CC BY
153
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ УДК 577.352.38:577.19:616-092.9
В.В. Внуков, А.О. Даниленко, А.А. Ананян, Н.П. Милютина, О.И. Гуценко
РЕГУЛЯЦИЯ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ В МИТОХОНДРИЯХ ПЕЧЕНИ КРЫС МИТОХОНДРИАЛЬНО-НАПРАВЛЕННЫМ АНТИОКСИДАНТОМ SKQ1 ПРИ ГБО-ИНДУЦИРОВАННОМ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ
ФГАОУ ВПО «Южный федеральный университет», факультет биологических наук,
кафедра биохимии и микробиологии
Цель: исследовано регуляторное влияние митохондриально-направленного антиоксиданта SkQ1 на интенсивность свободнорадикального окисления в митохондриях печени крыс при ГБО-индуцированном окислительном стрессе.
Материалы и методы: в митохондриях гепатоцитов исследована интенсивность перекисного окисления и состояние ферментативного антиоксидантного звена.
Результаты: установлено ингибирование перекисного окисления мембранных липидов митохондрий и нормализация активности антиоксидантных ферментов при гипероксии под действием SkQ1. При нормок-сии SkQ1 ингибирует накопление малонового диальдегида и активирует некоторые ферментативные анти-оксиданты (СОД, каталаза, глутатионредуктаза).
Заключение: предварительное введение SkQ1 в дозе 50 нмоль/кг в течение 5 дней оказывает защитный эффект в митохондриях печени в условиях окислительного стресса, индуцированного гипербарооксигена-цией.
Ключевые слова: гипербарооксигенация, печень, митохондрии, перекисное окисление липидов, анти-оксиданты.
V.V.Vnukov, A.O.Danilenko, A.A. Ananyan, N.P. Milutina, O.I. Gutsenko
REGULATION OF FREE RADICAL OXIDATION IN RAT LIVER MITOCHONDRIA BY MITOCHONDRIA-TARGETED ANTIOXIDANT SKQ1 UNDER HBO-INDUCED OXIDATIVE STRESS CONDITIONS
Southern Federal University, the Faculty of Biological Science, the Departament of Biochemistry and Microbiology
Purpose: The regulatory effect of mitochondria-targeted antioxidant SkQ1 on the free radical oxidation intensity in rat liver mitochondria under HBO-induced oxidative stress was investigated.
Materials and methods: Lipid peroxidation intensity and antioxidant enzymes status of rat liver mitochondria were studied.
Results: Inhibition mitochondria membrane lipid peroxidation and the normalization of antioxidant enzymes activity under hyperoxia during the action of SkQ1 were found. SkQ1 inhibits the malone dialdehyde accumulation and activates some enzymatic antioxidants (superoxide dismutase, catalase, glutathione reductase) under normal conditions.
Summary: the preliminary administration of SkQ1 at a dose 50 nmol/kg during 5 days has an protective effect in liver mitochondria under the oxidative stress conditions induced by hyperbaric oxygenation
Key words: hyperbaric oxygenation, liver, mitochondria, lipoperoxidation, antioxidants.
Журнал фундаментальной медицины и биологии
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Журнал фундаментальной медицины и биологии Введение др.),
Митохондриям принадлежит ведущая роль в координации важнейших клеточных функций, поскольку они служат не только поставщиком энергии в виде АТФ, но и участвуют во внутриклеточной сигнализации, генерируют вторичные мессенджеры, играют важную роль в реализации программ клеточной гибели. Митохондриальная цепь электронного транспорта является мощным источником активных форм кислорода (АФК), уровень которых может резко возрастать при действии различных повреждающих факторов (гипероксии, гипоксии, токсикантов, патогенов). Это делает митохондрии одной из наиболее перспективных мишеней для коррекции состояния, сопровождающегося избыточным образованием АФК, которое наблюдается при окислительном стрессе. В условиях окислительного стресса собственные антиок-сидантные системы организма, как правило, находятся в состоянии напряжения и дисбаланса и не обеспечивают адекватный ответ клеток на гиперпродукцию активированных кислородных метаболитов. Для коррекции этого состояния применяют фармакологические агенты, проявляющие антиок-сидантные свойства.
