов плазмы и клеток крови и предотвратить образование нерастворимых цитотоксичных продуктов.
Естественная антиоксидантная емкость крови позволяет поддерживать процессы ПОЛ на стационарном уровне, обусловливающем выполнение множества физиологических функций. Однако кислород под давлением 0,5 МПа в течение 90 мин вызывает заметное разобщение в работе антиоксидантных ферментов и существенно снижает пул восстановленных тиолов в эритроцитах (табл. 2). Так, при ГБО активность СОД в эритроцитах незначительно отличается от контроля, тогда как активность каталазы в эритроцитах превышает норму на 39 %, что может свидетельствовать о развитии компенсаторно-приспособительных реакций.
Таблица 2
штроцитов крыс в норме и при гипероксии. М±т, и=11^13
Условия Эритроциты
СОД, у.е./(минмг) Hb Каталаза, нМ/(минмг) Hb ГПО, МЕ/г Hb ГР, МЕ/г Hb GSH, мкм/г Hb
Контроль 4,25±0,20 32,6±3,3 504,2±20,1 6,79 ±0,34 9,55 ±0,39
ГБО, 4,79±0,32 45,2±2,0 428,3±25,2 8,85 ±0,67 8,43 ±0,50
р (Д %) > 0,1 < 0,02 (+39) < 0,05 (-15) < 0,01 (+30) 0,05<p<0,1(-12)
ГБО+SkQl, 5,90±0,39 44,9±3,9 533,7±24,3 6,25 ±0,47 10,01 ±0,9
р (Д %) < 0,001(+39) < 0,05 (+38) > 0,1 > 0,1 > 0,1
Такой разнонаправленный ответ сопряженных ферментов объясним, если учесть, что, с одной стороны, антиоксидантные ферменты сами способны претерпевать окислительную модификацию под действием АФК, а с другой - повышение уровня гидропероксида при ГБО может приводить к активации каталазы, которая функционирует при высоких концентрациях Н2О2 [15]. Об этом свидетельствует также динамика активности ГПО, активность которой снижена на 15 %. Известно, что ГПО, как и каталаза, способна утилизировать H2O2, но у ГПО сродство к гидропероксиду выше, однако она более чувствительна к действию повышенных доз гид-ропероксида и быстрее инактивируется [1]. Сеанс ГБО нарушает не только сопряженность в работе антиокси-дантных ферментов, но и формирует условия для снижения на 12 % концентрации восстановленного глута-тиона, хотя активность ГР выше нормы на 30 %. Восстановленный глутатион - один из важнейших антиок-сидантов эритроцитов. Кроме тех функций, которые он выполняет в остальных клетках, в эритроцитах он служит для предотвращения окисления гемоглобина перекисью водорода в метгемоглобин [14].
Как показало проведенное исследование, предварительное введение животным SkQ1 в значительной степени ингибирует липопереокисление в крови при гипероксии, нормализуя уровень большинства продуктов ПОЛ, за исключением уровня МДА в эритроцитах, который опускается на 27 % ниже нормы.
Полученные результаты свидетельствуют, что ин-гибирующее влияние SkQ1 на свободнорадикальное окисление в крови в условиях ГБО может быть связано со стимуляцией компонентов антиоксидантной системы плазмы и эритроцитов. В группе животных, получавших препарат, в условиях ГБО наблюдаются умеренная активация СОД, каталазы и нормализация активности ГПО, ГР и уровня глутатиона в эритроцитах. Это способствует значительному восстановлению сопряженности действия компонентов антиоксидант-ной ферментной системы эритроцитов.
Возникает вопрос: с чем может быть связан выраженный протекторный эффект катионного производного пластохинона? По химической природе пластохинон относится к хинонным антиоксидантам, в состав которых входит ароматическое кольцо, связанное с несколькими гидроксильными группами. Вследствие наличия в структуре ароматического кольца обобщенной системы п-электронов от гидроксильных групп облегчается отрыв атома водорода. Такие антиокси-данты являются ловушками свободных радикалов, перехватывая неспаренный электрон и восстанавливая радикалы за счет своих подвижных протонов.