10-(6'-пластохинонил)децилтрифенилфосфоний (SkQ1) представляет собой митохондриально-адре-сованное соединение, состоящее из пластохинона (высокоэффективного переносчика электронов и антиоксиданта хлоропластов), конъюгированного с гидрофобным проникающим катионом трифе-нилфосфония. В клетке отрицательный электрический потенциал обнаруживается только внутри митохондрий, что обеспечивает движущую силу для митохондриально-направленной доставки молекул, соединенных с гидрофобными проникающими катионами. Показано, что молекулы SkQ1 специфически накапливаются во внутренней ми-тохондриальной мембране [1]. Особым свойством SkQ1 является его способность восстанавливаться дыхательной цепью митохондрий, то есть он является возобновляемым антиоксидантом, что позволяет использовать его в наномолярных количествах. Идея конструкции вещества принадлежит академику В.П. Скулачеву [1].
В нашей работе антиоксидантное действие SkQ1 было изучено на модели окислительного стресса, вызванного воздействием на животных гипербаро-оксигенации (ГБО). Многолетние фундаментальные и прикладные исследования кафедры биохимии и микробиологии Южного федерального университета в области изучения молекулярных механизмов гипероксии и гипербарии [2] послужили обоснованием того, что ГБО является адекватной моделью окислительного стресса.
В патологических синдромах поражения печени важнейшее место отводится окислительному стрессу, который характеризуется множественным повреждающим действием и в итоге может привести к апоптозу или некрозу гепатоцитов [3]. Учитывая многообразие и уникальность функций, выполняемых гепатоцитами (биосинтетическая, биотранс-формирующая, энергетическая, регуляторная и
особый интерес представляет исследование нарушений свободно-радикального гомеостаза в митохондриях гепатоцитов в условиях окислительного стресса, что может составить основу для разработки эффективных способов коррекции дисбаланса системы прооксиданты—антиоксиданты.
В связи с вышеизложенным, цель настоящей работы - исследование регуляторного влияния катионного производного пластохинона — SkQ1 - на интенсивность свободно-радикального окисления в митохондриях печени крыс при ГБО-индуцированном окислительном стрессе.
Материалы и методы
Эксперименты проводили на беспородных белых крысах самцах Rattus norvegicus массой 180200 г. Все подопытные животные были разделены на 4 группы по 22-26 крыс в каждой: 1 группа — контроль — интактные животные, содержащиеся в стандартных условиях вивария; 2 группа — крысы, подвергнутые действию гипербароксигенации в режиме 0,5 МПа в течение 90 минут. 3 группа — крысы, которым в течение 5 дней вводили SkQ1 в дозе 50 нмоль/кг. Препарат вводили в рассчитанной дозе, растворенной в 0,2% растворе этанола, в защечные мешки животных. 4 группа — крысы, которым в течение 5 дней вводили препарат SkQ1, а затем через 1 час после последнего введения подвергали действию ГБО (0,5 МПА, 90 мин).
Для формирования состояния окислительного стресса подопытные животные помещались в барокамеру объемом 60 л, снабженную щелочным поглотителем углекислоты. После 3-х минутной вентиляции чистым кислородом в барокамере создавалось давление 0,5 МПа. Компрессию и декомпрессию проводили со скоростью 0,2 МПа/мин. Изопрессия составляла 90 минут. Через каждые 15 мин. барокамеры продували потоком кислорода в течение 2-х минут.
Митохондрии выделяли ступенчатым центрифугированием в градиенте плотности сахарозы [4]. Активность маркерного фермента митохондрий — сукцинатдегидрогеназы — определяли по способности биологического материала к восстановлению феррицианида калия.
Интенсивность перекисного окисления липи-дов определяли по накоплению его молекулярных продуктов: диеновых конъюгатов (ДК) [5], малонового диальдегида (МДА) [6] и шиффовых оснований (ШО) [7]. Состояние ферментативного антиоксидантного звена оценивали по активности супероксиддисмутазы (СОД), каталазы, глутати-онпероксидазы (ГПО), глутатионредуктазы (ГР) и глутатион^-трансферазы (^Т). Активность СОД оценивали по ингибированию восстановления нитросинего тетразолия (НТС) супероксидом, генерируемым при аутоокислении адреналина [8]. Активность каталазы определяли по реакции перекиси водорода с молибдатом аммония [9]. Активность глутатионпероксидазы (ГПО) определяли по скорости окисления восстановленного глутатиона в присутствии гидроперекиси третичного бутила [10]. Определение активности глутатион^-трансферазы (^Т) основано на оценке скорости реакции ферментативного образования GS-2,4-динитробензола в
Журнал фундаментальной медицины и биологии
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
реакции восстановленного глутатиона с 1-хлор-2,4-динитробензолом (ХДНБ) [10]. Содержание восстановленного глутатиона (GSH) оценивали по цветной реакция с 5,5-дитиобис(2-нитробензойной) кислотой (ДТНБК, реагент Эллмана) с образованием соединения, которое обладает максимумом поглощения при 412нм [10].
Для определения активности ферментов и содержания субстратов митохондрии лизировали при помощи детергента Тритон Х-100 (конечная концентрация в пробе 0,1%). Концентрацию белка в митохондриях определяли методом Лоури. Содержание липидов в хлороформном экстракте определяли по реакции с фосфорнованилиновым реактивом с помощью коммерческого набора производства «Lachema».
Статистическую обработку данных проводили с помощью MS Excel 2007 и Statistica 6.0. Для каждой серии рассчитывали средние арифметические значения показателей и их стандартные ошибки (М±т). Анализ выпадающих значений проводили с использованием критерия Шовене. Для оценки
статистически значимых различий между сравниваемыми группами использовали ^критерий Стью-дента. При р<0,05 различия считали статистически значимыми, при 0,1<р<0,05 предполагали тенденцию к статистической значимости различий.
Результаты и обсуждение
Проведенное исследование показало, что при действии ГБО (0,5 МПа, 90 мин.) наблюдается интенсификация перекисного окисления липидов (ПОЛ) в митохондриях печени, что находит свое отражение в увеличении на 19-47% содержания молекулярных продуктов пероксидации (таблица 1). При этом в наибольшей степени возрастает содержание промежуточных продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (малонового диальдеги-да), обладающих относительно большим периодом полураспада (по сравнению с АФК) и способных покидать пределы клеток, выполняя функцию дистантных медиаторов окислительного стресса.
Таблица 1.
Влияние катионного производного пластохинона на интенсивность ПОЛ в митохондриях печени
крыс при ГБО-индуцированном окислительном стрессе. М + т, п = 22-26
Условия эксперимента ДК нмоль/мг липида МДА нмоль/мг белка ШО отн.ед.фл./мг липида
Контроль 5,64 ±0,25 31,68±3,69 0,54 ± 0,04
ГБО (0,5 МПа, 90 мин) 6,73 ±0,31 < 0,05 +19 46,62±5,40 < 0,05 +47 0,66 ± 0,03 < 0,05 +23
SkQ1 (50 нмоль/кг) р д% 5,10 ±0,37 > 0,1 21,09±1,11 < 0,05 -33 0,55 ± 0,03 > 0,1
SkQ1 (50 нмоль/кг) + ГБО (0,5 МПа, 90 мин) р д% р1 Д1% 5,60 ±0,19 > 0,1 < 0,01 -17 24,00±1,23 <0,05 -24 < 0,01 -49 0,56 ± 0,02 > 0,1 < 0,05 -15
Примечание к таблицам 1-2:
р- достоверные различия по сравнению с контролем; р1 - достоверные различия относительно группы ГБО;
А% - процент изменений, цифрами показаны статистически достоверные различия, прочерк - различия недостоверны.
Повышение интенсивности ПОЛ в митохондриях печени в условиях ГБО-индуцированного окислительного стресса согласуется с нарушением функционального состояния антиоксидантной системы в этих органеллах (таблица 2). Установлено снижение на 21% активности СОД, тогда как активность ферментов, утилизирующих продукт дис-мутации супероксидных анион-радикалов — перекись водорода, — претерпевает разнонаправленную динамику. Так, активность каталазы увеличивается на 21%, а активность ГПО снижается на 15%. Вероятно это связано с накоплением в митохондри-
ях гепатоцитов цитотоксических уровней Н202 и других АФК, в большей степени повреждающих ГПО, которая помимо селеноцистеина в активном центре содержит реактивные цистеины в структурных доменах фермента, высоко чувствительные к окислительной модификации. Не исключено также ингибирующее влияние молекулярных продуктов ПОЛ, нарушающих структуру мембран клеток и способных к взаимодействию с белковыми молекулами в качестве поперечносшивающих агентов. К важнейшим причинам снижения активности ГПО в митохондриях печени в условиях ГБО следует от-
Журнал фундаментальной медицины и биологии
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
нести снижение уровня глутатиона, являющегося важнейшим косубстратом фермента. В результате снижается активность изоформ ГПО — ГПО-1 и ГПО-4, являющимися наряду с Мп-СОД важнейшими ферментативными антиоксидантами в
митохондриях, где они эффективно ингибируют накопление гидроперекисей, что снижает выход цитохрома с и других проапоптотических белков в цитоплазму и предотвращает развитие программируемой клеточной гибели [11].