Химическая природа SkQ1 придает ему также свойства индукторов ARE-зависимых генов (antioxidant responsive element) - электрофильность, орто-или параположение OH-групп и способность модифицировать SH-группы. ARE-контролируемая экспрессия наблюдается для таких ферментативных ан-тиоксидантов, как СОД1, СОД3, ГПО2, ГР, различных тио- и пероксиредоксинов, а также индуцибельной NOS [1]. Для хинонов также показана способность эффективно восстанавливать радикалы токоферола в мембранах, поддерживая его определенную стационарную концентрацию, поскольку радикальные формы хинонов легко подвергаются ферментативному восстановлению [2].
Таким образом, на уровне целого организма предварительное введение животным SkQ1 в чрезвычайно низких концентрациях продемонстрировало выраженный защитный эффект митохондриально-адресо-ванного антиоксиданта в условиях ГБО-индуци-рованного окислительного стресса. Для эритроцитов, не имеющих ни ядра, ни митохондрий, путь индукции ARE-регулируемых генов, а также блокирование утечки электронов из дыхательной цепи невозможны, однако вполне вероятны как прямое антиоксидантное действие хинонной структуры SkQ1, так и его способность к поддержанию в восстановленном состоянии пула токоферола.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и образования РФ (грант «Развитие научного потенциала высшей школы (20092012 гг.)» № 2.1.1/5663).
Литература
1. Меньщикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К., Бондарь И.А., Круговых Н.Ф., Труфакин В.А. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. М., 2006. 553 с.
2. Андреев А.Ю., Кушнарева Ю.Е., Старков А.А. Метаболизм активных форм кислорода в митохондриях // Биохимия. 2005. Т. 70, вып. 2. С. 246 - 264.
3. Skulachev V.P. Aging and the programmed death phenomena // Topics in Current Cenetics Model systems in ageing / eds. Nystrom T., Osiewacz H.D. Berlin; Heidelberg, 2003. Vol. 3. P. 191 - 238.
4. Skulachev V.P. The programmed death phenomena, aging, and the Samurai law of biology // Exp. Gerontol. 2001. Vol. 36, № 7. P. 995 - 1024.
5. Скулачев В.П. Попытка биохимиков атаковать проблему старения: «Мегапроект» по проникающим ионам. Первые итоги и перспективы // Биохимия. 2007. Т. 72, № 12. С. 1572 - 1586.
6. Стальная И.Ф. Современные методы в биохимии. М., 1977. С. 221 - 223.
7. Стальная И.Ф., Гаришвили Т.Г. Современные методы в биохимии. М., 1977. С. 63 - 64.
Поступила в редакцию
8. Bidlack W.R., TappelA.T. Fluorescent products of phospholipids during lipid peroxidation // Lipids. 1973. Vol. 8, № 4. P. 203 - 209.
9. Сирота Т.В. Новый подход в исследовании процесса аутоокисления адреналина и использования его для измерения активности супероксиддисмутазы // Вопр. мед. химии. 1999. № 3. С. 14 - 15.
10. Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г., Токарев В.Е. Метод определения активности каталазы // Лаб. дело. 1988. № 1. С. 16 - 19.
11. Моин В.М. Простой и специфический метод определения активности глутатионпероксидазы в эритроцитах // Лаб. дело. 1986. № 12. С. 724 - 727.
12. Юсупова Л.Б. О повышении точности определения активности глутатионредуктазы эритроцитов // Лаб. дело. 1989. № 4. С. 19 - 21.
13. Ellman Q.L. Tissue sulfhydryl groups // Arch. Biochem. 1959. Vol. 82. P. 70 - 77.
14. Лукаш А.И., Внуков В.В., Ананян А.А., Милютина Н.П., Кваша П.Н. Металлсодержащие соединения плазмы крови при гипербарической оксигенации (экспериментальные и клинические аспекты). Ростов н/Д, 1996. 108 с.
15. Scott M.D., Lubin B.H., Zuo L., Kuypers F.A. Erythrocyte defense against hydrogen peroxide: preeminent importance of catalase // The J. of Laboratory and Clinical Medicine. 1991. Vol. 118, № 1. P. 7 - 16.
15 июня 2012 г.