Таблица 2.
Влияние катионного производного пластохинона на активность антиоксидантных ферментов
и содержание глутатиона в митохондриях печени крыс при ГБО-индуцированном окислительном
стрессе. M + m, п = 22-26
Условия эксперимента СОД усл.ед./мг белка Каталаза нмоль/мг белка Глутатион-пероксидаза ГПО мкмоль/г белка Глутатион^-трансфераза ^Т мкмоль/ г белка Глутатион-редуктаза ГР мкмоль/ г белка Восстановленный глу-татион GSH мкмоль/ г белка
Контроль 8,07+0,51 13,77+0,86 773,0+45,6 143,0+8,1 5,13+0,34 3,59+0,24
ГБО (0,5 МПа, 90 мин) 6,40+0,39 16,71+2,59 658,7+30,8 188,4+12,3 3,64+0,34 2,46+0,21
р д% <0,05 -21 <0,05 +21 0,05<р<0,1 -15 < 0,01 +32 < 0,01 -29 < 0,002 -32
SkQ1 (50нмоль/ кг) р д% 9,66+0,51 <0,01 +20 16,11+0,57 < 0,01 +17 691,8+73,4 > 0,1 125,5+7,37 >0,1 6,26+0,37 < 0,05 +22 3,50+0,32 > 0,1
ГБО (0,5 МПа, 90 мин) + SkQ1 (50нмоль/кг) р д% р1 д% 10,15+0,52 <0,05 +26 < 0,001 +58 17,44+0,46 <0,001 +27 > 0,1 760,7+53,1 >0,1 >0,1 166,1+7,6 <0,05 +16 > 0,1 4,92+0,27 > 0,1 < 0,01 +35 3,34+0,21 > 0,1 >0,1
Накопление продуктов липопереокисления — субстратов глутатион^-трансферазы — сопряжено с ее активацией на 32%. При этом характерно, что наблюдается снижение содержания восстановленного глутатиона, который не только выполняет роль антиоксиданта-ловушки свободных радикалов, но и является косубстртатом ^Т. ^Т осуществляет защиту клеток от ксенобиотиков и продуктов ПОЛ посредством их восстановления, глутатионилирования или нуклеофильного замещения [11]. ^Т способна восстанавливать гидроперекиси липидов до соответствующих спиртов, проявляя активность неселеновой ГПО. ^Т катализируют конъюгацию глутатиона с наиболее цитотоксичными продуктами перекисного окисления липидов — 4-гидрокси-2-ноненалем (4-ГН) и другими алкеналями. Накопление глутатионовых конъюгатов 4-ГН ингибирует глутатионредуктазу и транспорт GSSG из клетки, что в определенной мере согласуется с полученными нами результатами. Как антиоксидант, глутатион занимает центральное место в антирадикальной и антиперекис-ной защите клетки. GSH эффективно нейтрализует активированные кислородные метаболиты (напри-
мер, Н202, гидроксильные, липидные радикалы, гидроперекиси липидов, пероксинитрит и др.) непосредственно и опосредованно путем ферментативных реакций. Падение уровня восстановленного глутатиона в митохондриях печени в условиях ГБО-индуцированного окислительного стресса, в свою очередь, происходит на фоне ингибирования глутатионредуктазы, что имеет негативные последствия для митохондрий. В этих органеллах пул GSH пополняется за счет восстановления окисленного GSH глутатионредуктазой или благодаря работе белков-переносчиков за счет цитозольного GSН. Считается, что пара GSH/GSSG обуславливает окислительно-восстановительное равновесие, а важность глутатиона для митохондрий подтверждается высокой удельной концентрацией GSH, которая выше, чем в других органеллах и в клетке в целом. Ингибирование ГР совместно с нарушением структурно-функционального состояния митохондриальных мембран в результате усиления процессов липопереокисления при ГБО изменяет редокс-статус митохондрий, в результате чего становится возможным окисление сульфгидрильных групп вицинальных белков гигантской поры мито-
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Журнал фундаментальной медицины и биологии
хондрий, ее открытие, выход проапоптотических факторов из межмембранного пространства в ци-тозоль и запуск программы клеточной гибели.
Следует также подчеркнуть, что накопление в мембранах гидрофильных первичных продуктов ПОЛ может приводить к нарушению ионной проницаемость митохондриальных мембран. Митохондрии наряду с эндоплазматическим ретику-лумом считаются депо кальция в клетке. Нерегулируемый выход этого катиона в цитозоль может активировать ферменты, участвующие в развитии окислительного стресса и клеточной гибели прежде открытия гигантской митохондриальной поры.
В условиях физиологической нормы введение крысам исследуемого препарата -катионного производного пластохинона (SkQ1) - оказывает влияние на состояние свободнорадикальных процессов в митохондриях гепатоцитов крыс. Наблюдается снижение содержания малонового диальдегида, в то время как уровень первичных и конечных продуктов ПОЛ не претерпевает изменений (таблица 1). Возможно, изменение содержания только промежуточных продуктов ПОЛ типа МДА в данных условиях связано с его способностью покидать пределы мембран. Если первичные и конечные продукты ПОЛ обнаруживаются в липидной фазе в пределах мембран и подвергаются действию преимущественно мембраносвязанных ферментов-ан-тиоксидантов и липофильных низкомолекулярных антиоксидантов, то МДА может подвергаться действию и тех антиоксидантов, которые содержатся в цитозоле, матриксе и межмембранном пространстве митохондрий.
При введении катионного производного пла-стохинона SkQ1 интактным животным в митохондриях печени наблюдается умеренная стимуляция активности (на 17-22%) СОД, каталазы и глута-тионредуктазы. При этом активность ГПО, ^Т и уровень восстановленного GSH изменяются незначительно по сравнению с контролем (таблица 2).
В условиях ГБО-индуцированного окислительного стресса проявляется регуляторное действие SkQ1, направленное на восстановление баланса в системе прооксиданты—антиоксиданты. В митохондриях печени животных, предварительно получавших SkQ1 на протяжении 5 суток перед воздействием ГБО, содержание промежуточных продуктов ПОЛ типа МДА снижается на 24% ниже контроля, тогда как концентрация первичных и конечных продуктов ПОЛ остается в пределах нормы. В то же время в митохондриях печени животных в условиях окислительного стресса, вызванного ГБО, на фоне предварительного применения SkQ1 наблюдается стимуляция активности на 16-27% большинства изученных антиоксидант-ных ферментов — СОД, каталазы, ^Т, тогда как активность ГПО, глутатионредуктазы и уровень восстановленного глутатиона остаются близкими к контрольным значениям (таблица 2).
Заключение
Гипербарическая оксигенация представляет собой модель острого окислительного стресса,
при котором динамическое равновесие в системе прооксиданты—антиоксиданты нарушается не только вследствие избыточной генерации активных форм кислорода, но и за счет глубокой дисфункции антиоксидантного ферментного каскада. Эти процессы формируют замкнутый «порочный круг» - гиперпродукция АФК вызывает окислительное повреждение макромолекул (в том числе, и ферментов-антиоксидантов), автокаталитически приводящее к усилению их генерации. Особое значение в регуляции свободнорадикальных процессов внутри клетки имеют митохондрии, не только потому, что их электронтранспортная цепь — один из основных центров радикалообразования, но и за счет наличия мощной антиоксидантной системы. При ГБО-индуцированном стрессе накапливающиеся дефекты макромолекул, связанные с их окислительным повреждением, и нарушение проницаемости митохондриальных мембран создают условия, с одной стороны для активации митохондриаль-ного пути клеточной гибели, а с другой стороны, для развития митоптоза (гибели митохондрий) и, в дальнейшем, самоликвидации клеток печени.
Предварительное введение животным SkQ1 в наномолярных концентрациях продемонстрировало его защитный эффект в условиях окислительного стресса. Локализация SkQ1 во внутренней мембране митохондрий позволяет проявлять анти-оксидантные свойства вблизи основных центров радикалообразования. По химической природе пластохинон, входящий в структуру SkQ1, относится к хинонным антиоксидантам. Обобщенная система п-электронов его ароматического кольца облегчает отрыв атома водорода от гидроксиль-ных групп, что позволяет SkQ1 проявлять свойства ловушки свободных радикалов, перехватывая не-спаренный электрон и восстанавливая радикалы за счет своих подвижных протонов.
Согласно полученным нами данным о влиянии введения SkQ1 на антиоксидантную систему и интенсивность свободнорадикального окисления митохондрий печени, протекторные свойства SkQ1 не ограничиваются его способностью улавливать и восстанавливать свободные радикалы, в избытке образующиеся при гипероксии. Химическая природа SkQ1 придает ему свойства индуктора ARE-зависимых генов (ARE - antioxidant responsive element) — электрофильность, орто-поло-жение OH-групп и способность модифицировать SH-группы [11]. ARE-контролируемая экспрессия наблюдается для генов таких ферментативных антиоксидантов как СОД1, СОД3, ГПО2, ГР, различных тио- и пероксиредоксинов, а также ин-дуцибельной NO-синтазы. Активатором генов с ARE-контролируемой экспрессией выступает фактор транскрипции Nrf2. В норме он связан на ядерной мембране со своим ингибитором - белком Keap1, содержащим большое количество остатков цистеина. Окисление SH-групп индуцирует диссоциацию комплекса Nrf2-Keap1, после чего Nrf2 транспортируется в ядро и образует комплексы со вспомогательными белками. Связываясь с соответствующей последовательностью ДНК, обнаруженной в промоторной области ARE-зависимых генов,
Журнал фундаментальной медицины и биологии
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
N^2 активирует их транскрипцию, повышая тем самым уровень экспрессии генов антиоксидантных ферментов [11].
Помимо описанных выше свойств для хинонов также показана способность эффективно восстанавливать радикалы токоферола в мембранах, поддерживая его определенную стационарную концен-
трацию, поскольку радикальные формы хинонов легко подвергаются ферментативному восстановлению [11]. Можно полагать, что соединения класса митохондриально-адресованных антиоксидантов могут быть эффективны при разработке нового поколения препаратов таргетной терапии с гепато-протекторным действием.
ЛИТЕРАТУРА
1. Антоненко Ю.Н., Аветисян А.В., Бакеева Л.Е. и др. Производное пластохинона, адресованное в митохондрии, как средство, прерывающее программу старения. I. Катионные производные пластохинона: синтез и исследование in vitro. Биохимия. 2008; 73 (12):1589-1606.
2. Лукаш А.И., Внуков В.В., Ананян А.А. и др. Металлосодержа-щие соединения плазмы крови при гипербарической оксиге-нации (Экспериментальные и клинические аспекты) Ростов-на-Дону, 1996:108 с.
3. Ипатова О.М. Фосфоглив: механизм действия и применение в клинической практике. М., 2005: 318 с.
4. Северин С.Е., Соловьева Г.А. (под ред.) Практикум по биохимии. МГУ, 1989: 403-414.
5. Стальная И.Д. Метод определения диеновой конъюгации ненасыщенных жирных кислот. Современные методы в биохимии. М.: Медицина, 1977: 63-64.
6. Стальная И.Ф., Гаришвили Т.Г. Метод определения малоно-
вого диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты. Современные методы в биохимии. М.: Медицина,1977: 63-64.
7. Bidlack W.R. Tappel A.T. Fluorescent products of phospholipids during lipid peroxidation. Lipids. 1973; 8 (4): 203 - 209.
8. Сирота Т. В. Новый подход в исследовании процесса ауто-окисления адреналина и использования его для измерения активности супероксиддисмутазы. Вопр. мед. химии. 1999; № 3: 14 - 15.
9. 9. Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г., Токарев В.Е. Метод определения активности каталазы. Лабор. дело. 1988; №1: 16-19.
10. 10.Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е., Зыбина И.М. Методы оценки свободнорадикальных процессов в организме. СПб.: Фолиант, 2000: 103 с.
11. 11.Меньщикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К. и др. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. М.: «Слово», 2006: 556 с.
